袁 帥 王宇哲 張可然 黃鳳華 張西鋒

(武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,湖北武漢 430023)

耐硒產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選

袁 帥 王宇哲 張可然 黃鳳華 張西鋒

(武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,湖北武漢 430023)

采用硒選擇培養(yǎng)基和剛果紅平板法對(duì)耐硒產(chǎn)纖維素酶菌株進(jìn)行初篩，通過(guò)透明圈的大小篩選了耐2500mg/L濃度Se的13株菌株，并對(duì)篩選菌株的產(chǎn)纖維素酶活力進(jìn)行了初步的檢測(cè)。

纖維素酶 菌株

1 前言

纖維素是植物光合作用下產(chǎn)物，且是目前自然界中含量非常大的一類(lèi)可再生資源，有機(jī)肥料等部分物質(zhì)可由其制備而成，但每年也會(huì)有大量秸稈等富含纖維素的生物體被焚燒造成環(huán)境的污染和資源的浪費(fèi)，因此，如何利用好自然界中的纖維素對(duì)人類(lèi)未來(lái)的發(fā)展有著重要的意義。目前，肥料是農(nóng)作物的生長(zhǎng)所離不開(kāi)的物質(zhì)，而有機(jī)肥料則需要通過(guò)秸稈等物質(zhì)內(nèi)部纖維素的分解來(lái)進(jìn)一步生產(chǎn)，同時(shí)人們對(duì)健康生活的追求使富硒產(chǎn)品的需求量增加。但目前大部分土壤并不是富硒的環(huán)境，所以非富硒地區(qū)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)開(kāi)始對(duì)富硒有機(jī)肥料有所需求，通過(guò)在農(nóng)作物的生長(zhǎng)過(guò)程中加入有機(jī)肥料的方式來(lái)達(dá)到農(nóng)作物含硒的目的。而富硒有機(jī)化肥的生產(chǎn)離不開(kāi)可耐受高濃度硒的纖維素菌種或菌群，所以，篩選出耐受高濃度硒的纖維素菌種或菌群對(duì)富硒有機(jī)化肥的生產(chǎn)有著重要的意義。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 土樣：湖北恩施富硒礦床土樣。

2.1.2 其他實(shí)驗(yàn)材料：蛋白胨、酵母提取物、蒸餾水、氯化鈉、氯化鉀、硝酸鉀、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、亞硒酸鈉等均為國(guó)產(chǎn)試劑。

2.2 培養(yǎng)基

2.2.1 富集培養(yǎng)基和液體發(fā)酵培養(yǎng)基：

富集培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，自然pH值。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：富集培養(yǎng)基+Na2SeO3 150mg/L。

2.2.2 梯度硒選擇培養(yǎng)基和富硒固體培養(yǎng)基：

梯度硒選擇培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 1g/L，Na2SeO3（500、1000、1500、2000和2500）mg/L，自然pH值。富硒固體培養(yǎng)基：梯度硒選擇培養(yǎng)基+瓊脂粉15g/L。

2.2.3 剛果紅篩選纖維素瓊脂培養(yǎng)基：

KNO3（2g/L），KH2PO4（1g/L），MgSO4（0.5 g/L），NaCl（1g/L），Na2HPO4（1g/L），CMC-Na（20g/L），Na2SeO32500mg/L，瓊脂（15g/L），自然pH值。

2.2 方法

2.2.1 耐硒菌種的分離：

收集湖北恩施富硒茶田土富硒土樣，將土樣放入燒杯中，加入無(wú)菌磷酸鹽緩沖液懸浮，在常溫、180r/min的環(huán)境下于搖床中振蕩30min，靜置，待沙礫和大顆粒沉降后收集懸浮液。取懸浮液的一部分經(jīng)5000r/min離心10min后，收集沉淀（沉淀用5ml無(wú)菌磷酸鹽緩沖液懸浮后放入4℃冰箱保存）。另一部分2ml的懸浮液加入富集培養(yǎng)基中擴(kuò)培，在37℃、180r/min的條件下振蕩培養(yǎng)2d，放入4℃冰箱保存。

