姬曉曦，馬 鶯

(哈爾濱工業(yè)大學(xué) 化工與化學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150090)

水牛和奶牛乳脂肪球膜蛋白組成和功能性的比較

姬曉曦，馬 鶯

(哈爾濱工業(yè)大學(xué) 化工與化學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150090)

為比較不同乳源的乳脂肪球膜蛋白(MFGMPs)蛋白質(zhì)組成、含量和功能差異，用iTRAQ技術(shù)對水牛和奶牛MFGMPs進(jìn)行分離、比較.采用Nano-HPLC-MS聯(lián)合Q-Exactive的方法，對MFGMPs進(jìn)行分離和鑒定，共鑒定出FDR≤0.01%的蛋白質(zhì)424個(gè)，差異極顯著蛋白146個(gè)，其中2倍(水牛/奶牛)上調(diào)蛋白20個(gè)，下調(diào)蛋白25個(gè).水牛MFGMPs差異蛋白為磷酸鈉溶質(zhì)載體蛋白和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，這兩種蛋白具有載體和催化活性，為生物體的合成、代謝提供基本組分.奶牛MFGMPs差異蛋白為黃嘌呤氧化還原酶和嗜乳脂蛋白，這兩種蛋白屬于結(jié)合蛋白，具有抑制腫瘤細(xì)胞的功能特性.結(jié)果表明，奶牛和水牛MFGMPs中部分功能性蛋白在含量上存在一定的差異.

奶牛；水牛；MFGMPs；蛋白質(zhì)組；功能特性；iTRAQ

乳脂肪球由乳腺上皮分泌細(xì)胞形成，先在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成乳脂肪球前體，并從細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中穿過形成小的脂肪液滴，然后由極性脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成的非雙分子層物質(zhì)包裹起來，最終形成乳脂肪球[1]，這層非雙分子層物質(zhì)，即為乳脂肪球膜(MFGM).MFGM由磷脂、鞘脂類、糖脂、膽固醇和蛋白質(zhì)組成[2]，具有抑制癌細(xì)胞[3]、治療孤獨(dú)癥[4]、抗菌[5]、抗黏附性[6]等功能.目前已分離并純化出的奶牛MFGMPs主要有黏蛋白、黃嘌呤氧化酶、嗜乳脂蛋白、脂肪分化相關(guān)蛋白、脂肪酸結(jié)合蛋白等40多種蛋白質(zhì)[7].隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對MFGM蛋白的組成和特性有了新的認(rèn)識.近年來對奶牛MFGM蛋白的研究較多，但是關(guān)于水牛MFGM蛋白的組成和特性的研究鮮有報(bào)道.

同位素相對和絕對定量標(biāo)記(iTRAQ)技術(shù)是一種在同位素親和標(biāo)記(iCAT)技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，可同時(shí)標(biāo)記8種蛋白質(zhì)樣品.該技術(shù)對樣品的氨基基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記，經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜分離后，通過查詢數(shù)據(jù)庫對結(jié)果蛋白進(jìn)行定性定量分析.iTRAQ技術(shù)能鑒定任何類型的蛋白，靈敏度高，對結(jié)果蛋白可定性定量并分析其功能特性[8].

近年來，iTRAQ技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用.Shi等[9]用iTRAQ結(jié)合LC-MS/MS的方法，比較了非油性釀酒酵母和產(chǎn)油白色隱球酵母、圓紅冬孢酵母的不同脂質(zhì)積累階段的蛋白質(zhì)組，生長初期分離出132個(gè)蛋白，中、后期分別分離出122個(gè)和116個(gè).Wu等[10]對DIGE(熒光差異凝膠電泳)、iCAT和iTRAQ技術(shù)進(jìn)行了比較.結(jié)果表明，iTRAQ技術(shù)可以鑒定出iCAT技術(shù)不能表達(dá)的蛋白和超出DIGE技術(shù)使用范圍的蛋白，且iTRAQ技術(shù)具有分離鑒定的蛋白質(zhì)種類更廣、數(shù)量更多、靈敏度更高、誤差更小等優(yōu)點(diǎn)[11].

本文采用iTRAQ聯(lián)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對奶牛和水牛MFGM蛋白質(zhì)組進(jìn)行混標(biāo)、分離及精確定量蛋白質(zhì)組分，并通過數(shù)據(jù)庫和分析軟件，查詢、分析蛋白質(zhì)組的詳細(xì)信息，進(jìn)一步討論差異性蛋白的生物學(xué)特性，目的是對奶牛和水牛MFGMPs組成和特性進(jìn)行深入了解，為MFGMPs的開發(fā)、利用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

儀器：TrippleTOFTM5600質(zhì)譜儀(AB SCIEX)、AKTA Purifier 100純化儀(GE Healthcare)、600 V電泳儀(GE Healthcare EPS601).

