丁榕，王杰，趙和文，張克中,2,3*，崔金騰,2,3

(1.北京農(nóng)學院 園林學院，北京 102206； 2.城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室，北京 102206；3.北京市鄉(xiāng)村景觀規(guī)劃設計工程技術研究中心，北京 102206)

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百合S-RNase基因cDNA全長克隆及表達分析

丁榕1，王杰1，趙和文1，張克中1,2,3*，崔金騰1,2,3

(1.北京農(nóng)學院 園林學院，北京 102206； 2.城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室，北京 102206；3.北京市鄉(xiāng)村景觀規(guī)劃設計工程技術研究中心，北京 102206)

[目的]克隆百合S-RNase基因cDNA全長序列并進行表達信息分析，為百合不親和機制的研究奠定基礎。[方法]以東方百合(Liliumoriental)品種‘Justina’為材料，通過RACE技術克隆百合S-RNase基因的cDNA全長序列；采用半定量RT-PCR技術對百合同一時期不同器官的S-RNase基因的表達量進行定性分析；并通過NCBI在線工具以及ProtParam、SignalP、MEGA5對其序列進行生物信息學分析。[結果]克隆基因全長為766 bp，開放閱讀框為672 bp，推導編碼223個氨基酸；其半定量分析顯示表達量由高到低的器官依次為花瓣、葉、莖、大量分泌液時的花柱、無分泌液時的花柱、鱗莖。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白為一個不穩(wěn)定的親水蛋白、存在信號肽序列，屬于分泌型蛋白。具有典型的RNase T2家族蛋白保守結構域特征，二級結構富含環(huán)形結構。在已知的S-RNase基因中，與野茶樹的親緣關系最近。[結論]獲得百合S-RNase基因cDNA全長序列及在同一時期不同器官的S-RNase基因的表達量。

百合；S-RNase基因； 克??； 半定量

S-RNase(S-glycoprotein RNase)是一種N-糖基化的核酸酶，主要在花柱的柱頭和引導組織中表達，是茄科、薔薇科以及玄參科等植物自交不親和性的雌性決定因子[1]。早在1986年，首次在花煙草(Nicotianaalata)中得到一種與自交不親和有關的花柱糖蛋白的cDNA克隆[2]，隨后發(fā)現(xiàn)其是一種與真菌RNase Rh和RNase T2具有相似的結構的核酸酶，具有能夠分解RNA的核酸酶活性，稱為S-RNase[3，4]。其酶活性能夠選擇性的降解自花花粉管中的RNA，而異花花粉管中能夠正常生長[5]，并且其酶活性對于自交不親和反應是必需的，缺失后無法產(chǎn)生對相同S基因型花粉的抑制作用[6]。其作用原理是S-RNase能夠進入花粉管發(fā)揮自身的細胞毒素作用降解RNA，從而阻止花粉管生長[7]。S-RNase基因位于S-locus,具有S 等位基因的多態(tài)性[8]。隨著研究的不斷深入，在茄科、薔薇科以及玄參科等植物中已克隆到上百個S-RNase基因，其作用原理也逐漸清晰[9，10]。

百合(Lilium)是在世界范圍內廣泛應用的鮮切花和園林花卉，兼具食用、藥用等用途。目前，關于百合品種S 基因的研究極少，亟待突破[11]。在本課題組對于東方百合‘Justina’未分泌粘液的雌蕊與分泌大量粘液的雌蕊的轉錄組測序結果中，S-RNase基因在分泌大量粘液的雌蕊中相對表達量較大，表明對于百合這一類具有不親和性的物種來說，S-RNase基因對于百合不親和機制具有重要作用。關于該基因對自交不親和性與雜交不親和性的機理是否存在聯(lián)系還尚未明確，需要進一步研究。本研究的主要目的在于克隆該基因，并進行表達量分析，為后續(xù)的工作打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

植物材料為北京農(nóng)學院東大地球根花卉大棚常規(guī)栽培管理的東方百合(Liliumoriental)品種‘Justina’。

3′-RACE-Full Length cDNA Kit試劑盒、反轉錄試劑盒、瓊脂糖凝膠切膠回收試劑盒、pMD19-T Vector連接試劑盒、DH5α感受態(tài)細胞等均購自TaKaRa公司。