取上述擴(kuò)培液加入含150μg/ml Na2SeO3的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，在37℃、180r/min的條件下振蕩培養(yǎng)2天。以5%接種量繼代培養(yǎng)4次后，接種到硒的濃度為Se（500、1000、1500、2000和2500mg/L）的梯度硒選擇培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)48h。在2500mg/L的梯度硒選擇培養(yǎng)基中存活的菌株即為耐硒的菌株。

2.2.2 耐硒纖維素分解菌的分離：

取耐硒菌液，經(jīng)蒸餾水稀釋后涂布在相對(duì)應(yīng)濃度Na2SeO3（2500mg/L）的剛果紅篩選纖維素瓊脂培養(yǎng)基上，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，在培養(yǎng)結(jié)束后往培養(yǎng)皿中加入適量的剛果紅溶液，染色1h后棄去染液，加入適量1 mol/L的NaCl溶液，洗滌1h。根據(jù)菌落周?chē)该魅χ睆脚c菌落直徑的比值大小選擇菌株。對(duì)比值大的菌落進(jìn)一步分離并保存，在編號(hào)后用于后續(xù)纖維素酶活力強(qiáng)弱的研究測(cè)定。共篩選出了13株耐硒菌株。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用文獻(xiàn)1的方法[1]。

2.2.4 內(nèi)切型β-葡聚糖酶活力的測(cè)定

內(nèi)切型β-葡聚糖酶活力的測(cè)定采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法[2]。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖溶液含糖的毫摩爾數(shù)（酶活力）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：y=0.1597x-0.0807。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 菌種的分離與篩選

通過(guò)剛果紅染色使產(chǎn)纖維素酶的菌落周?chē)纬赏该魅?，如下圖所示。共篩選出13株耐硒2500mg/L的菌株。使用剛果紅平板篩選法可以更好地篩選出耐硒纖維素菌，可以非常直觀地看出平板上分布著各種大大小小的透明圈，一個(gè)透明圈就意味著存在這樣一個(gè)耐硒菌種。另外根據(jù)菌種周?chē)该魅Φ拇笮】梢耘袛喑鏊拿府a(chǎn)量，透明圈越大說(shuō)明它的酶產(chǎn)量越多，透明圈成型越快說(shuō)明它的產(chǎn)酶量越快。

圖1 菌株在平板上形成的透明圈（箭頭所指）

3.3 菌株纖維素酶活力的測(cè)定

以液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株篩選的耐硒菌株，在12h和24h分別取樣，測(cè)定內(nèi)切型β-葡聚糖酶的活力。

Table 1 12h內(nèi)切型β-葡聚糖酶的活力

Table. 2 24h內(nèi)切型β-葡聚糖酶的活力

4 結(jié)論

纖維素是地球上最廉價(jià)和最豐富的可再生資源，可以轉(zhuǎn)化為飼料、能源、化工原料和食品等。但纖維素酶活力不高制約了纖維素的廣泛應(yīng)用。因此，選育產(chǎn)酶活力高、遺傳穩(wěn)定性好的菌株是解決纖維素有效利用的關(guān)鍵問(wèn)題之一。硒是人體必需的微量元素。硒在提高人體免疫力和抗氧化方面具有非常好的功效，并具有抗腫瘤活性，對(duì)多種癌癥具有明顯的抑制作用。這就促進(jìn)了富硒食品的研究與開(kāi)發(fā)。富硒有機(jī)肥的生產(chǎn)與應(yīng)用可以解決食品中有機(jī)硒的含量。本研究篩選了13株耐硒產(chǎn)纖維素酶菌株，下一步將對(duì)各菌株進(jìn)行鑒定。篩選的菌株可用于富硒有機(jī)肥的生產(chǎn)與利用，促進(jìn)富硒有機(jī)肥事業(yè)的發(fā)展。

[1] 蔡勇.堿性纖維素酶高產(chǎn)菌株的篩選及其基因的克隆與表達(dá)[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)，2005.

[2] 管斌，謝來(lái)蘇，丁友防，等.纖維素酶酶活力測(cè) 定方法的校正[J].無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，（4）：20-26.

武漢輕工大學(xué)大學(xué)生科研項(xiàng)目（xsky2016008）

袁帥（1996-），男，本科生。

張西鋒（1977-），男，博士，副教授。