藥品：iTRAQ 8標(biāo)試劑盒(AB SCIEX)、BCA 蛋白定量試劑盒(Pierce)、乙腈(Acetonitrile)，丙烯腈(默克)、C18 Cartridge(66872-U sigma).

1.2 樣品采集

奶牛乳取自黑龍江省哈爾濱市牧場，水牛乳取自廣西壯族自治區(qū)水牛研究所.本實(shí)驗(yàn)?zāi)虡訛?0～80頭不同泌乳期的牛乳混合樣.樣品取出后12 h內(nèi)送入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn).

1.3 MFGMPs的分離和蛋白含量的測定

參照Pisanu等[12]方法用酸沉將酪乳中的MFGMPs沉淀，高速離心分離出來，凍干備用.用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測定樣品中的蛋白質(zhì)濃度.

1.4 SDS-PAGE電泳分離MFGM樣品

取過濾后的樣品，加入上樣緩沖液(樣品∶緩沖液=5∶1 (v/v))，沸水浴后高速短時(shí)離心，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離(14 mA×90 min)，分離膠片進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色.

盡管將輕罪范圍拓展至行政違法領(lǐng)域具有正當(dāng)性，但是，這也并不意味著必須要將所有的治安或行政違法行為均納入輕罪的范圍。因?yàn)?，我國幅員遼闊、人口眾多，而且當(dāng)下正處于社會轉(zhuǎn)型期，社會矛盾較為復(fù)雜，各種違法犯罪層出不窮、數(shù)量浩繁，如果將其全部納入刑法典，通過司法程序定罪處刑，則司法機(jī)關(guān)能否有效承受，就是一個(gè)不得不面對的重大難題。所以，制裁效率方面的問題也必須要予以考慮。

1.5 聯(lián)合納升液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜分析

1.5.1 酶解、肽段定量及標(biāo)記

樣品加入DTT，沸水浴.冷卻后依次加入尿素緩沖液、UA 緩沖液和IAA溶液，離心.依次加入尿素緩沖液和溶解緩沖液，離心后振蕩.靜置過夜后離心，OD280肽段定量[13].根據(jù)iTRAQ 8標(biāo)試劑盒說明書對樣品進(jìn)行標(biāo)記，奶牛和水牛樣品分別被標(biāo)記為113和115.1.5.2 毛細(xì)管高效液相色譜和質(zhì)譜分析

采用納升流速HPLC液相系統(tǒng)Easy Nano-LC分離.色譜柱以95%的緩沖液A(0.1%甲酸水溶液)平衡，樣品富集到上樣柱(2 cm×100 μm，5 μm-C18)，再經(jīng)過分析柱(75 μm×100 mm，3 μm-C18)分離肽段.在質(zhì)荷比為300～1800 m/z進(jìn)行1次全掃描的質(zhì)譜分析，檢測正離子，時(shí)長240 min.

1.5.3 數(shù)據(jù)分析

采用Proteome Discoverer 1.4和Mascot 2.2對肽段報(bào)告離子峰強(qiáng)度值進(jìn)行定量分析.用數(shù)據(jù)庫uniprot_cetartiodactyla.fasta查詢蛋白質(zhì)組的信息.

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白質(zhì)定量及SDS-PAGE電泳分離

采用BCA試劑盒測定奶牛和水牛MFGMPs濃度分別為10.8 μg/μL和3.13 μg/μL.MFGMPs樣品的SDS-PAGE分離如圖1所示.圖1中A為奶牛MFGM蛋白,B為水牛MFGM蛋白.

圖1 奶牛和水牛MFGM蛋白樣品的SDS-PAGE分離

由圖1可見，奶牛和水牛MFGMPs在97.4-66.2 kDa和35.0-20.1 kDa兩個(gè)區(qū)段條帶數(shù)目有明顯的差異，在66.2-43.0 kDa和15.0-14.4 kDa兩個(gè)區(qū)段條帶深淺有明顯差異.說明兩組樣品的蛋白質(zhì)在種類和含量上均存在差異,在進(jìn)一步研究中，采用二維色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對MFGMPs的組成及相對含量進(jìn)行分離和鑒定的進(jìn)一步分析.

奶牛和水牛MFGMPs經(jīng)質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)分析共定量鑒定出奶牛MFGMPs為424個(gè)，水牛為422個(gè).Ma[14]采用無標(biāo)記法定量測定出奶牛MFGMPs為460個(gè)，水牛為330個(gè).本研究測定出的蛋白質(zhì)有407個(gè)具有功能性.對于蛋白質(zhì)功能性的分類參照基因本體(gene ontology，GO)的方法進(jìn)行[15](圖2)，涵蓋生物學(xué)的3個(gè)方面：即分子功能、細(xì)胞組分和生物過程.

