郭朝群,孫建赟,袁莉莉,曹 燦,丁賢慧,黃顯軍,葛 良,周志明

(1.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，安徽 蕪湖 241001；2.皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，安徽 蕪湖 241000)

CYP2C19、PON1基因多態(tài)性與腦梗死患者氯吡格雷治療預(yù)后的相關(guān)性研究

郭朝群1,孫建赟1,袁莉莉1,曹 燦2,丁賢慧1,黃顯軍1,葛 良1,周志明1

(1.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，安徽 蕪湖 241001；2.皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，安徽 蕪湖 241000)

目的：探討大動(dòng)脈粥樣硬化型腦卒中(LAA)患者服用氯吡格雷短期預(yù)后與CYP2C19、PON1基因多態(tài)性的關(guān)系。方法：對(duì)最終入組的96例首發(fā)LAA患者給予阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷治療30 d，后氯吡格雷單藥長(zhǎng)期治療，治療前及3個(gè)月后對(duì)患者進(jìn)行改良RANKIN量表(mRS)評(píng)分，mRS≤2表示預(yù)后好，mRS>2表示預(yù)后差；使用非擴(kuò)增熒光染色原位雜交技術(shù)進(jìn)行基因分型。通過比較各種基因型與mRS評(píng)分的相關(guān)性，判斷患者預(yù)后與上述兩種基因的基因多態(tài)性之間的關(guān)系，mRS≤2表示預(yù)后好，mRS>2表示預(yù)后差。結(jié)果：治療前，CYP2C19三種不同基因型與患者mRS評(píng)分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，3個(gè)月后，CYP2C19三種基因型與mRS評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P﹤0.05)，攜帶有CYP2C19 EM型等位基因的患者預(yù)后較好(P﹤0.05)，即未攜帶CYP2C19無功能等位基因的患者預(yù)后較攜帶者好。治療前，PON1 (576G>A)三種基因型與患者mRS評(píng)分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，3個(gè)月后預(yù)后改善在三種基因型之間亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論：大動(dòng)脈粥樣硬化性卒中患者服用氯吡格雷后短期預(yù)后與 CYP2C19基因多態(tài)性有關(guān)。

CYP2C19；PON1 (576G>A)；基因多態(tài)性；大動(dòng)脈粥樣硬化性腦卒中；氯吡格雷

急性缺血性腦卒中是神經(jīng)科常見疾病，具有高發(fā)病率、致殘率等特點(diǎn)[1]。按TOAST分型，缺血性腦卒中可分為：大動(dòng)脈粥樣硬化性卒中(large artery atherosclerotic，LAA)、心源性腦栓塞(cardioembolism,CE)、小動(dòng)脈閉塞性卒中或腔隙性卒中(small-artery occlusion lacunary,SAA)、不明原因的缺血性卒中(stroke of other undetermined etiology,SUE)、其他原因性卒中(acute stroke of other determined etiology,SOE)。其中，LAA型臨床最多見，建議口服抗血小板藥物預(yù)防腦卒中復(fù)發(fā)及其他心血管事件發(fā)生(ⅠA)[2]。 迄今為止，抗血小板最佳推薦藥物為阿司匹林或氯吡格雷[2]，氯吡格雷較阿司匹林在減少急性缺血性腦卒中風(fēng)險(xiǎn)方面更占優(yōu)勢(shì)[3]。然而，常規(guī)劑量氯吡格雷治療時(shí)，并非所有患者都能達(dá)到很好臨床效果，可能由氯吡格雷抵抗[4]所致。氯吡格雷經(jīng)腸道吸收入血后需經(jīng)CYP2C19基因編碼的肝臟細(xì)胞色素P450酶系氧化，再經(jīng)對(duì)氧磷酶-1(PON1)等水解形成活性產(chǎn)物從而發(fā)揮抗血小板聚集作用。本研究旨在探討CYP2C19、PON1 (576G>A)基因多態(tài)性與LAA患者接受氯吡格雷治療后神經(jīng)功能的恢復(fù)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象 本研究所有患者為2016年1～9月弋磯山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的96例首發(fā)的LAA患者(男69例，女27例，年齡18～80歲)。入組標(biāo)準(zhǔn)：①發(fā)病時(shí)間<7 d；②符合2010 年《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南》提出的急性缺血性腦卒中標(biāo)準(zhǔn)；③經(jīng)心電圖、心臟彩超、頭顱CT、頭顱MRI及腦血管造影術(shù)等相關(guān)檢查排除其他缺血性腦卒中亞型；④3個(gè)月隨訪，并順利完成mRS評(píng)分[5]；⑤均簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)為：①對(duì)阿司匹林或氯吡格雷過敏或不可耐受者；②患有血液系統(tǒng)疾病、出血性疾病或存在出血傾向者；③嚴(yán)重肝腎功能障礙者；④合并其他嚴(yán)重軀體疾病者，如腫瘤、嚴(yán)重的冠心病、某一臟器功能不全者等。

