劉宏達(dá) 任靜華 譚顯惠 呂增祿 王淑梅

摘要：目的：研究奧拉西坦連續(xù)多次灌胃給藥對(duì)大鼠CYP3A酶活性的影響。方法：40只SD大鼠隨機(jī)分為2組，實(shí)驗(yàn)組大鼠每天一次奧拉西坦（200mg·kg-1）灌胃，對(duì)照組每天1次蒸餾水灌胃（1.5mL）；連續(xù)5日，于第6日，2組大鼠均單劑量尾靜脈注射咪達(dá)唑侖10mg·kg-1，后由眼底靜脈叢取血，高效液相色譜法測(cè)定血藥濃度，以DAS 2.1.1 藥物動(dòng)力學(xué)程序擬合藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，以SPSS18.0 軟件對(duì)組間各參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：咪達(dá)唑侖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.0752X-0.0042（r=0.9999），線性范圍為0.1-30mg·L-1；；方法回收率高中、低濃度分別為（104.9±4.30）%、（101.6±3.28）%和；（109.8±4.54）%，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)：t1/2、Cmax、AUC0-12h無(wú)顯著性差異。結(jié)論：合用奧拉西坦前后，咪達(dá)唑侖在大鼠體內(nèi)主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)無(wú)明顯變化，提示奧拉西坦對(duì)大鼠體內(nèi)CYP3A4無(wú)影響。

促智藥奧拉西坦（oxiracetam，ORC）具有很好的改善記憶和學(xué)習(xí)功能，臨床常用于理化因素所致腦缺氧、慢性腦功能不全及智能、記憶力障礙等的治療[1]。奧拉西坦對(duì)對(duì)肝微粒體酶影響研究尚少，其代謝途徑尚不清晰。本研究將咪達(dá)唑侖作為探針?biāo)幬颷2]，探討奧拉西坦對(duì)CYP3A 酶活性的影響[3-4]，為與其他臨床藥物聯(lián)合用藥合理性提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：奧拉西坦；咪達(dá)唑侖；CYP3A4；高效液相色譜法；藥動(dòng)學(xué)

1 儀器與材料

1 儀器與材料

1.1 儀器

Diamonsil C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm，美國(guó)Waters公司）；渦旋混合器（XW-80A，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；冷凍離心機(jī)（GL-20G-Ⅱ，上海安亭科學(xué)儀器廠）；高效液相色譜系統(tǒng)。

1.2試驗(yàn)用藥

乙腈（天津市康科德科技有限公司，批號(hào)：111203）。奧拉西坦對(duì)照品（中諾藥業(yè)有限公司-石藥集團(tuán)，純度99.60%，批號(hào)：128101207）；咪達(dá)唑侖對(duì)照品（宜昌人福藥業(yè)責(zé)任有限公司，含量100.8%，批號(hào)MD111106）；咪達(dá)唑侖注射液（規(guī)格5ml：5mg，江蘇恩華藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)20110825）注射用奧拉西坦（規(guī)格1.0g，批號(hào)262120318）石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠，清潔級(jí)，體重（300±10）g，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（晉）2009-0001，由山西省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Diamonsil C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（62：38，V/V）；進(jìn)樣量：20μL，柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：225nm；流速：1.0mL·min-1。

2.2 血漿樣品處理

室溫下自然解凍血漿樣品，以10000r·min-1速度離心5min后取200μL上清液于塞離心管中，加入20μl內(nèi)標(biāo)溶液混勻后（150μg/ml地西泮溶液為內(nèi)標(biāo)液），加提取劑（異丙醇：乙酸乙酯=2：8）500μl，渦旋震蕩1min，10000rpm離心5min，取上清液500μl，37℃水浴下氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)?00μl甲醇復(fù)溶后進(jìn)樣處理。

2.3 方法學(xué)

2.3.1專屬性試驗(yàn)

取咪達(dá)唑侖和內(nèi)標(biāo)地西泮對(duì)照品溶液進(jìn)樣。然后取空白血漿及灌胃后給咪達(dá)唑侖的血漿樣品進(jìn)樣處理、測(cè)定并記錄色譜圖。結(jié)果提示我們?cè)谙鄳?yīng)色譜條件下，咪達(dá)唑侖保留時(shí)間為6.7min。且峰形良好，內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間為8.2min峰形良好，，咪達(dá)唑侖的測(cè)定未受大鼠血漿中內(nèi)源性物質(zhì)干擾。見(jiàn)圖1.

