羅 希， 曹 海 龍， 張 卉 妍， 李 悝 悝， 張 春 枝

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034；2.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所， 遼寧 大連 116023 )

以菊粉為底物全細(xì)胞催化生產(chǎn)甘露醇

羅 希1， 曹 海 龍2， 張 卉 妍2， 李 悝 悝2， 張 春 枝1

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034；2.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所， 遼寧 大連 116023 )

將Leuconostocmesenteroides來(lái)源的甘露醇脫氫酶(mdh)及Mycobacteriumvaccae來(lái)源的甲酸脫氫酶(fdh)的共表達(dá)載體pRSFDuet-mdh-fdh，與葡萄糖輔助蛋白(glf)的表達(dá)載體pZY507glf共轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，成功構(gòu)建了一個(gè)可將果糖轉(zhuǎn)化為甘露醇的全細(xì)胞催化劑E.coliBL21(DE3)/pRSFDuet-mdh-fdhpZY507glf。該全細(xì)胞催化劑在pH 6.5、溫度30 ℃時(shí)，具有最高的轉(zhuǎn)化效率，甘露醇的產(chǎn)率可達(dá)到0.91 g/g。通過(guò)與高活力的菊粉酶協(xié)同作用，甘露醇的產(chǎn)率可達(dá)到0.93 g/g。

甘露醇；生物轉(zhuǎn)化法；菊粉；全細(xì)胞催化

0 引 言

甘露醇是一種六元糖醇，在醫(yī)藥、食品、化工和輕工等領(lǐng)域具有十分廣泛的應(yīng)用[1-3]。目前，甘露醇的生產(chǎn)方法有海帶提取法和化學(xué)催化法。其中，海帶提取法生產(chǎn)甘露醇的能耗較高，對(duì)環(huán)境污染較大，正逐漸被淘汰；化學(xué)催化法是目前工業(yè)上普遍采用的甘露醇生產(chǎn)方法，但由于其生產(chǎn)過(guò)程副產(chǎn)大量山梨醇，導(dǎo)致甘露醇的分離成本高昂。因此，開(kāi)發(fā)一種高效、綠色及低成本的甘露醇生產(chǎn)方法具有非常重要的意義。

近年來(lái)，利用微生物轉(zhuǎn)化法進(jìn)行甘露醇生成的研究備受重視[4]。全細(xì)胞催化是介于發(fā)酵法和提取酶催化法之間的一種生物催化技術(shù)[5]。Kaup等[6-7]帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)是最早開(kāi)展全細(xì)胞催化合成甘露醇研究的團(tuán)隊(duì)之一。他們運(yùn)用基因工程的方法，將異源的NADH依賴型的甘露醇脫氫酶和NAD+依賴型甲酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌體內(nèi)，建立了一個(gè)可利用果糖和甲酸作為底物生產(chǎn)甘露醇的全細(xì)胞催化劑。該方法不僅利用細(xì)胞自身產(chǎn)生的輔酶，且輔酶可再生，因而兼具反應(yīng)高效特異及過(guò)程經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)[8]。此后，Carsten等[9]成功在谷氨酸棒狀桿菌中建立了生產(chǎn)甘露醇的全細(xì)胞催化系統(tǒng)。由于大腸桿菌內(nèi)全細(xì)胞催化轉(zhuǎn)化出現(xiàn)輔因子丟失現(xiàn)象，F(xiàn)lorian等[10]優(yōu)化了甘露醇脫氫酶基因，生產(chǎn)甘露醇的能力提高20%。此外，利用磷酸鹽和亞磷酸鹽為大腸桿菌內(nèi)的全細(xì)胞催化提供輔酶，轉(zhuǎn)化糖類生產(chǎn)甘露醇的研究也取得了一定的進(jìn)展[11-13]。

菊粉在菊粉酶的作用下，可水解生成大量的果糖和少量的葡萄糖，是生產(chǎn)制備甘露醇的理想原料[14-15]。利用菊芋中的菊粉進(jìn)行化學(xué)品及燃料的生產(chǎn)已有廣泛的研究報(bào)道[16-17]。目前尚未有利用菊芋中的菊粉為原料，利用全細(xì)胞催化劑生產(chǎn)甘露醇的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立了一個(gè)利用菊粉為原料，通過(guò)全細(xì)胞催化進(jìn)行甘露醇的生產(chǎn)的研究方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株質(zhì)粒、培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

