常麗娟，宋 君，劉文娟，張富麗，王 東，尹 全，雷紹榮

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，四川 成都 610066)

?

轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉外源Bt蛋白的差異表達(dá)

常麗娟，宋 君，劉文娟，張富麗，王 東，尹 全，雷紹榮

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，四川 成都 610066)

【目的】研究轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉外源Bt蛋白表達(dá)的時(shí)空規(guī)律，明確Bt蛋白表達(dá)量和轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉抗性的內(nèi)在聯(lián)系，更加有效降低靶標(biāo)害蟲(chóng)危害?！痉椒ā坎捎肊LISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)蛋白定量檢測(cè)方法，以轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉鄂抗蟲(chóng)棉1號(hào)(GK19)為研究材料，對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉不同組織器官、不同生長(zhǎng)時(shí)期主莖功能葉和不同生長(zhǎng)時(shí)期主莖不同葉位葉片的Bt蛋白含量進(jìn)行檢測(cè)?！窘Y(jié)果】轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉不同組織器官Bt蛋白含量存在差異，苗期葉片最高，花、蕾、鈴次之，根、莖較低；不同生長(zhǎng)時(shí)期主莖功能葉Bt蛋白含量呈現(xiàn)出隨生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間推進(jìn)而降低的趨勢(shì)；不同生長(zhǎng)時(shí)期主莖不同葉位葉片Bt蛋白含量差異較大，苗期和盛蕾期第1～7葉呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)，而盛花期和盛鈴期第1～7葉呈現(xiàn)出先緩慢升高后逐漸穩(wěn)定的趨勢(shì)?！窘Y(jié)論】Bt蛋白在轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉各生長(zhǎng)時(shí)期，各組織器官都有表達(dá)，且表達(dá)量呈時(shí)空動(dòng)態(tài)變化。

轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉；ELISA；Bt蛋白含量；差異表達(dá)

【研究意義】棉花是我國(guó)廣泛種植的經(jīng)濟(jì)作物。長(zhǎng)期以來(lái)，由于棉鈴蟲(chóng)的危害使棉花產(chǎn)量顯著下降，給我國(guó)經(jīng)濟(jì)造成了嚴(yán)重?fù)p失。棉鈴蟲(chóng)田間防治通常采用噴灑化學(xué)農(nóng)藥的方法，隨著農(nóng)藥使用時(shí)間的延長(zhǎng)，棉鈴蟲(chóng)的抗藥性逐年增加，且農(nóng)藥在環(huán)境中大量累積，危害人類(lèi)身體健康。轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的培育成功解決了棉鈴蟲(chóng)傳統(tǒng)防治所面臨的問(wèn)題，國(guó)內(nèi)大多轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉品種都轉(zhuǎn)入了來(lái)自蘇云金芽孢桿菌的Bt基因，由該基因編碼的Bt蛋白對(duì)鱗翅目、鞘翅目昆蟲(chóng)具有特異毒性。Bt蛋白表達(dá)量直接決定轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的抗性?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】已有研究發(fā)現(xiàn)，Bt蛋白表達(dá)具有時(shí)空效應(yīng)[1-3]且易受環(huán)境因素影響，如溫度[4-5]、濕度[5]、干旱和漬澇[6]、鹽脅迫[7]、氮肥施用量[8]等都可影響B(tài)t蛋白表達(dá)量?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】在四川生態(tài)環(huán)境條件下種植長(zhǎng)江流域具有代表性的抗蟲(chóng)棉品種鄂抗蟲(chóng)棉1號(hào)，并對(duì)鄂抗蟲(chóng)棉1號(hào)不同組織器官、不同生長(zhǎng)時(shí)期主莖功能葉和不同生長(zhǎng)時(shí)期主莖不同葉位葉片的Bt蛋白含量進(jìn)行研究，旨在探究Bt蛋白表達(dá)的時(shí)空變化規(guī)律，為長(zhǎng)江流域轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉的田間種植提供理論依據(jù)。

表1 不同組織器官Bt蛋白含量

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同的小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note： Data in the same row followed by different lowercase letters shows significant difference at 0.05 level.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉品種為鄂抗蟲(chóng)棉1號(hào)。田間種植4月播種，行距0.4 m，株距0.3 m，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)品種種植3個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)種植100株，常規(guī)管理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 取樣 每個(gè)小區(qū)隨機(jī)抽取20株轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉，取苗期根、莖和葉片；花期花和葉片；蕾期蕾和葉片；鈴期鈴和葉片。葉片采集植株主莖頂部倒數(shù)第1～7片完全展開(kāi)的葉片，蕾采集直徑約5 mm的小蕾，鈴采集直徑約1 cm的小鈴。

1.2.2 待測(cè)樣品的處理 將采集的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉樣品液氮研磨，每個(gè)樣品研磨后迅速稱取0.4 g粉末于離心管中，向離心管中加入4 mL的PBS溶液(由Envirologix試劑盒提供的提取緩沖液粉末溶解后再加5 %的吐溫配置而成)，低溫?fù)u床振蕩12 h，取出樣品放于低溫高速離心機(jī)4 ℃、8000 r/min離心20 min，取上清液備用。