從圖2的結(jié)果可以看出，具有催化活性和蛋白質(zhì)結(jié)合功能的蛋白最多，其次為核苷酸結(jié)合域； 46.46%的蛋白質(zhì)參與了生物代謝過程，其次是應(yīng)激反應(yīng)和生物過程調(diào)節(jié)；分別有43.40%和42.69%的蛋白質(zhì)處在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中.

在水牛MFGMPs中未檢出開創(chuàng)性核糖核酸酶和Uncharacterized protein(AC：F1ML83).前者處在胞外基質(zhì)，具有酶催化活性，參與生物體代謝過程；后者在細(xì)胞膜上.核糖核酸酶作為一種核酸水解酶模型蛋白常被應(yīng)用在分子生物學(xué)中[16]，與生物的器官生成、宿主防御機(jī)制、控制腫瘤血管生成、殺滅腫瘤細(xì)胞和抑制病毒復(fù)制等[17]有關(guān).牛乳開創(chuàng)性核糖核酸酶是RNaseA的同系物，具有特異性抗腫瘤、無精子生成和免疫抑制力活性[18].

圖2 奶牛和水牛MFGMPs的GO功能分類

2.3 奶牛和水牛乳脂肪球膜蛋白質(zhì)顯著差異蛋白功能活性分析

對奶牛和水牛MFGM蛋白質(zhì)組中146個(gè)蛋白含量差異極顯著蛋白質(zhì)的GO功能進(jìn)行分析歸類，結(jié)果如圖3所示.

具有蛋白質(zhì)結(jié)合和催化活性的蛋白質(zhì)最多；大部分的蛋白質(zhì)處在膜上；參與的生物過程最多為代謝過程.圖3的結(jié)果與圖2幾乎完全一致，說明差異顯著性蛋白表現(xiàn)出的功能特性和生物功能可以代表已鑒定蛋白的功能特性.

圖3 奶牛和水牛MFGM差異顯著蛋白GO功能分類

2.4 奶牛和水牛乳脂肪球膜蛋白顯著差異蛋白的比較

為表征奶牛和水牛MFGMPs之間的差異表達(dá)，以奶牛MFGMPs為內(nèi)參對鑒定出的蛋白質(zhì)分析比對，得到差異極顯著(p≤0.01)蛋白146個(gè).在這些蛋白中以2倍(水牛/奶牛)蛋白質(zhì)相對含量的比值為限定標(biāo)準(zhǔn)，確定上調(diào)和下調(diào)蛋白質(zhì)的組成，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1.

由表1可見，在147個(gè)差異蛋白中共得出上調(diào)蛋白20個(gè)，下調(diào)蛋白25個(gè).在上調(diào)蛋白中，水牛MFGMPs中的磷酸鈉溶質(zhì)載體和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)顯著地高于牛乳.上調(diào)蛋白中有7個(gè)蛋白屬于結(jié)合蛋白；處在膜上的蛋白有14個(gè)；參與生物體轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝過程和應(yīng)激反應(yīng)作用的蛋白各有7個(gè).和奶牛相比，水牛MFGMPs具有更多的載體活性和催化活性，參與生物體的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，為生物體內(nèi)的合成、代謝供應(yīng)必要的成分.

表1 奶牛和水牛MFGMPs中的差異蛋白

在下調(diào)蛋白中，黃嘌呤氧化還原酶(XOR)、糖蛋白2(GP-2)、糖基化依賴性細(xì)胞黏附分子1(GlyCAM-1)在奶牛MFGMPs中的含量顯著地高于水牛乳，其中XOR含量是水牛乳的35倍；奶牛MFGMPs中有15種蛋白的含量超過水牛的4倍.下調(diào)蛋白中主要是結(jié)合蛋白；處在膜上的蛋白有12個(gè)，在胞外基質(zhì)中的有11個(gè)；參與代謝過程的蛋白有11個(gè)具有細(xì)胞識別、信號傳導(dǎo)、抑制腫瘤細(xì)胞的功能特性.

磷酸鈉溶質(zhì)載體蛋白是載體蛋白中專一性轉(zhuǎn)運(yùn)磷酸鈉溶質(zhì)的一種蛋白.載體蛋白可以高特異性的結(jié)合水溶性小分子，滲透并穿過細(xì)胞膜的脂質(zhì)層，將承載物質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞當(dāng)中[19].GGT是生物體內(nèi)參與谷胱甘肽代謝的關(guān)鍵酶之一，是催化轉(zhuǎn)移L-γ-谷氨酰基的特異性酶，與脂代謝紊亂、糖代謝異常、高血壓和肥胖等呈正相關(guān)[20].

