蘭玲，張國英，鄧微，王海東，葉蕾，寧光(北京積水潭醫(yī)院，北京00035；上海瑞金醫(yī)院)

?

原發(fā)性色素性結(jié)節(jié)性腎上腺皮質(zhì)病家系報(bào)告并基因突變分析

蘭玲1，張國英1，鄧微1，王海東1，葉蕾2，寧光2
(1北京積水潭醫(yī)院，北京100035；2上海瑞金醫(yī)院)

目的 分析1例原發(fā)性色素性結(jié)節(jié)樣腎上腺皮質(zhì)病(PPNAD)所致庫欣綜合征患者的家系和基因突變情況。方法 對(duì)1例PPNAD患者及其家系進(jìn)行病史收集及各項(xiàng)相關(guān)檢查并隨訪，采集患者及其家系成員全血樣本，對(duì)PRKAR1α、PDE11A、PDE8B基因進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果 先證者臨床表現(xiàn)為典型庫欣綜合征，血皮質(zhì)醇節(jié)律消失，小、大劑量地塞米松抑制試驗(yàn)示皮質(zhì)醇不受抑制，影像學(xué)檢查提示左側(cè)不典型腎上腺結(jié)節(jié)樣增生，手術(shù)切除腎上腺組織呈現(xiàn)色素結(jié)節(jié)樣病變及細(xì)胞內(nèi)脂褐素沉著，診斷為PPNAD。家系其他成員無庫欣綜合征及Carney綜合征表現(xiàn)。測(cè)序發(fā)現(xiàn)先證者PRKAR1α基因c.502G>A突變可能為與該患者PPNAD發(fā)病相關(guān)的突變，編碼的氨基酸由甘氨酸轉(zhuǎn)變成絲氨酸。先證者母親同為該突變攜帶者。結(jié)論 通過臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查，確診1例PPNAD患者。先證者及1位一級(jí)親屬攜帶相同的PRKAR1α基因突變，該突變可能與PPNAD的發(fā)病相關(guān)。

庫欣綜合征；原發(fā)性色素性結(jié)節(jié)樣腎上腺皮質(zhì)病；基因突變；PRKAR1α基因；家族性

原發(fā)性色素結(jié)節(jié)性腎上腺皮質(zhì)病(PPNAD)是一種罕見的促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)非依賴性庫欣綜合征，占庫欣綜合征的比例不到1%，其中約50%有家族發(fā)病傾向，呈常染色體顯性遺傳[1]。該病好發(fā)于兒童和青年，其臨床及影像學(xué)表現(xiàn)常不典型，最終診斷依賴于病理及免疫組化結(jié)果。PPNAD的病理特征為雙側(cè)腎上腺皮質(zhì)多發(fā)性自主分泌的色素沉著結(jié)節(jié)和結(jié)節(jié)間皮質(zhì)組織萎縮。當(dāng)PPNAD合并皮膚色素沉著、皮膚黏液瘤、心房黏液瘤、甲狀腺腺瘤、卵巢囊腫等稱為Carney綜合征[2]。多數(shù)PPNAD或Carney綜合征被認(rèn)為與PRKAR1α突變有關(guān)，此外還與PDE11A、PDE8B基因突變有關(guān)[3，4]。目前國內(nèi)外關(guān)于該病的報(bào)道較少，臨床上非常罕見。2015年我們收治了1例PPNAD患者，現(xiàn)將其診療資料及基因分析結(jié)果報(bào)告如下。