1.2.3 可溶性總蛋白含量的檢測(cè) 按照BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒要求稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線，并稀釋待測(cè)樣品的可溶性總蛋白濃度至標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，將25 μl BSA標(biāo)準(zhǔn)液和待測(cè)樣品分別加入到酶標(biāo)板內(nèi)相應(yīng)位置，然后加入BCA 工作液200 μl，充分混勻37 ℃放置30 min后，在562 nm波長(zhǎng)下讀取光密度值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品中可溶性總蛋白的含量。

1.2.4 Bt蛋白含量的檢測(cè) Bt 蛋白含量采用Envirologix試劑盒測(cè)定，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，將標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋成1.00、0.80、0.64、0.46、0.28、0.10 ng·mL-16個(gè)濃度梯度，并稀釋待測(cè)樣品的Bt 蛋白濃度至標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，將標(biāo)準(zhǔn)液和待測(cè)樣品一起加入酶標(biāo)板內(nèi)相應(yīng)位置，得到相應(yīng)的光密度值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品中單位鮮重Bt 蛋白的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2007和SPSS 13.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同組織器官Bt蛋白含量的檢測(cè)

分別對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉苗期根、莖和葉片、蕾期蕾、花期花、鈴期鈴的 Bt 蛋白含量進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苗期葉片可溶性總蛋白含量最高，根可溶性總蛋白含量最低，不同組織器官間可溶性總蛋白含量無(wú)顯著差異。單位可溶性總蛋白Bt蛋白含量苗期葉片最高，與其他組織器官差異顯著；花、蕾、鈴Bt 蛋白含量次之；根、莖Bt 蛋白含量較低，與葉、花、蕾、鈴差異顯著(表1)。

2.2 不同生長(zhǎng)時(shí)期主莖功能葉Bt蛋白含量的檢測(cè)

為了研究轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉不同生長(zhǎng)時(shí)期主莖功能葉Bt蛋白含量是否存在差異(圖1)，分別采集苗期、盛蕾期、盛花期和盛鈴期主莖頂端倒數(shù)第3片完全展開(kāi)的葉片為樣本，對(duì)樣品單位鮮重Bt蛋白含量和可溶性總蛋白含量進(jìn)行了檢測(cè)。數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，單位可溶性總蛋白Bt蛋白含量苗期葉片最高；盛蕾期葉片緩慢降低；盛花期葉片下降幅度較大，與苗期葉片和盛蕾期葉片均差異顯著；盛鈴期葉片最低，不同生長(zhǎng)時(shí)期主莖功能葉單位可溶性總蛋白Bt蛋白含量呈現(xiàn)出隨生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間推進(jìn)而降低的趨勢(shì)。

2.3 不同生長(zhǎng)時(shí)期主莖不同葉位葉片Bt蛋白含量的檢測(cè)

對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉不同生長(zhǎng)時(shí)期主莖不同葉位葉片Bt蛋白含量進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苗期和盛蕾期頂部倒數(shù)第1～7葉單位可溶性總蛋白Bt蛋白含量呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)，前3葉下降幅度較大，第4葉后Bt蛋白含量緩慢下降；而盛花期和盛鈴期頂部倒數(shù)第1～7葉Bt蛋白含量呈現(xiàn)出先緩慢升高后逐漸穩(wěn)定的趨勢(shì)(圖2，表2)。

表2 不同時(shí)期主莖不同葉位葉片Bt蛋白含量

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同的小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note： Data in the same row followed by different lowercase letters shows significant difference at 0.05 level.

3 討 論

迄今為止，我國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)種植的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉外源基因有cryIAb和cryIAc2個(gè)基因，外源基因啟動(dòng)子大多采用花椰菜花葉病毒35 S啟動(dòng)子(CaMV35S)。已有研究表明，由CaMV35S啟動(dòng)的外源基因在不同類(lèi)型的植物中表達(dá)量不盡相同[9]，在同種植物的不同發(fā)育階段、不同的組織器官表達(dá)量也存在差異[10-11]。陳松等[1]報(bào)道，在苗期全展功能葉中Bt蛋白含量最高，根、莖和葉柄中Bt蛋白含量較低；不同生育期葉片Bt蛋白含量苗期葉片最高，蕾期次之，花鈴期最低。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Bt蛋白含量在苗期葉片中最高，蕾、花、鈴次之，根、莖較低；不同生長(zhǎng)時(shí)期功能葉Bt蛋白含量呈現(xiàn)出隨生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間推進(jìn)而降低的趨勢(shì)，與陳松的研究結(jié)果相一致。孫偉等[2]研究發(fā)現(xiàn)，苗期主莖不同葉位葉片Bt蛋白含量呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。本試驗(yàn)對(duì)鄂抗蟲(chóng)棉1號(hào)不同生長(zhǎng)時(shí)期不同葉位葉片Bt蛋白含量研究發(fā)現(xiàn)；苗期和盛蕾期第1～7葉Bt蛋白含量呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)，而盛花期和盛鈴期第1～7葉Bt蛋白含量呈現(xiàn)出先緩慢升高后逐漸穩(wěn)定的趨勢(shì)，苗期實(shí)驗(yàn)結(jié)果與已有研究結(jié)果不符，可能是由于實(shí)驗(yàn)選用的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉品種不同、采用的Bt蛋白檢測(cè)方法不同或種植地生態(tài)環(huán)境不同等多方面因素影響的結(jié)果。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，抗蟲(chóng)棉生長(zhǎng)發(fā)育后期Bt蛋白含量下降較快，而這個(gè)時(shí)間正好是田間第四代棉鈴蟲(chóng)的高發(fā)時(shí)期，提高Bt蛋白在抗蟲(chóng)棉生長(zhǎng)發(fā)育后期的表達(dá)量是亟待解決的問(wèn)題。