大腸桿菌BL21(DE3)，實(shí)驗(yàn)室保存；共表達(dá)載體pRSFDuet、載體pMcFDH(含MycobacteriumvaccaeN10來(lái)源的甲酸脫氫酶基因fdh)、質(zhì)粒pZY507glf(含運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌來(lái)源的葡萄糖輔助蛋白)均由中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所提供。實(shí)驗(yàn)所用菌株及質(zhì)粒見(jiàn)表1。

表1 大腸桿菌菌株及質(zhì)粒

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1.0%，酵母提取物0.5%，NaCl 1.0%，固體培養(yǎng)時(shí)加2%瓊脂。轉(zhuǎn)化時(shí)加入50 μg/mL卡那霉素(用于篩選pRSFDuet-fdh-mdh質(zhì)粒)，25 μg/mL氯霉素(用于篩選pZY507glf質(zhì)粒)。挑取構(gòu)建的菌株平板單菌落至LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入卡那霉素，37 ℃、200 r/min振蕩過(guò)夜。吸取1 mL轉(zhuǎn)接至100 mL LB培養(yǎng)基中，加入卡那霉素(含質(zhì)粒pZY507glf時(shí)加入氯霉素)培養(yǎng)至OD600為0.5左右，加入0.02 mmol/L IPTG 25 ℃誘導(dǎo)12 h。

1.1.2 試劑與儀器

瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，普通質(zhì)粒小提試劑盒，DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Marker，6×溴酚藍(lán)，限制性內(nèi)切酶，T4連接酶，瓊脂糖，卡那霉素，氯霉素，菊粉酶，胰化蛋白胨，酵母提取物，氯化鈉，輔酶Ⅰ，還原型輔酶Ⅰ，巰基乙醇，葡萄糖，果糖，甘露醇，甲酸鈉，菊粉等。

TC412 PCR，英國(guó)Techne公司；DYCP-31核酸電泳儀，大連捷邁科貿(mào)有限公司；ICS 3000高效液相色譜系統(tǒng)，美國(guó)ESA公司；354酶標(biāo)儀，美國(guó)賽默飛世爾公司；1645050蛋白電泳儀，大連捷邁科貿(mào)有限公司；BIOF 6005A GBN微生物發(fā)酵罐，上海高機(jī)生物工程有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 甘露醇脫氫酶表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)NCBI中公布的Leuconostocmesenteroide甘露醇脫氫酶基因(mdh)序列，委托蘇州金維智公司對(duì)mdh進(jìn)行了密碼子優(yōu)化及全基因合成，并插入到pRSFDuet載體上的NcoⅠ和BamHⅠ位點(diǎn)上，構(gòu)建了甘露醇脫氫酶表達(dá)載體pRSFDuet-mdh。

1.2.2 甲酸脫氫酶和甘露醇脫氫酶共表達(dá)載體的構(gòu)建

以質(zhì)粒pMcFDH為模板，利用上游引物5′-CTACATATGGCAAAGGTCCTGTG-3′ 及下游引物5′-ATAGGTACCTCAGACCGCCTTCT-TGAACTTG-3′對(duì)甲酸脫氫酶基因fdh進(jìn)行克隆。利用NdeⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)，將克隆出的fdh基因插入到pRSFDuet-mdh質(zhì)粒載體上，構(gòu)建出pRSFDuet-mdh-fdh表達(dá)載體。

1.2.3 全細(xì)胞催化劑菌株的構(gòu)建

將質(zhì)粒pRSFDuet-mdh-fdh和質(zhì)粒pZY507glf(葡萄糖輔助蛋白基因)共轉(zhuǎn)入BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中，利用具有卡那霉素抗性和氯霉素抗性的LB固體平板進(jìn)行培養(yǎng)，并將構(gòu)建出的含有兩個(gè)質(zhì)粒的菌株命名為菌株Ⅰ。

1.2.4 相關(guān)酶活力的測(cè)定

1.2.4.1 甘露醇脫氫酶酶活力測(cè)定

0.2 mol/L還原型輔酶Ⅰ，0.2 mol/L D-果糖，0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液pH 6.0，于1 mL體系。在25 ℃條件下，在340 nm波長(zhǎng)下每10 s測(cè)量NADH的吸光度，記錄90 s。以此吸光度的變化率與酶的相關(guān)性確定酶活力。一個(gè)酶活力單位(U)定義:在pH 6.0條件下，1 min氧化1 μmol NADH的酶量。