1 病例介紹

1.1 病例資料 患者女，21歲，主因“面部變圓伴腰痛2年”于2015年11月4日入院?，F(xiàn)病史：患者于2年前逐漸出現(xiàn)肥胖、面部變圓，腰腹部紫紋形成、腰痛，翻身困難。門診行腰椎CT檢查示“胸腰段多發(fā)壓縮性骨折，骨質(zhì)疏松”，腰椎骨密度T值-3.7，Z值-3.9。既往史：幼年時(shí)曾行先天性唇裂術(shù)。月經(jīng)史：17歲月經(jīng)初潮，近1年余月經(jīng)量明顯減少。家族史：家族中無類似癥狀疾病。查體：身高150 cm，體質(zhì)量65 kg，BMI 28.9 kg/m2，血壓190/116 mmHg。全身皮膚菲薄，多處瘀斑，多毛，滿月臉，多血質(zhì)，頸部脂肪墊，腋下、腰腹部大量縱向紫紋，腹膨隆，四肢纖細(xì)。心肺腹部查體未見明顯異常。實(shí)驗(yàn)室檢查：高脂血癥，皮質(zhì)醇顯著升高，節(jié)律消失(8：00 1 132 nmol/L，16：00 988.7 nmol/L，0：00 904.6 nmol/L)，促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)水平降低，小、大劑量地塞米松抑制試驗(yàn)陽性?？诜咸烟悄土吭囼?yàn)結(jié)果顯示，餐后2 h血糖11.6 mmol/L；胰島素釋放試驗(yàn)提示高胰島素血癥。輔助檢查：腎上腺CT檢查顯示雙側(cè)腎上腺略飽滿，左側(cè)腎上腺外肢可疑小結(jié)節(jié)影，增強(qiáng)掃描未見明顯異常強(qiáng)化，雙腎結(jié)石；胸部CT提示雙側(cè)肋骨多發(fā)陳舊骨折，胸椎多發(fā)壓縮性骨折。垂體核磁共振檢查未見異常。婦科超聲未探及雙側(cè)卵巢。全身PET/CT檢查顯示左腎上腺放射性攝取稍增高。結(jié)合化驗(yàn)檢查結(jié)果，考慮“ACTH非依賴性庫欣綜合征”，但定位診斷尚不明確，聯(lián)系導(dǎo)管室行腎上腺靜脈分段采血及皮質(zhì)醇濃度測(cè)定，最終確定左側(cè)為優(yōu)勢(shì)側(cè)。治療：轉(zhuǎn)入泌尿外科后行腹腔鏡下左腎上腺全切除術(shù)，術(shù)中可見腎上腺表面呈散在結(jié)節(jié)狀改變，結(jié)節(jié)呈灰色至黑褐色，直徑0.1～0.6 cm。術(shù)后病理檢查：HE染色顯示，皮質(zhì)可見多個(gè)圓形或卵圓形結(jié)節(jié)，由大量含有棕色色素的嗜酸細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞排列緊密成巢狀和梁狀，其中可見含色素沉著的胞質(zhì)及核異常的透明細(xì)胞形成，結(jié)節(jié)間皮質(zhì)正常；免疫組化染色顯示，增生結(jié)節(jié)內(nèi)細(xì)胞α-inhibin陽性，Syn陽性，S-100局灶陽性，CgA陰性。病理診斷：PPNAD。

1.2 術(shù)后隨訪 術(shù)后1周復(fù)查皮質(zhì)醇水平較前降低，但節(jié)律未恢復(fù)；血壓控制滿意。術(shù)后1個(gè)月復(fù)查，乏力較前明顯改善；皮質(zhì)醇水平恢復(fù)正常，節(jié)律仍異常(8：00 446.2 nmol/L，16：00 439.6 nmol/L, 0：00 370.5 nmol/L)；血壓水平進(jìn)一步降低，體質(zhì)量無明顯變化，性激素水平恢復(fù)正常，月經(jīng)恢復(fù)。術(shù)后3個(gè)月復(fù)查，皮質(zhì)醇節(jié)律未完全恢復(fù)，血壓基本正常，停用降壓藥，體質(zhì)量較前下降約3 kg。術(shù)后1年復(fù)查，皮質(zhì)醇節(jié)律未完全恢復(fù)，血壓、月經(jīng)正常，體質(zhì)量較前繼續(xù)下降約5 kg。

