史純珍+毛旭+韓茜+樊沖+金萌

摘 要 建立了基于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GCMS）分析大氣細(xì)顆粒物（PM2.5）滴注對(duì)小鼠肺組織代謝輪廓的影響的研究方法。通過(guò)分析肺組織細(xì)胞內(nèi)代謝物的變化，研究不同濃度PM2.5對(duì)小鼠肺組織代謝的毒性機(jī)制。鼻腔分別滴注0、7.5、20.0和37.5 g/L的PM2.5懸液，提取肺組織胞內(nèi)物質(zhì)，預(yù)處理后進(jìn)行GCMS分析，結(jié)合主成分分析法（PCA）、偏最小二乘判別分析法（PLSDA）進(jìn)行數(shù)據(jù)解析，通過(guò)PLSDA得分圖可將不同PM2.5染毒濃度下的肺組織胞內(nèi)物質(zhì)明顯區(qū)分。運(yùn)用PLSDA載荷圖及模型的變量重要性因子（VIP）值，發(fā)現(xiàn)了7種代謝物可作為區(qū)別不同濃度PM2.5下代謝組的潛在生物標(biāo)志物，分別為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、鳥(niǎo)氨酸、延胡索酸、檸檬酸、嘌呤（p<0.01）。代謝途徑分析結(jié)果表明，PM2.5滴注使小鼠肺組織受到氧化損傷，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，抑制了三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）及嘌呤代謝。本研究為深入解析PM2.5致毒機(jī)理提供了新的方法及理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 大氣細(xì)顆粒物； 代謝輪廓； 主成分分析； 毒性機(jī)理

1 引 言

大氣細(xì)顆粒物（PM2.5）是指空氣動(dòng)力學(xué)直徑小于2.5 μm的顆粒物，含有有機(jī)/無(wú)機(jī)碳（OC/EC）、硫酸鹽、硝酸鹽、重金屬和多環(huán)芳烴（PAHs）等多種有害物質(zhì)[1，2]。PM2.5顆粒隨呼吸進(jìn)入人體肺泡后，可破壞肺泡組織，導(dǎo)致矽肺病，其攜帶的重金屬、PAHs等可進(jìn)入血液系統(tǒng)，危害人體健康[3]。在中國(guó)城市環(huán)境中，PM2.5中的PAHs及其衍生物是導(dǎo)致人體患肺癌的主要原因[4]。目前，研究PM2.5的健康效應(yīng)主要采用流行病學(xué)及毒理學(xué)研究方法。流行病學(xué)研究證實(shí)，PM2.5的污染程度會(huì)影響人群的發(fā)病率和死亡率，大氣中PM2.5濃度每升高10 μg/m3，人群呼吸系統(tǒng)疾病的死亡率從2.1%升高到3.75%[5]。PM2.5可在肺部沉積，導(dǎo)致慢性阻塞性肺疾?。–hronic obstructive pulmonary diseases， COPD）或肺癌[6]。目前，定量分析PM2.5劑量效應(yīng)關(guān)系的研究都是基于環(huán)境流行病學(xué)研究數(shù)據(jù)，而毒理學(xué)研究結(jié)果可為流行病學(xué)研究所發(fā)現(xiàn)的顆粒物健康效應(yīng)提供機(jī)理解釋[7]。PM2.5的成分復(fù)雜，并隨著時(shí)空變換而不斷變化，其損傷程度和機(jī)制也會(huì)相應(yīng)改變，這類(lèi)研究是當(dāng)今PM2.5研究中的熱點(diǎn)。