1.2 方法

1.2.1 藥物治療方法 所有患者首次給予氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林治療 30 d(氯吡格雷首日負(fù)荷量 300 mg，繼之 50 mg /d，阿司匹林 100 mg/d)，1個(gè)月后以氯吡格雷單藥治療(50 mg / d)，總療程為90 d。

1.2.2 分組(神經(jīng)功能恢復(fù)情況) 對(duì)入組患者治療前及治療3個(gè)月后改良Rankin量表(Modified RANKIN scale，mRS)評(píng)分[5]，根據(jù)評(píng)分結(jié)果，mRS≤2分為良好組(good prognosis)；3≤mRS≤6分為不良組(poor prognosis)。

1.2.3 CYP2C19、PON1 (576G>A)基因型測(cè)定 使用非擴(kuò)增的熒光染色原位雜交技術(shù)(“北京精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)平臺(tái)”分析軟件)檢測(cè)方法對(duì)患者靜脈血進(jìn)行CYP2C19及PON1 (576G>A)基因型測(cè)定。①血液樣本制備：先將預(yù)處理液(10×NH4Cl)與雙蒸水按1∶9比例配置成1×NH4Cl的工作液，取若干1.5 mL離心管，然后將EDTA抗凝管采集到的臨床靜脈血液150～200 μL及1.2 mL的上述工作液中分別加入至離心管中，3000 r/min離心后棄上清，沉淀加入30～50 μL耀金保(核酸純化試劑，北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司)，得到白細(xì)胞混懸液。取1.5 μL白細(xì)胞混懸液加到1支耀金染試劑(地高辛染色液，北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司)中，充分混均并短暫離心，完成后蓋緊管蓋，置入熒光檢測(cè)儀；②采用熒光染色原位雜交及染色體核型分析系統(tǒng)自動(dòng)判讀熒光信號(hào)值，獲取熒光曲線圖，進(jìn)行CYP2C19*2(681G>A)、CYP2C19*3(636G>A)、PON1 (576G>A)基因分型，并作陽性質(zhì)控。

1.2.4 臨床分型 據(jù)CYP2C19基因檢測(cè)結(jié)果，將CYP2C19編碼的藥物代謝酶CYP2C19分為弱代謝型(PM型CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3、CYP2C19*3/*3)、中間代謝型(IM型CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3)及強(qiáng)代謝型(即正常代謝型)(EM 型，CYP2C19*1/*1)[6]；據(jù)PON1 (576G>A)基因檢測(cè)結(jié)果，將PON1編碼的藥物水解酶PON1分為：野生型(GG)、突變雜合型(GA)、突變純合型(AA)[7]。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17．0軟件分析數(shù)據(jù)?？ǚ綑z驗(yàn)用來比較患者在入院時(shí)及隨訪3個(gè)月時(shí) mRS 評(píng)分與CYP2C19、PON1 (576G>A)基因每三種變異型的關(guān)系。如患者mRS評(píng)分與上述基因有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，再分別將上述三種變異基因型的預(yù)后率進(jìn)行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 本研究入組患者130例，存在出血傾向13例，合并其他疾病8例，無法完成隨訪及mRS評(píng)分13例，最終共96例(男69例，女27例，年齡18～80歲)LAA患者入組，根據(jù)mRS評(píng)分分為良好(mRS≤2：治療前24例/治療后3個(gè)月71例)，不良(3≤mRS≤6：治療前72例/治療后3個(gè)月25例)。

2.2 基因檢測(cè)結(jié)果 據(jù)CYP2C19基因檢測(cè)結(jié)果,CYP2C19*2和 CYP2C19*3分為野生純合型(GG)、突變雜合型(GA)和突變純合型(AA)[8]，據(jù)PON1 (576G>A)基因檢測(cè)結(jié)果，將PON1編碼的藥物水解酶PON1分為：野生型(GG)、突變雜合型(GA)、突變純合型(AA)[7]?；颊邿晒馇€圖分別見圖1～3。