XOR是一種在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)普遍存在的復(fù)合體黃素鉬蛋白，可以控制將黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸的嘌呤分解代謝的速率，在DNA 降解、核酸合成和能量需求反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用[21].Linder等[22]發(fā)現(xiàn)XOR與低分化腫瘤和p53異常表達(dá)有關(guān)，與漿液性卵巢癌患者的預(yù)后不良有關(guān)是分泌選擇素L的配體，可以刺激β2黏合素通路與GlyCAM-1結(jié)合，具有參與細(xì)胞識別、信號傳導(dǎo)、誘導(dǎo)白細(xì)胞黏附等生物學(xué)功能，并參與到生物體免疫反應(yīng)、炎癥應(yīng)激等過程中[23].GP-2是通過糖苷鍵鏈接羥基或酰胺基形成共價(jià)鍵而成的一種結(jié)合蛋白，其中N-糖苷鍵蛋白具備多種生物功能，并參與到很多細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間相互作用的生物過程中[24].由于細(xì)菌、病毒對宿主細(xì)胞膜上某種特殊的糖鏈有專一識別和結(jié)合作用，因此糖蛋白中的糖鏈起到了阻擋和防御微生物入侵細(xì)胞的作用[25].

3 結(jié) 論

1)利用iTRAQ技術(shù)比較奶牛和水牛MFGMPs的成分、含量及功能特性.將奶牛和水牛MFGMPs樣品分別標(biāo)記為113和115，采用Nano-HPLC-MS/MS系統(tǒng)對樣品進(jìn)行分離、鑒定，通過數(shù)據(jù)庫查詢蛋白質(zhì)信息，并進(jìn)行分析、比較.

2)在水牛和奶牛MFGMPs中共鑒定鑒定出424個(gè)蛋白質(zhì)，其中差異極顯著蛋白有146個(gè)，2倍上調(diào)蛋白和下調(diào)蛋白分別有20個(gè)和25個(gè)(水牛/奶牛).顯著差異蛋白大部分在細(xì)胞膜上，具備催化活性和蛋白質(zhì)結(jié)合功能，參與生物體的代謝過程.

3)水牛MFGMPs具有更多的載體活性和催化活性為生物體內(nèi)的合成、代謝供應(yīng)必要的成分.奶牛MFGMPs主要表現(xiàn)為蛋白質(zhì)結(jié)合特性，具有細(xì)胞識別、信號傳導(dǎo)、抑制腫瘤細(xì)胞的功能特性.奶牛和水牛MFGMPs具備的功能特性大部分有益于生物體的代謝調(diào)節(jié)和免疫功能，并可在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞的生長繁殖，具有一定的生物利用價(jià)值和藥用前景.

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(編輯 張 紅)

Comparison of the protein compositions and functional properties for bovine and buffalo MFGMPs

JI Xiaoxi, MA Ying

(School of Chemistry and Chemical Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China)

The iTRAQ techniques were used to separate and identify milk fat globule membrane proteins(MFGMPs) from bovine and buffalo milk to compare the differences among composition, contents and functional properties of them. MFGMPs were separated and analyzed by Nano-HPLC tandem MS (MS/MS) analysis coupled with Q-Exactive. The results showed that 424 proteins were identified (FDR≤0.01%). The contents of 146 proteins were significantly different between MFGMPs bovine and buffalo in these identified proteins. Among these different proteins, there were 20 up regulated proteins and 25 down regulated proteins by two times (buffalo/bovine). The contents of sodium phosphate solute carrier protein and γ-glutamyl transpeptidase are significantly higher in buffalo MFGMPs than in bovine MFGMPs. The two proteins possess carriers and catalytic activities, and serve as the basic composition of biosynthesis and metabolism. The contents of xanthine oxidoreductase and butyrophilin are significantly higher in bovine MFGMPs than in buffalo MFGMPs. The two proteins, identified as binding protein, can inhibit the growth of tumor cell. The results showed that the significant differences of content existed in some functional protein between the MFGMPs of buffalo and bovine.

cow; buffalo; MFGMPs; proteome; functional properties; iTRAQ

10.11918/j.issn.0367-6234.201511048

2015-11-13

國家自然科學(xué)基金(30871953)

姬曉曦(1983—)，女，博士研究生； 馬 鶯(1961—)，女，教授，博士生導(dǎo)師

馬 鶯，maying@hit.edu.cn

TS252.1

A

0367-6234(2017)08-0104-05