王曉燕 常時新 李冠武 周自明 袁軍 王樂 宋彥穎 繆宇

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437 2.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis,OP)是以骨量降低和骨結(jié)構(gòu)退化為特點，導(dǎo)致骨脆性和骨折風(fēng)險增加的一種全身性、代謝性骨骼疾病[1]，往往引起脊柱骨和髖骨骨折，具有“四高一低”的特點，即高發(fā)病率、高致殘率、高病死率、醫(yī)療費用消耗高及低生活質(zhì)量。原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥主要發(fā)生在老年人群中，中老年女性最為常見，尤其是絕經(jīng)后婦女。本研究選擇SD雌性大鼠為研究對象，采用卵巢切除術(shù)建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型，觀察補腎生髓經(jīng)典方劑青娥丸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動物

6月齡SPF級雌性SD大鼠60只，體重350±15 g，購置于上海斯萊克實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動物實驗中心(合格證：SYXK(滬)2006-0001，NO.0069937)。飼養(yǎng)觀察室溫度：21±2℃，相對濕度：45%-55%，給予標(biāo)準(zhǔn)光照周期(12 h光照/12 h黑夜)。

1.2 分組

將60只SD雌性大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為4組，即假手術(shù)組(SHAM，n=15)，去勢對照組(OVX，n=15)，去勢青娥丸組(QEW，n=15)、去勢雌激素組(E2，n=15)。

1.3 造模

采用卵巢切除術(shù)建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型：適應(yīng)環(huán)境1周后，采用戊巴比妥鈉(劑量為30 mg/kg)腹腔注射麻醉動物。麻醉穩(wěn)妥后，將動物仰臥位固定于手術(shù)臺上，電動剃毛器將下腹部剃毛，手術(shù)區(qū)域皮膚消毒，保持無菌操作。正中部位打開腹腔，撥開腸管找到卵巢，輸卵管遠(yuǎn)端用血管鉗固定、結(jié)扎，將子宮闊韌帶分離，摘除雙側(cè)卵巢，將小腸等腹腔器官組織復(fù)位，關(guān)閉腹腔、對手術(shù)切口進(jìn)行縫合,假手術(shù)組只需切除卵巢周圍等量脂肪組織即可[2]。

術(shù)后即刻予以肌注40萬U/kg青霉素，連續(xù)5天，每天2次，預(yù)防傷口感染。給予12 h光照/12 h黑暗循環(huán)，標(biāo)準(zhǔn)鼠籠分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、進(jìn)水。所有實驗鼠術(shù)前及術(shù)后均稱體重。術(shù)后密切觀察，注意傷口感染征象。

1.4 給藥

建模8周后，各組分別進(jìn)行藥物干預(yù)。青娥丸組：青娥丸(杜仲、補骨脂、核桃仁、大蒜)，按照9 g/kg臨床劑量，根據(jù)動物間體表面積折算的等效劑量換算，予56.7 g/kg，每天灌胃兩次；雌激素組：給予β-雌二醇0.2 mL/kg藥物干預(yù)；正常組、假手術(shù)組及OVX對照組分別給予等量去離子水。根據(jù)每周體重調(diào)整藥物劑量，共給藥12周。動物處死前第14天和第13天皮下注射鹽酸四環(huán)素、處死前第4天、第3天皮下注射鈣黃綠素，進(jìn)行骨熒光雙標(biāo)記。

1.5 取材

藥物干預(yù)結(jié)束后，次日腹主動脈取血后處死所有動物，剝離脛骨及腰椎，儲存于-80 ℃冰箱備用。

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1骨密度檢測

雙能X線吸收測量儀(dual X-ray absorptionmetry, DXA；Prodigy Lunar, GE Health-care, USA)采用專用動物成像軟件(Software Version enCORE 13.40.038)，對實驗鼠行全身骨密度掃描，以獲取腰椎(L3-L6)和股骨近端感興趣區(qū)骨密度，掃描條件：電壓76 kV，電流0.15 mA，掃描時間約4 min，掃描前首先進(jìn)行質(zhì)量保證測試，校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)塊由廠家提供，研究期間其測量結(jié)果波動在DXA的質(zhì)控Shewhart圖范圍內(nèi)，BMD測量的精確性用變異系數(shù)(Coefficient of variation,CV)表示，CV均為0.98%[3]。