1.2.4.2 甲酸脫氫酶酶活力測(cè)定

0.2 mol/L甲酸鈉，0.2 mol/L輔酶Ⅰ，0.1 mol/L 磷酸鉀緩沖液pH 7.0，于1 mL體系。在340 nm波長(zhǎng)下每10 s測(cè)量NADH的吸光度，記錄90 s。以此吸光度的變化率與酶的相關(guān)性來(lái)確定酶活力。一個(gè)酶活力單位(U)定義為：在pH 7.0條件下，1 min氧化1 μmol NAD+的酶量。

1.2.4.3 菊粉酶的酶活力測(cè)定

在pH 6.5、30 ℃條件下，每1 min水解菊粉產(chǎn)生1 μmol果糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位[18-19]。測(cè)定540 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.2.5 全細(xì)胞催化實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)化緩沖液pH：誘導(dǎo)條件為25 ℃，時(shí)間為12 h，分別優(yōu)化轉(zhuǎn)化pH 5.5、6.0、6.5、7.0，轉(zhuǎn)化底物為0.1 mol/L果糖和甲酸鈉。用甲酸控制pH，4 h取一次樣液，反應(yīng)48 h。通過(guò)HPLC檢測(cè)分析轉(zhuǎn)化的底物、中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物濃度。

轉(zhuǎn)化溫度：在pH 6.5條件下，分別優(yōu)化轉(zhuǎn)化溫度25、30、35、40 ℃。反應(yīng)過(guò)程同上。

在pH為6.5、溫度為30 ℃條件下，分別添加15和30 U/mL外源菊粉酶，考察其對(duì)甘露醇產(chǎn)率的影響。反應(yīng)過(guò)程同上。

1.2.6 液相分析產(chǎn)物

轉(zhuǎn)化反應(yīng)中轉(zhuǎn)化底物的量及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物甘露醇的量用HPLC的方法測(cè)定。轉(zhuǎn)化反應(yīng)液稀釋后，用0.22 μm濾膜過(guò)濾后即可上樣，上樣量為20 μL。色譜柱為“DIONEX”CarboPacTMPA10(4 mm×250 mm)型陰離子交換柱，流動(dòng)相為18 mmol/L NaOH，柱溫30 ℃，體積流量1 mL/min。檢測(cè)器為脈沖安培電化學(xué)檢測(cè)器。采用外標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)轉(zhuǎn)化體系中的底物、中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 甘露醇脫氫酶基因與甲酸脫氫酶基因共表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)Leuconostocmesenteroides來(lái)源的甘露醇脫氫酶序列(WP_011679419.1)，基于密碼子偏好性對(duì)其進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的序列見(jiàn)圖1。圖1中，粗體部分為mdh基因ORF序列，下劃線部分為酶切位點(diǎn)。將優(yōu)化后的序列交由蘇州金唯智公司進(jìn)行了全基因合成，并將合成后的序列插入到pRSFDuet載體的NcoⅠ和BamHⅠ位點(diǎn)上，獲得了載體pRSFDuet-mdh。

圖1 密碼子優(yōu)化后的甘露醇脫氫酶序列

根據(jù)pMcFDH載體上的甲酸脫氫酶序列，對(duì)甲酸脫氫酶基因進(jìn)行克隆，電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。將該序列和質(zhì)粒pRSFDuet-mdh用NdeⅠ和KpnⅠ進(jìn)行雙酶切并經(jīng)膠回收純化后，利用T4 DNA連接酶連接，得到pRSFDuet-mdh-fdh載體，如圖3所示。

M，BM 15 000 DNA marker； 1，fdh PCR產(chǎn)物

2.2 全細(xì)胞催化劑的構(gòu)建

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒和質(zhì)粒pZY507glf共同轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中異源表達(dá)，通過(guò)SDS-PAGE分析目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，菌株E.coliBL21(DE3)/pRSFDuet-mdh-fdhpZY507glf經(jīng)過(guò)0.02 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后，在36和40 ku處有特異性條帶，與目的蛋白甘露醇脫氫酶和甲酸脫氫酶大小相符。由此可見(jiàn)，該蛋白為誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白。