1.2 百合S-RNase基因cDNA序列全長克隆

在‘Justina’開花前一天去雄、套袋；有大量分泌液時，快速摘取花柱；液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩２捎肨rizol法分別提取RNA，并根據(jù)轉錄組測序所得的S-RNase基因序列，設計3′內、外引物(表1)，進行3′cDNA末端擴增反應。通過 DNAMAN軟件將3′RACE測序序列與轉錄組測序所得序列進行拼接，利用ORF Finder對拼接結果進行分析，得到一個包括起始密碼子和終止密碼子在內的672 bp的最大開放閱讀框架，與NCBI數(shù)據(jù)庫其他物種的S-RNase基因比對長度相符且相似性很高，說明這段核苷酸序列為該基因的全長序列。設計擴增完整ORF框的特異性引物F1、R1(表1)進行進行全長驗證的PCR擴增反應。

表1 PCR 擴增所用引物及其序列

1.3 百合S-RNase基因的半定量表達分析

‘Justina’開花前一天去雄、套袋；在無分泌液時快速摘取花柱(BL1)、花瓣、葉、莖、鱗莖；在有大量分泌液時，快速摘取花柱(BL2)，均液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。采用Trizol法分別提取RNA，以18S rRNA作為內參基因，由引物F1、R1(表1)，進行半定量表達分析。

1.4 百合S-RNase基因的生物信息學分析

通過ORF Finder(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/gorf/orFig.cgi)尋找S-RNase基因的開放閱讀框架、將核酸序列翻譯成氨基酸序列；BLAST 工具進行同源性分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)；Protein在線數(shù)據(jù)庫搜索S-RNase氨基酸序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=)；CDD在線工具進行結構域分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)；Expasy在線系統(tǒng)Protparam(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)預測S-RNase基因的基本理化性質在線程序預測二級結構：PredictProtein(http://www.predictprotein.org/)；運用Signalp4.1(http: //www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)對S-RNase基因氨基酸序列進行信號肽預測分析；運用MAGA 5.2對S-RNase基因進行氨基酸序列比對分析和系統(tǒng)進化樹構建。

2 結果與分析

2.1 百合S-RNase基因cDNA序列克隆

以東方百合‘Justina’有大量分泌液時的花柱為試驗材料，提取總RNA；以轉錄組測序所得的S-RNase基因序列為基礎，進行3′RACE，得到400 bp左右的擴增產(chǎn)物(圖1,A)，測序結果顯示該片段實際長度為362 bp；轉錄組測得序列和3′RACE所得序列拼接結果通過ORF Finder分析找到672 bp 的完整開放閱讀框，進行全長克隆驗證，得到約750 bp左右的擴增產(chǎn)物(圖1,B)，測序結果顯示該片段實際長度為766 bp，符合預期結果。

A: 3′-RACE擴增結果；B:cDNA PCR 擴增結果圖1 百合S-RNase基因擴增結果A. Amplification results of3′-RACE, B.Amplification results of cDNAFig.1 Amplification results of Lilium S-RNase注: M: 2000 DNA markerNote: M: 2000 DNA marker

2.2 百合S-RNase基因的半定量表達分析

以‘Justina’無分泌液時快速摘取花柱(BL1)、花瓣、葉、莖、鱗莖及有大量分泌液時的花柱(BL2)為材料，各取材1 g,18S rRNA作為內參基因，進行半定量表達分析。結果表明(圖2)，S-RNase在BL1、BL2、花瓣、葉、莖中均有不同程度的表達，而在鱗莖中沒有表達。其中，花瓣表達水平最高，葉次之，BL1最低。S-RNase基因在不同器官的表達水平具有空間差異性。S-RNase基因在BL2表達量較BL1高，說明該基因對于雌蕊的授粉可能有重要作用。

圖2 半定量RT-PCR電泳結果Fig.2 The test of semi-quantitative RT-PCR

2.3 百合S-RNase基因及其編碼蛋白的生物信息學分析

通過ORF Finder在線工具推導百合S-RNase基因共編碼223個氨基酸(圖3)，其中起始密碼子ATG位于31～33 bp處，終止密碼子TAA位于699～702 bp處。通過CDD在線工具進行保守結構域分析，發(fā)現(xiàn)其具有兩種RNase T2家族蛋白的特征結構域CAS (conserved amino acid)模體。通過SignalP 4.1進行信號肽預測分析，其為分泌蛋白，可能在跨膜運輸中起到信號識別作用；剪切位點位于20～21位氨基酸，成熟肽始于第20位氨基酸。ProtParam預測蛋白基本質理化性質，相對分子質量為24 870.8 Da，理論等電點pI為4.87，是一個不穩(wěn)定蛋白；Protscale預測整個蛋白為親水蛋白；通過PredictProtein在線程序進行百合S-RNase蛋白二級結構預測表明，螺旋(H)比例為28.70%；折疊(E)比例為13%；環(huán)形結構(L)比例為58.30%。