圖1 CYP2C19*2基因分型及熒光曲線圖

圖2 CYP2C19*3基因分型及熒光曲線圖

圖3 PON1 (576G>A)基因分型及熒光曲線圖

2.3 CYP2C19 基因多態(tài)性與患者預(yù)后 治療前，mRS≤2組中EM、IM、PM 所占比例分別為28.6%、21.6% 、23.5%，CYP2C19三種不同基因型患者 mRS 評(píng)分比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。3個(gè)月后，mRS≤2組中EM、IM、PM 所占比例分別為 90.5%、59.5%、64.7%，3組患者mRS評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)；EM組患者的預(yù)后良好率與IM、PM組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

表1 不同CYP2C19 基因型mRS 評(píng)分比較

時(shí)間EM(good/poor)IM(good/poor)PM(good/poor)χ2P治療前12/30(28.6%)8/29(21.6%)4/13(23.5%)0.5310.7673個(gè)月后38/4(90.5%)22/15(59.5%)11/6(64.7%)10.7440.005

注：*P<0.05，**P<0.01。

圖4 CYP2C19 三種基因型預(yù)后良好率之間的比較

2.4 PON1 (576G>A)與患者預(yù)后治療前及治療3個(gè)月后，PON1 (576G>A)三種基因型 mRS評(píng)分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。

表2 不同PON1 (576G>A) 基因型mRS 評(píng)分比較

時(shí)間GG(good/poor)GA(good/poor)AA(good/poor)χ2P治療前5/29(14.7%)14/28(33.3%)5/15(25%)3.4770.1763個(gè)月后26/8(76.5%)32/10(76.2%)13/7(65%)1.0530.591

3 討論

我們通過比較患者在入院及治療3個(gè)月后mRS評(píng)分與CYP2C19、PON1 (576G>A)三種基因型的關(guān)系，探究LAA的短期預(yù)后與CYP2C19、PON1 (576G>A)基因多態(tài)性的關(guān)系。攜有CYP2C19 EM型等位基因的患者預(yù)后較好，而攜帶IM等位基因患者預(yù)后較PM者無顯著不同。而治療前及治療3個(gè)月后PON1 (576G>A)的三種基因型預(yù)后均無明顯差異。

氯吡格雷經(jīng)腸道吸收、肝臟代謝活化、有所選擇的且不可逆地阻斷了ADP與血小板膜表面ADP受體(P2Y12)的結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮抑制血小板聚集的作用[9]。其低反應(yīng)性是多因素的，如患者的依從性、吸收或代謝功能、藥物反應(yīng)等，然而基因多態(tài)性占有較大比重，且其潛在機(jī)制不明[10]。它在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化是在各種酶的參與下共同完成，包括PON1、CYP2C19、ABCB1、CYP3A4、CYP3A5酶等，而CYP2C19、PON1基因多態(tài)性對(duì)氯吡格雷代謝的影響越來越受重視。氯吡格雷療效欠佳可能與CYP2C19基因多態(tài)性有關(guān)[11]。CYP2C19*2基因型是CYP2C19第5外顯子在第681位的突變(681G/A)，可造成外顯子5′端40 bp堿基缺失，改變mRNA閱讀框架，產(chǎn)出無功能蛋白(CYP2C19*2)酶[12]。CYP2C19*3基因型是第4外顯子在第636位的突變(636G/A)造成終止碼提前，產(chǎn)生出代謝功能極低的CYP2C19*3酶[12]。這兩種蛋白均難以將氯吡格雷代謝轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物，嚴(yán)重影響其抗血小板功能。亞洲人群常見等位基因是CYP2C19*1，CYP2C19*2及CYP2C19*3，野生型為CYP2C19*1，突變型為CYP2C19*2及CYP2C19*3。研究發(fā)現(xiàn)，攜帶1個(gè)或大于1個(gè)CYP2C19等位基因(*2或*3)的變異性基因，可明顯降低氯吡格雷抗血小板聚集效果，發(fā)生更高比率的心腦血管不良事件[13]。故Parég等[6]將只有野生型等位基因的 CYP2C19* 1 /* 1 來定義為EM 型，攜帶一種無功能等位基因的CYP2C19*1/*2或CYP2C19*1/*3來定義為 IM型，而攜帶兩種無功能等位基因的CYP2C19* 2 /* 3，CYP2C19* 2 / * 2，CYP2C19 * 3 / * 3 來定義為 PM型。我們對(duì)CYP2C19基因多態(tài)性的研究與上述研究結(jié)果一致。也有學(xué)者指出PON1 (576G>A)基因多態(tài)性與氯吡格雷療效有關(guān)[14]。PON1由肝臟合成，其在血清中和載脂蛋白A1緊密結(jié)合是借助于極端疏水的N端，是氯吡格雷代謝關(guān)鍵酶，參與調(diào)控PON1轉(zhuǎn)錄與翻譯。Bouman等[14]發(fā)現(xiàn)PON1是氯吡格雷生物代謝的關(guān)鍵酶，在氯批格雷由中間產(chǎn)物代謝轉(zhuǎn)化為有活性的硫醇終產(chǎn)物過程中起重要作用。PON1QQ192純合子個(gè)體相對(duì)于RR192純合子有著更高的支架血栓形成風(fēng)險(xiǎn)，更低的PON1活性產(chǎn)物及抗血小板聚集效果，故他們認(rèn)為PON1是氯吡格雷的主要決定因素，多項(xiàng)研究支持這些結(jié)果[15]。但另有研究提出相反結(jié)論[16]。Hulot等[17]研究發(fā)現(xiàn)PON1基因突變體并不會(huì)影響到氯吡格雷藥物代謝動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)及心肌梗死患者的臨床效果。Dirk等[18]在歐美人群中同樣發(fā)現(xiàn) PON1 基因 Q192R 多態(tài)位點(diǎn)與 CR 發(fā)生無明顯相關(guān)關(guān)系。本試驗(yàn)的研究結(jié)果與Dirk的研究成果一致，PON1 (576G>A)多態(tài)性和氯吡格雷抵抗無關(guān)系。