1.6.2骨組織形態(tài)計量學(xué)參數(shù)測定

每組動物隨機(jī)選取8只，于處死前的13 d、14d 和3 d、、4d 分別皮下注射鈣黃綠素(8 mg/kg)和鹽酸四環(huán)素(50 mg/kg)。處死動物后選取脛骨于70%無水乙醇 4℃保存，90%無水乙醇，4天每天換液1次，4℃保存，100%無水乙醇，4天每天換液1次，室溫保存，100%無水乙醇，5天每天換液1次，室溫真空保存，二甲苯，5天每天換液1次，室溫真空保存，二甲苯：UMMA 1∶1，5天每天換液1次，4℃真空保存，UMMA，5天每天換液1次，4℃真空保存，PMMA，待凝固包埋完成(注：使用PMMA包埋時需抽真空，使組織間空氣充分去除，補充流失PMMA)，5 μm和10 μm縱向不脫鈣骨切片，5 μm切片常規(guī)脫蠟至水后甲苯胺染色；10 μm切片用于熒光顯微鏡下觀察。然后利用骨組織形態(tài)學(xué)測量系統(tǒng)進(jìn)行指標(biāo)檢測，測量指標(biāo)有：骨小梁體積百分比(TBV%)、骨小梁吸收表面百分比(TRS%)、骨小梁形成表面百分比(TFS%)、活性生成表面百分比(AFS%)、骨小梁礦化率(MAR)、骨小梁骨生成率(BFR)、類骨質(zhì)平均寬度(OSW)、骨皮質(zhì)礦化率(mAR)。

1.6.3ELISA檢測血清BALP、CTX-1、E2表達(dá)情況

實驗前將試劑盒及待測標(biāo)本放置室溫平衡30 min，將標(biāo)準(zhǔn)品和樣本各100 μL依次加入孔中，并做好標(biāo)記，在標(biāo)準(zhǔn)品和樣本孔中分別加入50 μL酶聯(lián)親和物，充分混勻。37℃溫育60 min后棄盡孔內(nèi)液體，用稀釋好的洗滌液反復(fù)沖洗5次并扣干孔內(nèi)剩余液體，每孔按照次序，分別加入顯色液，并充分混勻，在室溫下避光反應(yīng)15 min，反應(yīng)后每孔加入終止液50 μL，充分混勻，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450 nm測定OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)，OD值作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)方程，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程計算出每個樣本的濃度。

1.6.4統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩兩比較采用t檢驗，符合正態(tài)分布和方差齊性采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，如不符合正態(tài)分布和方差齊性則采用Kruslal-Wallis H檢驗。P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前后骨密度值比較

治療前各組實驗鼠股骨和椎骨骨密度值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。與治療前比較，OVX組股骨骨密度值顯著降低(P<0.01)，椎骨骨密度值也明顯降低(P<0.05)，表示造模成功；E2組治療后股骨和椎骨骨密度值較治療前均有明顯升高(P<0.05)；與治療前比較，QEW組治療后股骨和椎骨骨密度值也均有一定程度升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

部位Location組別Group治療前Before treatment治療后After treatment股骨Femur(g/cm2)椎骨Vertebra(g/cm2)Sham(n=8)0.13±0.00 0.13±0.01OVX(n=8)0.12±0.000.08±0.01??E2(n=8)0.12±0.010.13±0.00?QEW(n=8)0.12±0.01 0.13±0.02Sham(n=8)0.16±0.02 0.17±0.02OVX(n=8)0.15±0.010.12±0.03?E2(n=8)0.16±0.01 0.17±0.01?QEW(n=8)0.16±0.010.18±0.02

注：各組治療前后比較，*P<0.05，**P<0.01
Before and after treatment in each group,*P<0.05，**P<0.01

2.2 骨組織形態(tài)計量學(xué)參數(shù)比較

(1)骨小梁組織形態(tài)計量見表2，圖1。

組別nTBV(%)TRS(%)TFS(%)MAR(μm/d)Sham823.11±0.584.51±0.224.79±0.431.50±0.14OVX818.35±0.487.19±0.447.73±0.192.44±0.18E2821.67±0.885.91±0.186.18±0.091.68±0.22QEW822.39±0.496.72±0.296.88±0.352.03±0.19

圖1 骨小梁組織形態(tài)計量Fig.1 Trabecular bone histomorphometry注：*P<0.01，OVX vs.SHAM；#P<0.01，E2 vs.OVX，□P<0.05，E2 vs.SHAM，■P<0.01，E2 vs.SHAM；△P<0.05，QEW vs.OVX，▲P<0.01，QEW vs.OVX，◇P<0.05，QEW vs.SHAM，◆P<0.01，QEW vs.SHAM