代謝組學(xué)是研究健康效應(yīng)的有力工具，其揭示的小分子代謝產(chǎn)物變化是機(jī)體內(nèi)基因、蛋白質(zhì)、酶等功能變化的一系列事件的最終結(jié)果，直接反映了生物體系的最終狀態(tài)，可反映機(jī)體特定病理生理狀態(tài)下整體代謝物質(zhì)的變化，為疾病診斷、揭示致病機(jī)理提供新的研究思路[8，9]。Belén等[10]采用直接輸注電噴霧電離四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（DIESIQTOFMS）和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GCMS）檢測(cè)肺癌（LC）組和對(duì)照組的支氣管肺泡灌洗液（BALF）代謝物差異，采用偏最小二乘法（PLSDA）分析和篩選生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)肺癌導(dǎo)致谷氨酸鹽和谷氨酰胺代謝途徑的變化，并評(píng)估及驗(yàn)證了其潛在的生物標(biāo)志物。Izabella等[11]對(duì)在空氣污染中暴露的人肺灌洗液進(jìn)行多平臺(tái)代謝組學(xué)研究，結(jié)果表明，結(jié)合GCMS、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LCMS）、核磁共振（NMR）可檢測(cè)出支氣管液（BW）和支氣管肺泡灌洗液中的82種代謝物，其中46種代謝物顯示出由于生物柴油暴露導(dǎo)致的代謝差異。

王曉飛等[12]利用LCMS的代謝組學(xué)技術(shù)，分析了經(jīng)PM2.5懸液氣管滴注暴露后成年雄性大鼠睪丸代謝組的全局變化，采用偏最小二乘判別分析（PLSDA）和非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，最終鑒定了56種差異代謝物，并發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露會(huì)引起大鼠睪丸的氨基酸和核苷酸代謝紊亂、脂類(lèi)代謝異常和類(lèi)固醇激素代謝失衡。但該研究未對(duì)大鼠肺臟進(jìn)行PM2.5毒理研究。Wang等[13]利用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLCMS）對(duì)成年大鼠以1 mg/kg/周的劑量進(jìn)行PM2.5懸液滴注，連續(xù)滴注3月后解析肺組織代謝物，發(fā)現(xiàn)31種代謝物含量升高、19種代謝物含量降低，通過(guò)代謝途徑分析推測(cè)PM2.5可干擾助氧化抗氧化平衡，并與磷脂、甘油磷酸、鞘脂和嘌呤的變化密切相關(guān)。但該研究主要針對(duì)單一濃度下的PM2.5對(duì)大鼠肺組織的健康效應(yīng)，并未研究PM2.5濃度變化對(duì)其影響。本研究通過(guò)采集PM2.5樣品，并配制成不同濃度懸浮液（7.5、20.0和37.5 g/L），對(duì)小鼠進(jìn)行鼻腔滴注，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的代謝物進(jìn)行主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLSDA），研究其對(duì)小鼠肺組織的濃度效應(yīng)關(guān)系，尋找不同濃度PM2.5影響肺組織代謝的潛在生物標(biāo)志物，及其對(duì)相關(guān)代謝的影響。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

TH150C型智能中流量空氣總懸浮微粒采樣器（武漢市天虹儀表公司）； Trace130型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）； QL861 型旋鍋混合器（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）； TB215D型（十萬(wàn)分之一）電子天平（美國(guó)DENVER公司）； 114 型低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）； SANYO MDF382型超低溫冰箱（日本SANYO公司）。

乙醚、氯化鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 乙腈（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）； 分析純甲氧基胺、吡啶、甲基三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺（MSTFA）、二十二烷、庚烷，均購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。清潔級(jí)雄性KM小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，5周齡，體重38～42 g （動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）20160011）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境：SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，控制室內(nèi)溫度18～22℃，相對(duì)濕度40%～50%，小鼠給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水，于室內(nèi)保持12 h光照、12 h避光循環(huán)飼養(yǎng)。

2.2 PM2.5采集與制備

2.2.1 PM2.5采集 本研究采用TH150C型智能中流量空氣總懸浮微粒采樣器與PM2.5切割器配合采樣，采樣濾膜為潔凈的玻璃纖維濾膜。樣品采自北京工商大學(xué)東校區(qū)（北京市海淀區(qū)阜成路11號(hào)），連續(xù)采樣15 d，每天采樣時(shí)間24 h。