圖3 百合S-RNase cDNA序列及其氨基酸序列Fig.3 S-RNase gene cDNA sequence of Lilium and the deduced amino acid 注：啟示密碼子(ATG)、終止密碼子(TAA)用紅色邊框標注,黃色區(qū)域為CAS模體，藍色字體為其信號肽序列Note：The start codon (ATG) and the stop codon (TAA) were marked by red box.The CAS motifs were marked by yellow colors.The signal peptide were marked by blue font

因為S-RNase是茄科、薔薇科以及玄參科等植物自交不親和性的雌性決定因子，所以在NCBI數(shù)據(jù)庫中分別找到了茄科植物8條S-RNase基因序列、薔薇科植物14條S-RNase基因序列、玄參科金魚草僅有的1條S-RNase基因序列，以及除茄科、薔薇科以及玄參科以外的僅有的羅漢果、野茶樹各一條序列，共選取了S-RNase基因的氨基酸序列25條。利用MEGA 5.2 軟件，對百合S-RNase基因的推導氨基酸序列與選取的25條氨基酸序列進行比對并構建系統(tǒng)進化樹。

根據(jù) Kubo 等研究[12，13]以及S-RNase基因氨基酸序列多重比對結果顯示(圖4)，茄科植物可依次分為C1、C2、HVa、HVb、C3、C4、C5，5 個保守區(qū)(C1～C5)和 2 個高變區(qū)(HVa、HVb)；薔薇科植物可依次分為C1、C2、HV、C3、C4、C5，五個保守區(qū)(C1～C5)和一個高變區(qū)(HV)；東方百合以及金魚草、羅漢果、野茶樹等有明顯的C1、C2、C3區(qū)以及高變區(qū)，無明顯的C4及C5區(qū)域，并且茄科植物與薔薇科植物的C4區(qū)明顯不同。

采用NJ法構建系統(tǒng)進化樹，基于1 000次重復以Bootstrap驗證進行分析。結果顯示(圖5)，所有樣本被分為A和B 2個大區(qū)域，薔薇科均植物被分到A區(qū)域，茄科植物均被分到B區(qū)域，與植物科屬分類相同。薔薇科李屬植物均被分在A-1區(qū)，梨屬植物與蘋果屬植物沒有完全分開，被共同分在A-2區(qū)，其中，梨屬西洋梨與蘋果屬植物親緣關系較近，被分在同一分支。在雙子葉植物中，東方百合與野茶樹親緣最近，與薔薇科、茄科植物較遠。玄參科金魚草與茄科植物親緣關系較近。

3 討論與結論

本試驗以東方百合‘Justina’的有大量分泌液時的花柱為材料，結合轉錄組得到的序列，克隆到一個具有完整編碼區(qū)的S-RNase基因，并對基因序列及編碼蛋白進行分析，發(fā)現(xiàn)其具有典型的RNase T2家族蛋白保守結構域特征，屬于RNase T2家族[14]。經(jīng)信號肽預測分析，其為分泌蛋白，與授粉過程中從花柱傳導細胞中分泌至胞外基質并能夠進入花粉管細胞的功能有關[15]。 S-RNase 的高變區(qū)是花柱特異性識別花粉SFB的區(qū)域，與自交不親和反應的特異性有關[16]。S-RNase的保守區(qū)可分為五個區(qū)域(C1～C5)，其中C1、C4和C5區(qū)是疏水區(qū)，與蛋白結構的穩(wěn)定性有關；C2和C3區(qū)是親水區(qū)，與蛋白的催化活性有關[17]，與RNase T2保守區(qū)相同，是S-RNase 的活性區(qū)域。在比對結果中，茄科植物與薔薇科植物的C4區(qū)不同，并且東方百合等也無明顯的C4區(qū)域，這說明C4區(qū)域具有明顯的科間特征。因目前東方百合等植物的S-RNase基因克隆結果太少，其C4、C5區(qū)域還需更多序列進行比對分析?？衫没蛲蛔僛18]或基因沉默[19]等技術，可以對信號肽區(qū)域的核酸序列進行干擾，使其無法進入花粉管細胞，或者對活性區(qū)域進行干擾，使其喪失核糖核酸酶活性，也應用于高變區(qū)，從而進行自交不親和性的分子調控。

