蘇芳靜， 張 斌， 田林燕

(南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校護理系， 河南 南陽 473001)

穿心蓮內(nèi)酯對卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3侵襲與凋亡的影響*

蘇芳靜△， 張 斌， 田林燕

(南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校護理系， 河南 南陽 473001)

目的： 觀察穿心蓮內(nèi)酯對卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3侵襲與凋亡的影響并探討初步的作用機制。方法： CCK-8法檢測不同濃度(0、5、10、20和40 μmol/L)的穿心蓮內(nèi)酯對SKOV-3細(xì)胞作用不同時間(12、24、36和48 h)后，SKOV-3細(xì)胞存活率的變化；Transwell法與TUNEL法分別檢測SKOV-3細(xì)胞侵襲能力與凋亡能力的變化；Western blot法檢測p-PI3K、p-Akt與p-mTOR蛋白水平的變化。結(jié)果： CCK-8法檢測結(jié)果顯示，隨著濃度增加與培養(yǎng)時間延長，穿心蓮內(nèi)酯對SKOV-3細(xì)胞存活率的抑制程度增強；采用20 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯培養(yǎng)SKOV-3細(xì)胞36 h后，SKOV-3細(xì)胞的侵襲數(shù)明顯降低，凋亡數(shù)明顯增加(P<0.05)，p-PI3K、p-Akt與p-mTOR的蛋白水平明顯降低(P<0.05)。結(jié)論： 穿心蓮內(nèi)酯能夠抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV-3的活力與侵襲能力，增強凋亡能力，這可能與抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路有關(guān)。

穿心蓮內(nèi)酯； 卵巢癌細(xì)胞； PI3K/Akt/mTOR信號通路

卵巢惡性腫瘤是婦科腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率約占婦科惡性腫瘤的15%，可發(fā)生于任何年齡段的女性，常見于更年期與絕經(jīng)期的婦女，發(fā)病年齡高峰為50～60歲[1-2]。由于發(fā)病部位隱匿，容易擴散轉(zhuǎn)移，超過50%以上的卵巢癌患者在治療完畢后再次復(fù)發(fā)，5年生存率較低，約為25%～30%[3]。臨床上卵巢癌的治療主要以手術(shù)為主，放化療為輔的綜合治療手段，但由于化療藥物容易產(chǎn)生耐藥性以及毒副作用，卵巢癌細(xì)胞對放療射線的敏感性較低，導(dǎo)致臨床的治療效果并不理想。近年來，從中草藥與天然植物中提取安全有效低毒的單體成分用于治療癌癥是腫瘤研究的熱點。

穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide，Ang)是爵床科植物穿心蓮中所含的二萜內(nèi)酯類化合物，具有祛熱解毒、消炎止痛的功效，對細(xì)菌性與病毒性上呼吸道感染具有特殊的療效，具有天然抗生素的美譽[4]。國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯衍生物通過阻滯細(xì)胞于G0/G1期、下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)、激活caspase-9和caspase-3蛋白表達(dá)誘導(dǎo)人食管癌Ec9706細(xì)胞凋亡，從而抑制Ec9706細(xì)胞增殖與克隆形成[5]。本實驗觀察了穿心蓮內(nèi)酯對卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3生長與侵襲能力的影響，并探討其具體的作用機制。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞來源與試劑

人卵巢癌漿液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞株SKOV-3購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所；穿心蓮內(nèi)酯購自中國食品藥品檢定研究院，溶解于HBSS緩沖液中備用[6]；RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco；10%胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購自Corning；抗磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylino-sitol 3-kinase,PI3K)、p-PI3K、Akt、p-Akt、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、p-mTOR和β-actin抗體購自Santa Cruz。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 將SKOV-3細(xì)胞株至于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞融合至80%～90%時，用0.25%胰酶消化3 min，進行傳代。

2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞活力 將處于對數(shù)生長期的SKOV-3細(xì)胞接種于96孔板，每孔1×105個細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育，當(dāng)細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，分別加入穿心蓮內(nèi)酯使最終濃度分別為0、5、10、20和40 μmol/L，每組設(shè)6個復(fù)孔，每組細(xì)胞分別培養(yǎng)12 h、24 h、36 h和48 h后，更換培養(yǎng)基，加入10 μL CCK-8檢測液，繼續(xù)孵育1 h，采用酶標(biāo)儀檢測波長為450 nm各孔的吸光度。