采用Qwin V3圖像系統(tǒng)進(jìn)行骨組織形態(tài)計量學(xué)數(shù)據(jù)分析，見表3，圖3。結(jié)果顯示：OVX組大鼠脛骨TBV%顯著低于SHAM組(P<0.05)；與OVX組比較，QEW組、E2組TBV%均顯著升高(P<0.05)，但二組均明顯低于SHAM組。OVX組大鼠脛骨TRS%顯著高于SHAM組(P<0.05)；與OVX組比較，QEW組、E2組TRS%均顯著降低(P<0.05)，但二組均明顯高于SHAM組。OVX組大鼠脛骨TFS%和MAR均顯著高于SHAM組(P<0.05)；與OVX組比較，QEW組、E2組TFS%和MAR均顯著降低(P<0.05)，與SHAM組比較，二組TFS%均明顯高于SHAM組，而QEW組MAR顯著增高(P<0.05)，E2組則差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(見圖1)

(2)皮質(zhì)內(nèi)表面形態(tài)計量

組別nOSW(μm)mAR(μm/d)Sham82.28±0.092.79±0.13OVX83.28±0.194.33±0.26E282.54±0.223.22±0.15QEW82.62±0.512.87±0.57

圖2 皮質(zhì)內(nèi)表面形態(tài)計量Fig.2 Cortical surface morphology measurement注：*P<0.01，OVX vs.SHAM；#P<0.01，E2 vs.OVX，■P<0.01，E2 vs.SHAM；▲P<0.01，QEW vs.OVX

同樣，采用Qwin V3圖像系統(tǒng)進(jìn)行骨組織形態(tài)計量學(xué)數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示：

OVX組大鼠脛骨OSW和mAR均顯著高于SHAM組(P<0.05)；與OVX組比較，QEW組、E2組mAR和OSW均顯著降低(P<0.05)，與SHAM組比較，E2組mAR和OSW均顯著增高(P<0.05)，而QEW組則差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(見圖2)

2.3 血清骨代謝及雌激素(BALP、CTX、E2)水平見表4-6，圖3-5

表4 各組大鼠血清中BALP水平Table 4 The levels of BALP in serum of each group

圖3 各組動物血清中BALP水平Fig.3 The levels of BALP in serum of each group注：*P<0.05，vs.SHAM；#P<0.05,vs.OVX

表5 各組大鼠血清中CTX水平Table 5 The levels of CTX in serum of each group

圖4 各組動物血清中CTX水平Fig.4 The levels of CTX in serum of each group注：*P<0.01，vs.SHAM；#P<0.01,▲P<0.05 vs.OVX；◆P<0.01,vs.E2

表6 各組大鼠血清中Estradiol水平Table 6 The levels of Estradiol in serum of each group

圖5 各組動物血清中Estradiol水平Fig.5 The levels of Estradiol in serum of each group注：*P<0.05，vs.SHAM；#P<0.01,▲P<0.05，vs.OVX；◆P<0.01,vs.E2

綜上，與SHAM組比較，OVX組BALP水平顯著降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義；與OVX組比較，E2組和QEW組BALP水平均顯著升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義。與SHAM組比較，OVX組CTX水平顯著增高，具有統(tǒng)計學(xué)意義；與OVX組比較，E2組和QEW組CTX水平均顯著降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義；QEW組CTX水平顯著高于E2組，且具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。與SHAM組比較，OVX組雌激素水平顯著降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義；與OVX組比較，E2組和QEW組雌激素水平均顯著升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義；QEW組雌激素水平顯著低于E2組，且具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。

3 討論與分析

傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)并沒有對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥明確的相關(guān)記載，但根據(jù)該病的臨床癥狀及體征，可將其歸為“痹癥”“骨痹”“骨枯”“骨痿”等范疇，其中“骨痿”與之最為相似[4]。如《素問·痿論》云：“腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿?！泵鞔_指出，“骨枯而髓減”為骨痿的基本發(fā)病病機(jī)。《素問·上古天真論》曰：“女子七歲，腎氣盛，齒更發(fā)長；......七七任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子也”，《素問·痿論》又云：“腰者腎之府，轉(zhuǎn)搖不能，腎將憊矣”?？梢娊^經(jīng)后女性腎氣虛弱，天癸枯竭，精虧髓減，髓不養(yǎng)骨，而致筋骨枯弱。因此，我們擬以補腎生髓經(jīng)典方劑青娥丸以補腎強骨填髓治療絕經(jīng)后骨痿。