1.3 基因突變檢測(cè) 患者家系3代中其他成員均無類似病史，體檢及輔助檢查未見異常。于患者術(shù)后病情穩(wěn)定時(shí)，抽取患者及其母親全血行DNA檢測(cè)。以GenBank中提供的PRKAR1α、PDE11A、PDE8B基因序列為模板，應(yīng)用PrimerPremier5軟件在內(nèi)含子和外顯子交界處設(shè)計(jì)所有跨外顯子的引物，用PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化后直接測(cè)序，使用DNAstar軟件對(duì)比序列。測(cè)序結(jié)果顯示，患者及母親PDE8B測(cè)序均有一個(gè)已知雜合突變(NM_003719.3；rs335614)，但為同義突變，正常多態(tài)性；而PDE11A(NM_016953.3)測(cè)序中第1號(hào)外顯子有一個(gè)純合有義突變(rs6433711)，亦為正常多態(tài)性而且普遍存在于東亞人群中，故排除其致病性。母女PDE11A基因第20號(hào)外顯子的蛋白編碼序列中均存在純合插入突變，c.2763_2764insTCC(p.Ser921_Pro922insSer)，見圖1A。使用生物信息學(xué)工具provean[5]預(yù)測(cè)此突變對(duì)所編碼的蛋白質(zhì)功能的影響為中性(分值為0.007；分值小于-2.5考慮為有害，大于-2.5考慮為中性)。對(duì)基因PRKAR1α(NM_001278433.1)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，母女二人第5號(hào)外顯子編碼區(qū)上緊鄰內(nèi)含子區(qū)的剪接位點(diǎn)存在雜合突變，c.502G>A，p.168Gly>Ser，見圖1B。使用provean預(yù)測(cè)此突變對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)功能影響為有害突變(分值為-4.883)。

2 討論

PPNAD是非ACTH依賴性庫欣綜合征的一種罕見病因及表現(xiàn)形式。臨床上可散發(fā)，也可作為Carney綜合征的組成成分之一出現(xiàn)。其臨床和影像學(xué)表現(xiàn)可不典型，容易漏診或誤診。本例患者為年輕女性，以嚴(yán)重骨質(zhì)疏松伴多發(fā)骨折首發(fā)，臨床提示繼發(fā)性骨質(zhì)疏松可能性大，仔細(xì)詢問病史及體格檢查均強(qiáng)烈提示庫欣綜合征的可能。后續(xù)完善相關(guān)檢查，定性診斷為非ACTH依賴性庫欣綜合征。行雙側(cè)腎上腺靜脈分段采血檢測(cè)皮質(zhì)醇與ACTH水平，結(jié)果顯示左側(cè)為優(yōu)勢(shì)側(cè)，因此行腹腔鏡下左腎上腺全切術(shù)。術(shù)中大體標(biāo)本及術(shù)后病理均呈現(xiàn)典型的PPNAD表現(xiàn)，免疫組化結(jié)果顯示Syn、α-inhibin陽性，提示PPNAD的腎上腺神經(jīng)內(nèi)分泌性質(zhì)及自主分泌功能，也可能與該基因過表達(dá)有關(guān)[6]。

圖1 先證者及母親外顯子測(cè)序結(jié)果

Travis等[7]報(bào)道，PPNAD中不僅含豐富的嗜酸性細(xì)胞質(zhì)的網(wǎng)狀帶細(xì)胞，還有大量富含脂質(zhì)的空泡狀束狀帶細(xì)胞，提示PPNAD結(jié)節(jié)可能來源于腎上腺皮質(zhì)網(wǎng)狀帶和束狀帶?；驕y(cè)序結(jié)果顯示，PPNAD可能與定位于17q22-24的cAMP依賴性蛋白激酶A(PKA)的調(diào)節(jié)亞基R1α基因(PRKAR1α)突變有關(guān)[8]。因此，當(dāng)PPNAD的診斷存在困難或患者存在家族性多發(fā)時(shí)，對(duì)PPNAD常見突變基因外顯子的測(cè)序也有助于確診。PRKAR1α被認(rèn)為是一個(gè)抑癌基因，其突變導(dǎo)致的PKA活性增加可引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9]。Horvath等[9]對(duì)185個(gè)Carney綜合征家系基因研究發(fā)現(xiàn)，114個(gè)家系存在PRKAR1α基因突變，而在Carney綜合征中以PPNAD所致庫欣綜合征為主要臨床表現(xiàn)的患者中，該基因突變的檢出率為80%。國外報(bào)道，在PRKAR1α突變攜帶者中，具有Carney綜合征的外顯率超過95%。國內(nèi)瑞金醫(yī)院對(duì)1例Carney綜合征進(jìn)行家系調(diào)查及基因突變研究，發(fā)現(xiàn)患者及其父親均攜帶PRKAR1α基因突變[10]。近年研究發(fā)現(xiàn)，除PRKAR1α基因外，PPNAD還與定位于2q3l的磷酸二酯酶11A(PDE11A)和定位于5q13的磷酸二酯酶8B(PDE8B)基因突變有關(guān)[11]。