2.3 實驗分組 實驗共分為3組：正常對照(control)組采用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)；溶劑(solvent)組加入等劑量溶劑HBSS緩沖液；Ang加藥組(Ang組)給予20 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯培養(yǎng)36 h。

2.4 Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲能力 將處于對數(shù)生長期的SKOV-3細(xì)胞接種于預(yù)鋪Matrigel、含1%血清的Transwell上室中，每孔5×105個細(xì)胞；下室加入含10%血清的培養(yǎng)基，孵育24 h后，棄去培養(yǎng)基，用棉簽輕輕擦拭，將上室至于結(jié)晶紫染液中3 min，PBS洗滌，置于顯微鏡下觀察細(xì)胞計數(shù)，并拍照。

2.5 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞接種于已滅菌的培養(yǎng)皿中，每孔1×105個，待細(xì)胞貼壁后，加入穿心蓮內(nèi)酯使最終濃度為20 μmol/L，培養(yǎng)36 h。用4%多聚甲醛 4 ℃固定 30 min，0.1% Triton X-100冰浴2 min，分別加入50 μL TUNEL檢測液，繼續(xù)置于37 ℃避光孵育 60 min，PBS洗滌，加入DAPI染液(10 mg/L)孵育15 min，抗熒光淬滅劑封片，采用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察各組細(xì)胞的凋亡情況，統(tǒng)計細(xì)胞凋亡率。

2.6 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解緩沖液，提取蛋白，通過分光光度測定儀進行蛋白定量，各組取50 μg蛋白進行凝膠電泳分離，完成后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，加入含封閉液的器皿中，室溫封閉2 h，加入相應(yīng) I抗，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次，加入對應(yīng) II 抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗膜3次，避光加入按照說明書比例新鮮配置的ECL發(fā)光液，曝光，采用Quantity One圖像分析軟件對實驗結(jié)果進行分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，滿足方差齊性的多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，2組數(shù)據(jù)間的比較采用獨立樣本的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計意義。

結(jié) 果

1 不同濃度穿心蓮內(nèi)酯對SKOV-3細(xì)胞存活率的影響

在同一時點，隨著穿心蓮內(nèi)酯濃度的增加，SKOV-3細(xì)胞的存活率逐漸下降，20 μmol/L與40 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯對細(xì)胞存活率的影響與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；同一濃度藥物，隨著孵育時間的延長，SKOV-3細(xì)胞的存活率逐漸下降，48 h與36 h相比，存活率的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖1。因此，采用20 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯培養(yǎng)細(xì)胞36 h的條件進行后續(xù)實驗。

Figure 1.The viability of the SKOV-3 cells after treated with andrographolide. Mean±SD.n=6.

圖1 穿心蓮內(nèi)酯對SKOV-3細(xì)胞存活率的影響

2 穿心蓮內(nèi)酯對SKOV-3細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實驗結(jié)果如圖2所示。采用20 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯培養(yǎng)SKOV-3細(xì)胞36 h后，細(xì)胞侵襲數(shù)顯著低于正常對照組與溶劑對照組(P<0.05)，其中正常對照組和溶劑對照組細(xì)胞侵襲數(shù)之間的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。

Figure 2.The invasion of SKOV-3 cells after 20 μmol/L andrographolide (Ang) treatment (×200).Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2 穿心蓮內(nèi)酯對SKOV-3細(xì)胞侵襲能力的影響

3 穿心蓮內(nèi)酯對SKOV-3細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL實驗結(jié)果如圖3所示。采用20 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯培養(yǎng)SKOV-3細(xì)胞36 h后，細(xì)胞凋亡數(shù)顯著高于正常對照組與溶劑對照組(P<0.05)，其中正常對照組和溶劑對照組的細(xì)胞凋亡之間的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。

Figure 3.The effect of 20 μmol/L andrographolide (Ang) on the apoptosis of SKOV-3 cells (TUNEL staining, ×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3 穿心蓮內(nèi)酯對SKOV-3細(xì)胞凋亡的影響