我們的研究觀察了氯吡格雷與預(yù)后的關(guān)系，為氯吡格雷用藥提出了指導(dǎo)性建議，同時(shí)支持了既往的研究結(jié)果。但本研究樣本較少，未來尚需進(jìn)一步研究。

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Correlation analysis between the CYP2C19 and PON1 gene polymorphism and prognosis of cerebral infraction patients following clopidogrel therapy

GUO Chaoqun,SUN Jianyun,YUAN Lili,CAO Can,DING Xianhui,HUANG Xianjun,GE Liang,ZHOU Zhiming

Department of Neurology,The First Affiliated Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241001,China

Objective：To investigate the relationship between CYP2C19 and PON1 gene polymorphisms and the prognosis in patients with large artery atherosclerotic stroke following medication of clopidogrel.Methods: Ninety-six patients with first large artery atherosclerotic stroke attack were included and given clopidogrel plus aspirin medication for 30 days,followed by simple chronic clopidogrel regimen.Modified RANKIN scale(mRS)was used before and 3 months after medication to assess the therapeutic effects.Patients with mRS scoring ≤ 2 were considered as ′good prognosis′,and those with mRS scoring>2 were considered as ′poor prognosis′.The genotypes of CYP2C19 and PON1 (576G>A) were detected with non-amplified fluorescent dyes in situ hybridization technique,and compared with the mRS scoring for estimating the relationship between the CYP2C19 and PON1 (576G>A) polymorphisms and prognosis following medication.Results: The difference was not significant between mRS scores and different three genotypes of CYP2C19 in patients before therapy,yet the difference was significant 3 months after medication(P<0.05),and patients with CYP2C19 EM alleles had better prognosis than those with CYP2C19 with loss-of-functional alleles(P<0.05).The three genotypes for PON1 (576G>A) remained no statistical difference with mRS scores before therapy 3 months after medication(P>0.05).Conclusion: The prognosis appears to be associated with CYP2C19 gene polymorphism in patients with large artery atherosclerotic stroke following short use of clopidogrel.

CYP2C19；PON1 (576G>A)；gene polymorphisms；large artery atherosclerotic stroke；clopidogrel

1002-0217(2017)04-0329-04

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81171110)

2016-12-12

郭朝群(1990-)，女，2015級(jí)碩士研究生，(電話)18895375296，(電子信箱)18895375296@163.com; 周志明，男，主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師,(電子信箱)neuro_depar@hotmail.com,通信作者。

R 543;R 743.3

A

10.3969/j.issn.1002-0217.2017.04.007