圖1 不同時(shí)期主莖功能葉Bt蛋白含量Fig.1 Contents of Bt protein in main stem functional leaves of different growth stages

圖2 不同時(shí)期主莖不同葉位葉片Bt蛋白含量Fig.2 Contents of Bt protein in main stem leaves of different positions in different growth stages

[1]陳 松，吳敬音，周寶良，等. 轉(zhuǎn)Bt基因棉Bt毒蛋白表達(dá)量的時(shí)空變化[J]. 棉花學(xué)報(bào)，2000，12(4)：189-193.

[2]孫 偉，曹玉洪. 轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉Bt毒蛋白表達(dá)量的時(shí)空變化[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，33(2)：202-203.

[3]李汝忠，沈法富，王宗文，等. 轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉Bt基因表達(dá)的時(shí)空動(dòng)態(tài)[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002(2)：7-9.

[4]姜周庚，張延昭，馮夢(mèng)詩(shī)，等. 高溫脅迫對(duì)盛鈴期Bt棉棉鈴中殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)量及氮代謝的影響[J]. 中國(guó)棉花，2012，39(4)：13-32.

[5]張 祥，王桂霞，顧 超，等. 高溫和濕度對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因棉葉片 Bt 蛋白表達(dá)的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2012，23(11)：3016-3020.

[6]王家寶，王留明，沈法富，等. 環(huán)境因素對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因棉Bt殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)量的影響[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000(6)：4-6.

[7]張桂玲，溫四民. 鹽脅迫對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因棉苗期Bt蛋白表達(dá)量和氮代謝的影響[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20(6)：106-109.

[8]代建龍，董合忠，段留生，等. 施氮肥對(duì)鹽脅迫下Bt棉生長(zhǎng)和葉片Bt蛋白含量的影響[J]. 棉花學(xué)報(bào)，2012，24(4)：303-311.

[9]Narvaez-Vasquez J, Orozca-Cardenas M L, Ryan C A. Differential expression of a chimeric CaMV-tomato proteinase Inhibitor I gene in leaves of transformed nightshade, tobacco and alfalfa plants[J]. Plant Molecular Biology, 1992, 20: 1149-1157.

[10]Mazier M, Chaufaux J, Sanchis V, et al. The cryic gene fromBacillusthuringiensisprovides protection againstSpodopteralittoralisin young transgenic plants[J]. Plant Science, 1997, 127: 179-190.

[11]Pauk J, Stefanov I, Fekete S, et al. A study of different (CaMV 35S and mas) promoter activities and risk assessment of field use in transgenic rapeseed plants[J]. Euphytica, 1995, 85: 411-416.

(責(zé)任編輯 陳 虹)

Study on Bt Protein Differential Expression inBtTransgenic Cotton

CHANG Li-juan, SONG Jun, LIU Wen-juan, ZHANG Fu-li, WANG Dong, YIN Quan, LEI Shao-rong

(Analysis and Test Center, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Sichuan Chengdu 610066 China)

【Objective】Studying on the temporal and spatial dynamics of Bt protein expression in Bt transgenic cotton and determining the relation of Bt protein expression andBttransgenic cotton can effectively reduce the harm of target pests.【Method】In this paper, the Bt protein contents in the different tissues, organs, main stem functional leaves and main stem leaves at different positions of transgenic cotton cultivar(GKl9) in different growth stages were studied. 【Result】The Bt protein contents of all tissues and organs were different, which were in order of seedling>flower>boll> bud>root>stem. There was a reduction tendency of Bt protein in main stem functional leaves in different growth stages with the advance of development. The Bt protein contents among main stem leaves at different positions in different growth stages were obviously different, which indicated the gradual decrease from the first to the seventh leaves in seedling and full budding stage and a gradual stabilization after a slow increase from the first to the seventh leaves in full flowering and bolling stages. 【Conclusion】The Bt protein in all growth periods, all tissues and organs ofBttransgenic cotton were expressed, which changed with temporal and spatial dynamics.

TransgenicBtcotton; ELISA; Content of Bt protein; Differential expression

1001-4829(2017)6-1275-04

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.006

2016-01-20

四川省財(cái)政基因工程項(xiàng)目論文基金(2014LWJJ-011)

常麗娟(1982-)，女，碩士研究生，助理研究員，Email: juanjuanclj@126.com。

S435.622+.9

A