圖3 mdh和fdh共表達(dá)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)

M，PageRuler prestained protein ladder；1，誘導(dǎo)破壁后上清液；2，未誘導(dǎo)全菌；3，誘導(dǎo)破壁后沉淀

圖4 菌株E.coliBL21(DE3)/pRSFDuet-mdh-fdhpZY507glf的表達(dá)

Fig.4 Expression ofE.coliBL21(DE3)/ pRSFDuet-mdh-fdhpZY507glf

對(duì)表達(dá)的菌株進(jìn)行酶活力測(cè)定，得到甘露醇脫氫酶酶活為5.13 U/mg，甲酸脫氫酶酶活力為5.97 U/mg。

2.3 全細(xì)胞催化反應(yīng)條件優(yōu)化

以果糖為底物，按“1.2.5”的方法，分別考察不同pH和溫度對(duì)甘露醇合成效率的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，pH 6.5、30 ℃分別為該催化反應(yīng)的最適pH和反應(yīng)溫度。

表2 不同pH和溫度條件下果糖全細(xì)胞催化轉(zhuǎn)化甘露醇的產(chǎn)率

Tab.2 Conversion yields of D-fructose to D-mannitol by whole cell biotransformations at different pH and temperature

pH產(chǎn)率/(g·g-1)θ/℃產(chǎn)率/(g·g-1)5．50．56250．71±0．016．00．80±0．09300．916．50．91350．57±0．047．00．80±0．02400．25±0．01

2.4 外源添加菊粉酶對(duì)甘露醇產(chǎn)率的影響

以菊粉為底物，外源添加菊粉酶，添加量分別為15和30 U/mL，制備甘露醇。在pH 6.5、30 ℃ 條件下反應(yīng)48 h，每4 h取樣，結(jié)果如圖5所示。

(a) 添加15 U/mL菊粉酶

(b) 添加30 U/mL菊粉酶

圖5 外源添加菊粉酶對(duì)甘露醇產(chǎn)率的影響

Fig.5 Biotransformations of inulin to D-mannitol with extracellular inulinase supplementation

由圖5可知，在反應(yīng)體系中加入兩種用量菊粉酶后，果糖和葡萄糖的濃度在4 h后大幅提高，表明菊粉被快速水解；但反應(yīng)進(jìn)行到8 h，圖5(b) 中果糖濃度進(jìn)一步提高，而圖5(a)中果糖濃度則有所降低，表明15 U/mL菊粉酶添加量不能滿足體系中菊粉的完全水解。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到48 h，兩種不同菊粉酶添加量反應(yīng)均有一定量的果糖剩余，此時(shí)甘露醇的產(chǎn)率分別為0.78和0.93 g/g。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了質(zhì)粒pRSFDuet-mdh-fdh，與pZY507glf共同轉(zhuǎn)入大腸桿菌內(nèi)成功表達(dá)。利用構(gòu)建的全細(xì)胞催化劑E.coliBL21(DE3)/pRSFDuet-mdh-fdhpZY507glf，以果糖為底物，在不同溫度及pH條件下進(jìn)行全細(xì)胞催化實(shí)驗(yàn)，得到了最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件。通過(guò)與高活力的菊粉酶協(xié)同，實(shí)現(xiàn)了以菊粉為底物利用全細(xì)胞催化進(jìn)行甘露醇的合成，在菊粉酶添加量為30 U/mL時(shí)甘露醇的產(chǎn)率可達(dá)到0.93 g/g。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果拓寬了全細(xì)胞催化合成甘露醇路線的底物范圍，為建立以能源植物菊芋中的菊粉為底物實(shí)現(xiàn)甘露醇的高效合成提供了參考。

[1] 朱豫.利用乳酸菌發(fā)酵糖化菊芋汁生產(chǎn)甘露醇的研究[D].大連:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所,2009.

[2] 黎穎.甘露醇的性質(zhì)、生產(chǎn)與發(fā)展建議[J].廣西化工,1999,28(4):29-33.

[3] 金紅星,成文玉.明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造,2012,31(10):4-6.

[4] 樊潔,韓燁,周志江,等.微生物發(fā)酵法生產(chǎn)糖醇的研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵科技,2013,49(5):94-98.

[5] 萬(wàn)紅貴,趙宗松,蔣導(dǎo)航,等.微生物全細(xì)胞催化技術(shù)在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(4):1917-1919.