4 p-PI3K、p-Akt與p-mTOR蛋白水平的變化

Western blot實驗結(jié)果如圖4所示。采用20 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯培養(yǎng)SKOV-3細(xì)胞36 h后，細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt與p-mTOR的蛋白水平較對照組明顯降低(P<0.05)，而正常對照組和溶劑對照組之間蛋白表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。

Figure 4.The effect of 20 μmol/L andrographolide (Ang) on the protein levels of p-PI3K, p-Akt and p-mTOR in the SKOV-3 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4 SKOV-3細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt與p-mTOR蛋白水平的變化

討 論

PI3Ks信號通路主要參與細(xì)胞增殖，分化與凋亡等多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的過程，PI3K/Akt/mTOR信號通路被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞存活的重要通路，對腫瘤細(xì)胞的生存、凋亡和細(xì)胞周期，以及腫瘤細(xì)胞新生血管的形成、轉(zhuǎn)移與侵襲等具有重要的意義[7-8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤細(xì)胞中，如乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌等惡性上皮性腫瘤中發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號通路過度激活，并在腫瘤細(xì)胞的增殖，遷移與侵襲過程中發(fā)揮重要作用[9-10]。國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002對卵巢癌細(xì)胞SKOV3和CAOV3的增殖與侵襲能力具有明顯的抑制作用，表明卵巢癌細(xì)胞的增殖與侵襲能力與PI3K/Akt信號通路的激活具有非常緊密的聯(lián)系[11]。我們研究發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯對卵巢癌細(xì)胞的活力與侵襲能力具有明顯的抑制作用，而PI3K、Akt與mTOR的磷酸化水平下降，推測穿心蓮內(nèi)酯對卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖與侵襲能力的抑制作用，以及凋亡的促進作用是通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活而實現(xiàn)的。

在卵巢惡性腫瘤中，腫瘤細(xì)胞的侵襲或轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致卵巢腫瘤患者治療效果欠佳，預(yù)后不良與復(fù)發(fā)率高的主要原因，因此深入研究卵巢惡性腫瘤細(xì)胞侵襲或轉(zhuǎn)移的主要分子作用機制，對于尋找卵巢腫瘤的治療分子作用靶點，對卵巢惡性腫瘤進行早期的診斷與治療提供確切的依據(jù)。本實驗發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路是穿心蓮內(nèi)酯對卵巢腫瘤細(xì)胞的主要作用方式，PI3K/Akt/mTOR信號通路可以作為治療卵巢腫瘤作用靶點，對于指導(dǎo)卵巢腫瘤采用穿心蓮內(nèi)酯輔助治療具有重要的意義。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects of andrographolide on invasion and apoptosis of ovarian cancer SKOV-3 cells

SU Fang-jing, ZHANG Bin, TIAN Lin-yan

(SchoolofNursing,NanyangMedicalCollege,Nanyang473001,China.E-mail:sufangjing322904@126.com)

AIM: To investigate the effects of andrographolide on the invasion and apoptosis of ovarian cancer cell line SKOV-3, and to explore the possible mechanisms. METHODS: SKOV-3 cells were treated with different concentrations (0, 5, 10, 20 or 40 μmol/L) of andrographolide for different time (12, 24, 36 or 48 h), and then the cell viability was determined by CCK-8 assay. The cell invasion ability was analyzed by Transwell assay and cell apoptosis was detected by TUNEL staining. The protein levels of p-PI3K, p-Akt and p-mTOR were examined by Western blot. RESULTS: The results of CCK-8 assay revealed that andrographolide inhibited the growth of SKOV-3 cells in a dose- and time-dependent manner. Treatment with andrographolide at 20 μmol/L for 36 h significantly decreased the invasion ability of SKOV-3 cells, while increased cell apoptosis. In addition, the protein levels of p-PI3K, p-Akt and p-mTOR were reduced after andrographolide treatment. CONCLUSION: Andrographolide inhibits the growth and invasion of ovarian cancer SKOV-3 cells by suppression of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.

Andrographolide; Ovarian cancer cells; PI3K/Akt/mTOR signaling pathway

1000- 4718(2017)07- 1328- 04

2017- 02- 07

2017- 06- 14

河南省教育廳高校重點科研項目(No.15A360011)

R711.75; R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.029

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