青娥丸出自《太平惠民和劑局方》，為補腎強骨經(jīng)典方劑。該方由杜仲、補骨脂、核桃仁組成，加大蒜熬膏，制為丸藥，具有良好的補腎、強骨、止痛之效。方中杜仲味甘性溫，歸肝腎經(jīng)，《神農(nóng)本草經(jīng)》：“主腰脊痛，補中，益精氣，堅筋骨”，具有補肝腎、強健骨之效，用以治療腎虛腰痛及各種腰痛，可達(dá)強腰固本之功用，常與補骨脂配伍使用。補骨脂，味苦、辛，性溫，歸腎、脾經(jīng)，具有補腎壯陽、固精縮尿、溫脾止瀉等功效，《本草經(jīng)疏》：“補骨脂，能暖水臟，陰中生陽，壯火益士之要藥也”，善壯腎陽而暖水臟，以治療腎陽虛證為主，可治腎陽虛弱，風(fēng)寒侵襲之腰膝冷痛。核桃仁，味甘，性溫，歸腎、肺、大腸經(jīng)，具有補腎溫肺，潤腸通便之效，可治腰膝酸痛、下肢痿弱，因其溫補腎陽力弱，多與他藥配伍使用。大蒜，味辛，性溫，歸脾胃、肺經(jīng)，可解毒消腫。全方共奏補腎強骨生髓之效。

骨密度是量化骨強度的良好指標(biāo)，但是骨密度并不能精確的計算骨質(zhì)量[5]。骨組織形態(tài)計量學(xué)是采用不脫鈣硬包埋法和活體熒光標(biāo)記法制作骨組織標(biāo)本，得到骨結(jié)構(gòu)和骨重建參數(shù)，進(jìn)而形象而直觀地量化和分析松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)，是評價骨轉(zhuǎn)換和骨微結(jié)構(gòu)的重要方法，在骨代謝研究領(lǐng)域中具有重要的應(yīng)用價值[6]。本課題研究發(fā)現(xiàn)：OVX組大鼠脛骨TBV%顯著低于SHAM組；與OVX組比較，QEW組、E2組TBV%均顯著升高，但二組均明顯低于SHAM組；OVX組大鼠脛骨TRS%、TFS%、MAR、OSW和mAR均顯著高于SHAM組；與OVX組比較，QEW組、E2組TRS%、TFS%、MAR、mAR和OSW均顯著降低，與SHAM組比較，兩組TBV%、TFS%均明顯高于SHAM組，E2組mAR和OSW均顯著增高，QEW組MAR顯著增高。脛骨TBV%是骨量水平高低的主要標(biāo)志，TRS%代表骨吸收，而TFS%、MAR、OSW和mAR則是代表骨形成的主要參數(shù)，以上結(jié)果表明，QEW均能夠提高去勢大鼠骨量水平，且能夠在一定程度上調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)換，對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥具有明顯的防治作用。

骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物是評估骨代謝的生化指標(biāo)[7]，能夠反映藥物對骨轉(zhuǎn)換的代謝作用，骨轉(zhuǎn)換增加是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松病理生理發(fā)展過程中最重要的因素。不同的標(biāo)志物分別介導(dǎo)骨形成和骨吸收，而二者之間的不平衡通常被認(rèn)為是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的重要發(fā)病機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)：E2組和QEW組BALP水平較OVX組均顯著升高，CTX水平較OVX組均顯著降低；QEW組CTX水平顯著高于E2組，且具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。青娥丸能夠使骨轉(zhuǎn)換速率下降，具有預(yù)防骨量丟失的作用。

由于雌激素水平的下降，大多數(shù)骨質(zhì)疏松癥患者為絕經(jīng)后女性。女性與年齡相關(guān)的骨流失分為兩個階段：第一個階段始于絕經(jīng)，主要表現(xiàn)在骨小梁上，由于雌激素缺乏引起，并導(dǎo)致與骨形成相比骨吸收不成比例的增加，4-8年后該階段達(dá)到頂峰；第二階段開始，表現(xiàn)為骨小梁和骨皮質(zhì)持久的、緩慢的損耗，主要是由骨形成下降引起的。研究結(jié)果顯示：E2組和QEW組雌激素水平較OVX組均顯著升高，而QEW組雌激素水平顯著低于E2組，且具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。研究結(jié)果表明，青娥丸可能具有植物雌激素樣作用，能夠改善雌激素缺乏所致的骨衰敗。

綜上所述，青娥丸治療腎虛型絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，可能與其能夠改善骨微結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)骨代謝、雌激素樣作用等機(jī)制相關(guān)。