[6] KAUP B, BRINGER-MEYER S, SAHM H. Metabolic engineering ofEscherichiacoli: construction of an efficient biocatalyst for D-mannitol formation in a whole-cell biotransformationtion[J]. Applied Microbiology Biotechnology, 2004, 64(3): 333-339.

[7] KAUP B, BRINGER-MEYER S, SAHM H. D-Mannitol formation form D-glucose in a whole-cell biotransformation with recombinantEscherichiacoli.[J]. Applied Microbiology Biotechnology, 2005, 69(4): 397-403.

[8] SAHA C B, RACINE F M. Biotechnological production of mannitol and its applications[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, 89(4): 879-891.

[10] HEUSER F, MARIN K, KAUP B, et al. Improving D-mannitol productivity ofEscherichiacoli: impact of NAD, CO2and expression of a putative sugar permease fromLeuconostocpseudomesenteroides[J]. Metabolic Engineering, 2009, 11(3): 178-183.

[11] RESHAMWALA S M S, PAGAR S K, VELHAL V S, et al. Construction of an efficientEscherichiacoliwhole cell biocatalyst for D-mannitol production[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2014, 118(6): 628-631.

[12] JACOBSEN J H, FRIGAARD N U. Engineering of photosynthetic mannitol biosynthesis from CO2in a cyanobacterium[J]. Metabolic Engineering, 2014, 21: 60-70.

[14] 岳敏,曹海龍,李曙光,等.誘變選育以菊芋為原料高產(chǎn)甘露醇的乳酸菌[J].中國(guó)釀造,2012,31(9):53-56.

[15] 齊國(guó)超.菊芋組織培養(yǎng)及分子生物學(xué)研究現(xiàn)狀[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2015(3):151-154.

[16] CURCIO S, RICCA E, SARACENO A, et al. A mass transport/kinetic model for the description of inulin hydrolysis by immobilized inulinase[J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2015, 90(10): 1782-1792.

[17] 劉宏.菊粉的功能特性與開(kāi)發(fā)應(yīng)用[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng),2010(12):25-27.

[18] WANG L, HUANG Y, LONG X, et al. Cloning of exoinulinase gene fromPenicilliumjanthinellumstrain B01 and its high-level expression inPichiapastoris[J]. Journal of Applied Microbiology, 2011, 111(6): 1371-1380.

[19] 李益民,高教琪,袁文杰,等.菊粉酶基因的異源表達(dá)、分離純化及酶學(xué)性質(zhì)[J].生物工程學(xué)報(bào),2015,31(5):670-681.

[20] 顧夕梅,陳曉佩,奚曉桐,等.菊粉酶及其制備低聚果糖研究進(jìn)展[J].廣東化工,2014,41(7):95-96.

The whole cell catalytic production of mannitol using inulin as substrate

LUO Xi1, CAO Hailong2, ZHANG Huiyan2, LI Kuikui2, ZHANG Chunzhi1

( 1.School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2.Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China )

A whole-cell biotransformation systemE.coliBL21(DE3)/pRSFDuet-mdh-fdhpZY507glffor mannitol production were established through the mannitol dehydrogenase (mdh) derived fromLeuconostocmesenteroidesand the formate dehydrogenase gene (fdh) derived fromMycobacteriumvaccaepRSFDuet-mdh-fdhwith the glucose facilitator protein (glf) pZY507glfco-expressed inE.coliBL21(DE3). The yield of mannitol could reach to 0.91 g/g under the optimum conditions of pH 6.5 at 30 ℃. The yield of mannitol could reach to 0.93 g/g by whole catalyst with high activity inulinase.

mannitol; biotransformation; inulin; whole cell catalysis

2016-03-11.

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)項(xiàng)目(2014AA093511).

羅 希(1990-)，女，碩士研究生；通信作者：張春枝(1963-)，女，教授.

TS202.1；Q819

A

1674-1404(2017)04-0235-05

羅希,曹海龍,張卉妍,李悝悝,張春枝.以菊粉為底物全細(xì)胞催化生產(chǎn)甘露醇[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,36(4):235-239.

LUO Xi, CAO Hailong, ZHANG Huiyan, LI Kuikui, ZHANG Chunzhi. The whole cell catalytic production of mannitol using inulin as substrate[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(4): 235-239.