圖4 百合 S-RNase 與其它物種的氨基酸序列比對圖Fig.4 Sequence alignment of amino acid of the Lilium S-RNase and and other species

圖5 百合S-RNase基因與其它物種的氨基酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.4 Sequence alignment of amino acid of the Lilium S-RNaseand and other species注：支持率低于50的隱去Note：approval rating below 50 hides

百合S-RNase基因的半定量表達分析結果顯示，S-RNase基因在BL2(大量分泌液花柱)表達量較BL1(無分泌液的花柱)高，說明該基因對于雌蕊的授粉可能有重要作用。而在除花柱以外的其它不同器官組織中也有不同程度的表達，這說明S-RNase基因在百合中除參與雌蕊的授粉外可能還起到其它功能。RNase T2家族蛋白廣泛存在于生物體內，能夠在植物落葉、損傷和侵染反應過程中表達。已有研究表明，RNase T2家族還具有與核酸酶活性無關的其他功能[20]。

本試驗以東方百合‘Justina’的有大量分泌液

時的花柱為材料，成功克隆了S-RNase基因cDNA全長序列，并分析了S-RNase基因在同一時期不同器官的表達量，為今后深入探討百合的不親和機制奠定基礎。

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(編輯：馬榮博)

Clone and expression analysis of the full-length cdna sequences ofS-RNaseinLilium

Ding Rong1, Wang Jie1, Zhao Hewen1, Zhang Kezhong1,2,3*, Cui Jinteng1,2,3

(1.CollegeofLandscape,BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China; 2.BeijinglaboratoryofUrbanandruralecologicalenvironment,Beijing102206,China; 3.BeijingEngineeringResearchCenterofrurallandscapeplanninganddesign,Beijing102206,China)

[Objective]The clone and the expression analysis of the full length sequence of LiliumS-RNasegene which would made a foundation for discovering the molecular regulation of incompatibility in Lilium.[Methods]The full cDNA sequence ofS-RNasewas isolated from a style of Lilium oriental ‘Justina’ by RACE. Semi-quantitative RT-PCR technology was used to analyse the expression of different organs of theS-RNasegene in the same period. Bioinformatic analysis was used by the online tools of National Center for Biotechnology Information and ProtParam, SignalP, MEGA5.[Results]The result showed that the full length of theS-RNasegene was 766 bp, with an open reading frame of 672bp, which encoded a protein with 223 amino acids. The semi-quantitative expression showed that its expression order from higher to lower were petals, leaves, stems, BL2, BL1, bulbs. It was predicted that thisS-RNaseprotein was a hydrophilic proteins with a signal peptide，which belonging to the secrete protein. This protein had a typical conserved domains of RNase T2 family. The secondary structure was rich in loop structure. The relationship analysis showed that Camellia sinensis was closest with Lilium among the knownS-RNasegene.[Conclusion]The full length sequence ofLiliumS-RNasegene was obtained and the expression of different organs of theS-RNasegene in same period were analysed by semi-quantitative RT-PCR technology.

Lilium,S-RNasegene, Cloning, Semi quantitative RT PCR

2017-03-07

2017-06-10

丁榕(1992-)，女(漢)，山東濰坊人，碩士研究生，研究方向：園林植物與觀賞園藝

*通信作者：張克中，教授，碩士生導師，Tel:01080797210; E-mail: zkzzxd@vip.sina.com

北京市教育委員會2015年科技計劃面上項目(KM201510020011)；北京市屬高等學校創(chuàng)新團隊建設項目(IDHT20150503)；科技創(chuàng)新服務能力建設-協(xié)同創(chuàng)新中心-林果業(yè)生態(tài)環(huán)境功能提升協(xié)同創(chuàng)新中心(2011協(xié)同創(chuàng)新中心)(市級)(PXM2017_014207_000043)；北京農(nóng)學院學位與研究生教育改革與發(fā)展項目(5056516004/026)

S682.29

A

1671-8151(2017)09-0649-07