Bertherat等[12]報(bào)道，已知的致病PRKAR1α基因突變大部分是因?yàn)楫a(chǎn)生提前終止密碼子，通過無義介導(dǎo)的mRNA降解機(jī)制使對(duì)應(yīng)蛋白不能表達(dá)翻譯，從而導(dǎo)致功能缺失，僅因?yàn)楦淖働RKAR1α基因上少數(shù)氨基酸而導(dǎo)致其功能失效的突變非常稀有。本研究在先證者及其母親的PRKAR1α中發(fā)現(xiàn)一稀有的突變，第5號(hào)外顯子編碼區(qū)剪接位點(diǎn)的雜合突變，c.502G>A，p.168Gly>Ser，僅導(dǎo)致編碼的第168位氨基酸由甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸，蛋白數(shù)據(jù)庫UniProtKB中多序列比較顯示此位點(diǎn)位于蛋白上一個(gè)相對(duì)保守的區(qū)域內(nèi)，該位點(diǎn)的甘氨酸高度保守。對(duì)應(yīng)的蛋白3D結(jié)構(gòu)圖顯示此突變位點(diǎn)處在一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域上，因此該位點(diǎn)氨基酸的改變可能導(dǎo)致了相應(yīng)蛋白質(zhì)功能的破壞。此突變?cè)谌后w中的突變頻率尚無公開數(shù)據(jù)，僅在文獻(xiàn)[12]中有報(bào)道此位點(diǎn)和Carney綜合征表型有關(guān)，基本可以確定為此病例的致病突變。但先證者母親沒有癥狀，通過分析母親測(cè)序峰圖上突變位點(diǎn)的2等位基因信號(hào)強(qiáng)度比例跟病例不同，通過數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)此基因剛好坐落于一拷貝數(shù)變異區(qū)域上，所以強(qiáng)烈懷疑是雜合等位基因在母女倆基因組上存在不同的拷貝數(shù)變異而導(dǎo)致的表型差異。當(dāng)然也有可能是其他我們目前未能檢測(cè)到的基因差異導(dǎo)致她們臨床表現(xiàn)的差別)。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)，母女二人PDE11A第20號(hào)外顯子存在純合插入突變，c.2763_2764insTCC(p.Ser921_Pro922insSer)，即第921號(hào)密碼子后插入TCC 3個(gè)堿基，在編碼蛋白的第921位和922位氨基酸之間插入了一個(gè)絲氨酸。該突變?cè)谌后w中的突變頻率數(shù)據(jù)未知，目前未見有臨床意義的公開報(bào)告。我們通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)該突變對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響為中性，故在此病例中有臨床意義的可能性較小。此例突變?yōu)槟概z傳，符合典型的顯性遺傳，而先證者母親雖然攜帶了相同的突變但無PPNAD表現(xiàn)，這可能與突變基因的低外顯率有關(guān)。既往基因型-表型關(guān)聯(lián)性分析研究顯示，PRKAR1α突變陽性的患者比陰性者更易、更早發(fā)生皮膚色素沉著病變、黏液瘤、甲狀腺和性腺腫瘤；本研究中，先證者無其他Carney綜合征癥狀，僅符合PPNAD的診斷，隨訪需注意發(fā)生其他Carney綜合征表現(xiàn)的可能。同時(shí)，位于2q31的PDE11A和5q13的PDE8B基因也被認(rèn)為可能與該病有關(guān)。但是，對(duì)本例PPNAD家系的PDE11A和PDE8B基因測(cè)序中均未發(fā)現(xiàn)有意義的突變。