2.2.2 采樣濾膜處理及PM2.5懸液制備 采樣后的濾膜，將有塵面兩次對(duì)折剪成小塊，用超純水低溫超聲處理3次，每次20 min，6層紗布過(guò)濾去掉濾膜，濾液冷凍真空干燥，待其水分完全蒸發(fā)，可得到灰色絮狀物，稱(chēng)重，低溫保存，備用。測(cè)定時(shí)用生理鹽水分別配制成7.5、20.0和37.5 g/L懸浮液，4℃保存，測(cè)定前超聲振蕩使懸液混勻后進(jìn)行測(cè)定。

2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

28只雄性ICR小鼠隨機(jī)分成4組（n=7）：對(duì)照組（生理鹽水組）、低劑量組（7.5 g/L）、中劑量組（20 g/L）、高劑量組（37.5 g/L）。采用鼻腔滴入式氣管滴注法，用乙醚將小鼠麻醉，用絲線掛住小鼠上門(mén)齒，使其自然懸掛在自制泡沫架上，用移液槍吸取懸浮液并注入鼻腔中，每天滴注一次，滴注量3 mL/kg（60 μL/只），連續(xù)滴注3天，滴注后立即恢復(fù)自由飲食。于第三次滴注24 h后處死，采集肺組織。

將肺組織剪成小碎片后置于玻璃勻漿管中，加入2倍質(zhì)量的生理鹽水，將玻璃勻漿管插入冰水混合物中，上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨數(shù)十次（6～8 min），充分研碎，使組織勻漿化。將制備好的勻漿于4℃ 3000 r/min離心10 min，收集上清液，80℃保存。

2.4 GCMS分析

GCMS的樣品制備過(guò)程包括去蛋白化、甲氧基化和最終衍生化三個(gè)基本步驟。將肺組織勻漿樣品從80℃冰箱取出后，冰上解凍，移取100 μL樣品于1 mL離心管中，加入300 μL預(yù)冷的乙腈沉淀蛋白，旋渦3 min，氮?dú)獯蹈?，加?0 μL 15 mg/mL甲氧基胺的吡啶溶液，混勻，80℃水浴振蕩反應(yīng)15 min。再加入衍生化試劑MSTFA 50 μL，振蕩30 s，80℃水浴振蕩反應(yīng)15 min； 加入0.1 g/L二十二烷（內(nèi)標(biāo)L）的庚烷溶液150 μL?；靹蚝箅x心，取上清液到微量進(jìn)樣管，供GCMS分析。

氣相色譜條件：TGWAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）； 進(jìn)樣口溫度，250℃； 升溫程序：起始溫度50℃，保持1 min，以5℃/min升溫至300℃，保持5 min； 載氣（He）； 流速1.0 mL/min； 進(jìn)樣量1.0 μL； 分流比20：1。質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源； 電子碰撞能70 eV； 離子源溫度280℃； 傳輸線溫度250℃； 質(zhì)量掃描范圍m/z 50～600。全掃描方式掃描； 溶劑延遲8 min； 調(diào)諧文件為標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧。

2.5 數(shù)據(jù)處理

采用NIST軟件對(duì)總離子色譜圖進(jìn)行質(zhì)譜峰的定性和定量分析，獲得代謝物的相對(duì)含量（與內(nèi)標(biāo)峰的比值）。然后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCAP進(jìn)行PCA、PLSDA； 應(yīng)用SPSS軟件（Version 24.0， IBM）進(jìn)行顯著性分析。通過(guò)得分圖、載荷圖、F檢驗(yàn)和模型的變量重要性因子（Variable importance factor， VIP）考察不同濃度含量差異并試圖揭示其生物學(xué)效應(yīng)。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 精密度與重復(fù)性 圖1為所獲得的GCMS生物體液（肺組織勻漿）分析的總離子流（TIC）圖，其中各種代謝物，如氨基酸、有機(jī)酸、糖類(lèi)、 （GCMS）脂肪酸、固醇等依次從GC色譜柱上洗脫。在分析樣品之前，首先對(duì)分析方法進(jìn)行考察，包括進(jìn)樣精密度、制備重復(fù)性、樣本穩(wěn)定性、線性和檢測(cè)限。分別對(duì)同一制備好的肺勻漿樣本連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算主要共有峰的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），發(fā)現(xiàn)主要共有峰的峰面積RSD<5%。對(duì)同一樣本平行制備6份，計(jì)算主要共有峰的RSD，肺組織勻漿的RSD<10%。