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按“2.1.2”項(xiàng)下方法，將濃度分別為30，20，10，5，1，0.25，0.1，μg /ml的咪達(dá)唑侖模擬血漿樣品，進(jìn)行處理測(cè)定。以測(cè)得的咪達(dá)唑侖峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比（Y）對(duì)血漿藥物濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0752X-0.0042（r=0.9999，n=7），在0.1～30mg·L-1濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。。

2.3.3 回收率

咪達(dá)唑侖及內(nèi)標(biāo)提取回收率：將空白血漿15份，分為3組，每組5份，分別制備20μg/ml、5μg/ml、0.25μg/ml的咪達(dá)唑侖模擬血漿樣品，按照2.2血漿樣品處理進(jìn)行測(cè)定并記錄峰面積值。咪達(dá)唑侖提取回收率計(jì)算為咪達(dá)唑侖峰面積與直接進(jìn)樣的對(duì)照品溶液峰面積比值；內(nèi)標(biāo)提取回收率為地西泮峰面積與直接進(jìn)樣的對(duì)照品溶液峰面積比值。

方法回收率：將空白血漿15份，分為3組，每組5份，分別制備20μg/ml 、5μg/ml、0.25μg/ml的咪達(dá)唑侖模擬血漿樣品，依照上面2.2血漿樣品處理方法測(cè)定后記峰面積數(shù)值。方法回收率為計(jì)算測(cè)得濃度與加入濃度的比值。

2.3.4精密度

取空白血漿15份，分3組，每組5份，依次制備20μg/ml0、 5μg/ml、25μg/ml的咪達(dá)唑侖模擬血漿樣品，同樣依照2.2血漿樣品處理方法處理，并在一天的不同時(shí)間段測(cè)定，計(jì)算日內(nèi)精密度；于0，1，2，3，4日處理并測(cè)定，計(jì)算日間精密度。模擬血漿樣品三種不同濃度的日內(nèi)精密度、日間精密度的RSD值分別為6.38%，3.23%、11.05%、均在規(guī)定范圍內(nèi)，表明該方法精密度良好。

2.3.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

根據(jù)需要，分別考察了樣品室溫放置的穩(wěn)定性，長(zhǎng)期冷凍保存穩(wěn)定和反復(fù)凍融穩(wěn)定性。結(jié)果表明：室溫下陰暗干燥處放置4h，-40℃低溫避光保存10d，反復(fù)凍融3 次，RSD< 6.4%，能夠很好的滿足血清樣品測(cè)定的需要。

2.4藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.4.1溶液的制備

濃度為10mg·L-1咪達(dá)唑侖原液即用。另將奧拉西坦注射液2支，注入50ml量瓶中，用蒸餾水定容，然后制備成為40mg·L-1濃度的奧拉西坦溶液。

2.4.2分組與給藥

40只健康SD大鼠備隨機(jī)分成2組，每組20只，設(shè)為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組每天一次1.5mL蒸餾水灌胃；實(shí)驗(yàn)組每天一次奧拉西坦溶液灌胃（200mg·kg-1），連續(xù)5天達(dá)穩(wěn)態(tài)后，兩組大鼠均以10mg·kg-1的比值尾靜脈注射咪達(dá)唑侖。并分別以給藥后0min，5min，10min，20min，30min，1h，1.5h，2h，4h，6h為時(shí)間點(diǎn)眼內(nèi)眥取血，每次取血0.5mL，置于肝素鈉抗凝的離心管中，以10000r·min-1的速度離心5min，取上層血漿，保存在-40℃冰箱待測(cè)。

2.4.3血樣測(cè)定與數(shù)據(jù)處理

將自然解凍的待測(cè)SD大鼠血漿樣品，按照2.2血漿樣品處理方法進(jìn)行處理，測(cè)定數(shù)值。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程對(duì)每只動(dòng)物各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血漿藥物濃度進(jìn)行計(jì)算，將血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)用DAS2.1.1藥代動(dòng)力學(xué)軟件處理，得到對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，使用SPSS13.1統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行計(jì)算，比較兩組間參數(shù)差異有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組大鼠體內(nèi)咪達(dá)唑侖的藥-時(shí)曲線見(jiàn)圖2，主要藥物參數(shù)見(jiàn)表2

計(jì)學(xué)處理，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組的t1/2、Cmax、AUC（0-12）、AUC（0-∞）、CL/F和V/F與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異（P>0.05）。

3討論

文獻(xiàn)報(bào)道[5]，觀察被影響藥物體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的變化情況，先給予能夠產(chǎn)生影響的藥物，使其體內(nèi)達(dá)到穩(wěn)態(tài)水平。對(duì)肝微粒體酶系統(tǒng)的影響充分體現(xiàn)出來(lái)，再給予被影響藥物。奧拉西坦使用后，在腦、肝、腎、及皮膚等全身組織藥物廣泛分布，3-5天可達(dá)穩(wěn)態(tài)；在研究奧拉西坦對(duì)咪達(dá)唑侖的相互作用時(shí)，首先應(yīng)確保體內(nèi)是否達(dá)到穩(wěn)態(tài)。而后尾靜脈給予咪達(dá)唑侖注射，密切觀察其藥動(dòng)學(xué)變化情況，如實(shí)反映奧拉西坦對(duì)咪達(dá)唑侖藥動(dòng)學(xué)的影響。

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