PPNAD是一種常染色體顯性遺傳性疾病，藥物治療作用有限。因PPNAD絕大多數(shù)累及雙側(cè)腎上腺，故最有效的治療方法是雙側(cè)腎上腺全切術(shù)及術(shù)后激素替代治療，治愈率近100%，但術(shù)后可出現(xiàn)Nelson綜合征，需采用激素替代療法。本例患者行腎上腺單側(cè)切除后隨訪1年，臨床癥狀及體征明顯改善，皮質(zhì)醇激素水平顯著降低，血壓、月經(jīng)均恢復(fù)正常。

綜上所述，我們對(duì)1例確診PPNAD患者及其家系進(jìn)行臨床和基因分析，在對(duì)PRKAR1α、PDE11A和PDE8B測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)PRKAR1α的c.502G>A很可能是與該患者PPNAD發(fā)病相關(guān)的突變，而PDE11A的c.2763_2764insTCC致PPNAD發(fā)病的可能性較小，但不能完全排除。這兩個(gè)突變均可導(dǎo)致編碼蛋白的改變，考慮可能與PPNAD的發(fā)病有關(guān)。

[1] Carney JA, Gordon H, Carpenter PC, et al. The complex of myxomas，spotty pigmentation, and endocrine overactivity[J]. Medicine(Balfimom), 1985,64(4):270-283.

[2] da Silva RM, Pinto E, Goldman SM, et al. Children with Cushing′s syndrome：primary pigmented nodular adrenocortical disease should always be suspected[J]. Pituitary, 2011,14(1):61-67.

[3] Stratakis CA. New genes and/or molecular pathways associated with adrenal hypeIplasias and related adrenocortical tumors[J]．Mol Cell Endocrinol, 2009,300(1-2):152-157.

[4] Tadjine M, Lampron A, Ouadi L, et al． Detection of somatic beta-eatenin mutations in primary pigmented nodular adrenocortical disease(PPNAD)[J]. Clin Endocrinol(Oxf), 2008,69(3):367-373.

[5] Choi Y, Sims GE, Murphy S, et al. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels[J]. PLoS One, 2012,7(10):e46688.

[6] Sasano H, Miyazaki S, Sawai T, et al. Primary pigmented nodular adrenocortical disease(PPNAD): Inununohistochemical and insitu hybridisation analysis of steroidogenic enzymes in 8 cases[J]. Mod Pathol, 1992,5(1):23-29.

[7] Travis WD, Tsokos M, Doppman JL, et al. Primary Pigmented nodular adrenocortlcal disease．A light and electron microscopic study of eight cⅧ[J]. Am J Surg Pathol, 1989,13(11):921-930.

[8] Pereim AM, Hes FJ, Horvath A, et al. Association of the MIV PRKAR1α mutation with primaIy pigmented nodular adrenocortical disease in two large families[J]. J Clin Endocrinol Metal, 2010,95(1):338-342.

[9] Horvath A, Bertherat J, Groussin L, et al. Mutations and polymorphisms in the gene encoding regulatory subunit type 1-alpha Of protein kinase A(PRKAR1α): an update[J]. Hum Mutat, 2010,31(4):369-379.

[10] 顧燕云,陳瑛,宋懷東,等.一例家族性Carney綜合征臨床及分子生物學(xué)研究[J]．中華內(nèi)科雜志,2004,43(10):764-768.

[11] Greene EL, Horvath AD, Nesterova M, et al. In vitro functional studies of naturally occurring pathogenic PRKAR1α mutations that are not subject to nonsense mRNA decay[J]. Hum Mutat, 2008,29(5):633-639.

[12] Bertherat J, Horvath A, Groussin L, et al. Mutations in regulatory subunit type 1A of cyclic AMP-dependent protein kinase (PRKAR1A): phenotype analysis in 353 patients and 80 different genotypes[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2009,94(6):2085-2091.

鄧微(E-mail: lanjingling0627@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.029

R596

B

1002-266X(2017)26-0086-03

2016-12-26)