3.1.2 樣品穩(wěn)定性 為保證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，生物樣品采集后需要在80℃低溫保存。然而，在反復(fù)的凍融過(guò)程中，代謝物的組成或濃度可能會(huì)發(fā)生變化。為了考察樣品在反復(fù)凍融后的穩(wěn)定性，將80℃凍存的樣品取出800 μL，室溫下解凍，取出200 μL進(jìn)行樣品制備。將剩余的600 μL樣品繼續(xù)于80℃凍存，第二天使用同樣方法進(jìn)行代謝物提取，并進(jìn)行測(cè)定。以此類(lèi)推，共進(jìn)行4次凍融。計(jì)算共有峰面積的RSD。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共有峰面積的RSD<15%。

3.1.3 代謝物譜分析與物質(zhì)鑒定 代謝物的物質(zhì)鑒定主要基于NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，在數(shù)據(jù)庫(kù)匹配中，匹配度（Match）表示所檢物質(zhì)的質(zhì)譜圖與庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)譜圖的相似程度，而可能性（Probability）表示該物質(zhì)可被認(rèn)為是候選物質(zhì)的幾率。依據(jù)匹配度>900，且可能性>80%，共檢出32種代謝物。

3.2 代謝物相關(guān)性分析

3.2.1 肺組織勻漿代謝物譜數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用PCA和PLSDA法對(duì)樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，圖2為不同PM2.5滴注濃度下的小鼠血清代謝PLSDA得分圖和載荷圖。

由圖2A可見(jiàn)，小鼠肺組織在不同濃度的PM2.5滴注下，代謝輪廓呈現(xiàn)明顯差異，中濃度（20 g/L）和高濃度（37.5 g/L）組有個(gè)別樣品存在重疊，但仍可區(qū)分，且對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組差異明顯。隨著滴注濃度增大，小鼠死亡率升高。說(shuō)明小鼠的耐受性降低，當(dāng)?shù)巫舛葹?7.5 g/L時(shí)，小鼠耐受性接近極值，其代謝輪廓也與低、中濃度組及對(duì)照組差異明顯。

圖2B為小鼠肺組織的PLSDA載荷圖，圖中每個(gè)點(diǎn)代表胞內(nèi)一個(gè)代謝物變量，離原點(diǎn)較遠(yuǎn)的點(diǎn)為潛在的生物標(biāo)志物[14]。圖3為PLSDA的VIP圖，VIP因子可以用來(lái)反映代謝物對(duì)肺組織代謝差異的貢獻(xiàn)。結(jié)合載荷圖、以及第一主成分和第二主成分的VIP值，在0.95的置信區(qū)間內(nèi)，VIP>1的代謝物有：鳥(niǎo)氨酸、延胡索酸、檸檬酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、嘌呤7種代謝物，說(shuō)明當(dāng)?shù)巫⒉煌瑵舛萈M2.5懸液時(shí)，這些代謝物在肺組織代謝通路中受到影響。

3.2.2 肺組織勻漿代謝物含量的改變 使用F檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析法檢查上述備選的潛在生物標(biāo)志物在對(duì)照組和不同PM2.5濃度差異的顯著性，結(jié)果表明，對(duì)這些代謝物分別進(jìn)行spss數(shù)據(jù)分析一般線性模型多變量F檢驗(yàn)， p<0.01，說(shuō)明這些代謝物在不同PM2.5濃度組中差異極其顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。最終確定與PM2.5滴注密切相關(guān)的關(guān)鍵代謝物為鳥(niǎo)氨酸、延胡索酸、檸檬酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、嘌呤。

3.3 代謝物含量變化

由圖4A可知，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、鳥(niǎo)氨酸的相對(duì)濃度均隨PM2.5滴注濃度的增加而減少，可能表示支鏈氨基酸代謝紊亂，肺組織細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，TCA循環(huán)受到抑制。由圖4B可知，延胡索酸濃度下降，延胡索酸是TCA循環(huán)的重要中間體，其濃度下降代表TCA循環(huán)受到抑制[15]。檸檬酸先增加后減少，可能是由于細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）含量的升高破壞了TCA循環(huán)而造成[16]。

隨著PM2.5染毒濃度的升高，氧化應(yīng)激反應(yīng)逐漸增強(qiáng)，嘌呤含量明顯升高（圖4C）。嘌呤的代謝產(chǎn)物為尿酸，由圖4D可見(jiàn)，嘌呤含量逐漸升高，而尿酸含量相應(yīng)減少，因此PM2.5染毒濃度增加使小鼠肺組織的嘌呤代謝受到了抑制。而尿酸是人體的嘌呤核苷降解途徑中的最終酶催化產(chǎn)物[17]。有研究表明，尿酸尿囊素轉(zhuǎn)換是血小板濃縮液中氧化損傷的一項(xiàng)生物標(biāo)志物； 尿酸作為過(guò)量的活性氧ROS的淬滅劑，其含量的提高有利于減少生物損傷[18，19]。而通過(guò)PM2.5滴注的小鼠出現(xiàn)嘌呤含量升高而尿酸減少，因此可推斷其受到了一定程度的氧化損傷。

4 結(jié) 論

本研究利用基于GC/MS的代謝組學(xué)方法研究了不同PM2.5染毒濃度對(duì)小鼠的肺組織代謝譜的變化。多元統(tǒng)計(jì)分析表明，滴注不同濃度PM2.5的小鼠肺代謝譜存在顯著差異。篩選出7種關(guān)鍵代謝產(chǎn)物，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、鳥(niǎo)氨酸、延胡索酸、檸檬酸水平隨滴注濃度增加而降低，嘌呤含量呈增加趨勢(shì)。結(jié)合代謝途徑分析，發(fā)現(xiàn)PM2.5滴注時(shí)小鼠肺組織受到氧化損傷，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，削弱了肺細(xì)胞TCA循環(huán)，嘌呤代謝受到抑制。此研究為深入解析PM2.5致毒機(jī)理提供了新的視角及理論依據(jù)。

References

1 BI TingTing， CHEN ShiJie， ZHAO XiaoHong， ZHOU YanLi， LAO WenYan. Chinese Bull. Life Sci.， 2016， 28（3）： 409-414

畢婷婷， 陳世杰， 趙曉紅， 周艷麗， 勞文艷. 生命科學(xué)， 2016， 28（3）： 409-414

2 HUANG ChuChu， LI Qing， ZHANG GuoXia， WANG Zheng. Chinese J. Anal.Chem.， 2016， 44（7）： 1047-1052

黃楚楚， 李 青， 張國(guó)霞， 汪 正. 分析化學(xué)， 2016， 44（7）： 1047-1052

3 YANG YiJian. J. Toxicol.， 2005， 19（2）： 146-148

楊軼戩. 毒理學(xué)雜志， 2005， 19（2）： 146-148

4 Bai H Z， Zhang H J. J. Environ. Sci. Heal. A ， 2017， 52（4）： 303-312

5 Schwartz J. Am. J. Epidemiol.， 2000， 151（5）： 440

6 PAN Lu， NI Yang， XU JunHui， LI HongYu， DONG Wei， YANG Di， LIU Yue， ZHU Yi， SHAN Jiao， YANG Xuan， CHEN YaHong， GUO XinBiao， DENG FuRong. J. Environ Heal.， 2016， 33（1）： 1-4

潘 璐， 倪 洋， 許珺輝， 李宏宇， 董 偉， 楊 迪， 劉 越， 朱 益， 單 嬌， 楊 玄， 陳亞紅， 郭新彪， 鄧芙蓉. 環(huán)境與健康雜志， 2016， 33（1）： 1-4

7 YOU Yan， BAI ZhiPeng. Asian J. Ecotoxicol.， 2012， 7（2）： 123-132

游 燕， 白志鵬. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)， 2012， 7（2）： 123-132

8 NIU YanJie， JIANG YinLing， XU ChangJiang， WANG XiangYing， LIU YouRu， ZHAO Heng， HAN BaoHui， JIANG LiYan. Chinese J. Lung Cancer， 2012， 15（4）： 195-201

牛艷潔， 江銀玲， 許長(zhǎng)江， 王向迎， 劉友如， 趙 珩， 韓寶惠， 姜麗巖. 中國(guó)肺癌雜志， 2012， 15（4）： 195-201

9 Huang Q， Yin P Y， Wang J， Chen J， Kong H W， Lu X， Xu G W. J Chromatogr. B， 2011， 897： 961-967

10 Belén C L， Tamara G B， Jesús G G， Antonio P V， José Luis G A. J. Proteomics， 2016， 145： 197-206

11 Izabella S， Masoumeh K， Sandra G F， Wu J， Jon U， Jenny A. Bosson， A B， Jamshid P， Thomas S A F， BehndigJ T， Malin L N. Anal. Bioanal. Chem.， 2016， 408： 4751-4764

12 WANG XiaoFei， JIANG ShouFang， ZHANG WeiBing， ZHANG LingYi， LIU Ying， DU XiaoYan， ZHANG Jie， SHEN HeQing. Chinese J. Anal. Chem.， 2017， 45（5）： 633-640

王曉飛， 蔣守芳， 張維冰， 張凌怡， 劉 穎， 杜曉妍， 張 潔， 申河清. 分析化學(xué)， 2017， 45（5）： 633-640

13 Wang X F， Jiang S F， Liu Y， Du X Y， Zhang W B， Zhang J， Shen H Q. Sci. Total Environ.， 2017， 592： 41-50

14 CHEN ShengLan， ZHAO XiaoYan， REN LuJing， JI XiaoJun， HUANG He. Chinese J. Anal. Chem.， 2016， 44（5）： 685-692

陳勝蘭， 趙曉艷， 任路靜， 紀(jì)曉俊， 黃 和. 分析化學(xué)， 2016， 44（5）： 685-692

15 GU JinNing， NIU Jun， PI ZiFeng， YUE Hao， WU SuiSheng， LIU ShuYing. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（3）： 371-376

谷金寧， 牛 俊， 皮子鳳， 越 皓， 吳綏生， 劉淑瑩. 分析化學(xué)， 2013， 41（3）： 371-376

16 WANG GuiMing， SHI DongDong， PENG ZhangXiao， LU YangFang， GU Xue， WANG Yan， YAN Chao. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（5）： 682-688

王桂明， 史棟棟， 彭章曉， 魯陽(yáng)芳， 谷 雪， 王 彥， 閆 超. 分析化學(xué)， 2015， 43（5）： 682-688

17 WANG EnPeng， SUN Yan， YUE Hao， CHEN HuanWen， WANG Yang， CHEN ChangBao， LIU ShuYing. Chinese J. Anal. Chem.， 2016， 44（9）： 1410-1418

王恩鵬， 孫 巖， 越 皓， 陳煥文， 王 洋， 陳長(zhǎng)寶， 劉淑瑩. 分析化學(xué)， 2016， 44（9）： 1410-1418

18 Abonnenc M， Crettaz D， Marvin L， Grund B， Sonego G， Bardyn M， Tissot J D， Prudent M， Rochat B， Lion N. Metabolomics， 2016， 12（12）： 188

19 Alvarez L B， Macarron V J. RheumatoLogy （Oxford）， 2010， 49（11）： 2010-2015