孫琳琳++++++王海亮++++++劉益明++++++盧會(huì)芬++++++吳國(guó)強(qiáng)

[摘要] 目的 建立更為科學(xué)合理的純化水微生物限度檢測(cè)法。 方法 采用薄膜過(guò)濾法，檢驗(yàn)量分別為1 mL和10 mL，培養(yǎng)基分別選用營(yíng)養(yǎng)瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂、平板計(jì)數(shù)瓊脂、R2A培養(yǎng)基，對(duì)純化水樣進(jìn)行微生物限度檢查。 結(jié)果 采用10 mL薄膜過(guò)濾法，R2A平板培養(yǎng)基進(jìn)行純化水的微生物限度檢查，菌體檢出率高于其他方法1～2倍，菌落培養(yǎng)效果好。 結(jié)論 確認(rèn)了最優(yōu)化的檢驗(yàn)量和檢驗(yàn)用培養(yǎng)基，建立了能更準(zhǔn)確反映純化水質(zhì)量的檢測(cè)方法。該研究有利于純化水檢測(cè)方法的改進(jìn)和純化水質(zhì)量控制水平的提高。

[關(guān)鍵詞] 純化水；微生物限度檢查；薄膜過(guò)濾法；檢驗(yàn)量

[中圖分類號(hào)] R927 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）06（c）-0004-03

[Abstract] Objective To establish a more scientific and reasonable purified water microbial limit test method. Methods Membrane filtration method （sample quantity： 1 mL and 10 mL） were used to do the test， and nutrient agar， rose bengal agar medium， plate count agar and R2A medium were used to demonstrate the microbiology separately. Results Membrane filtration method （sample quantity： 10 mL） and R2A were better than the routine method and the other medium with a much higher occurrence of total aerobic plate count. The detection rate was 1-2 times higher than the rate of other method and medium. Conclusion The selected testing sample quantity and culture medium are optimal， and the optimized test method will reflect the real quality of the purified water. The study will provide support for the testing improvement and quality control level.

[Key words] Purified water； Microbial limit test； Membrane filtration method； Sample quantity

《中國(guó)藥典》2010版、2015版純化水微生物限度檢查中要求使用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行檢查[1-2]，但未對(duì)薄膜過(guò)濾法的檢測(cè)量等進(jìn)行明確規(guī)定。目前常被采用薄膜過(guò)濾法檢驗(yàn)量1 mL。已有研究表明，薄膜過(guò)濾法1 mL和平板計(jì)數(shù)法1 mL兩種方法的檢測(cè)結(jié)果一致，無(wú)明顯差異[3]，可見(jiàn)采用1 mL檢驗(yàn)量并不能體現(xiàn)薄膜過(guò)濾法的優(yōu)勢(shì)。故薄膜過(guò)濾法1 mL的檢測(cè)方法符合性、嚴(yán)謹(jǐn)性不夠。

《歐洲藥典》[4-5]、《美國(guó)藥典》[6-7]和《英國(guó)藥典》[8-9]對(duì)純化水檢測(cè)方法有不同的規(guī)定和側(cè)重點(diǎn)。目前，大部分出口歐美市場(chǎng)的制藥企業(yè)，均會(huì)按照目標(biāo)出口國(guó)的國(guó)家藥典要求進(jìn)行純化水檢測(cè)，但對(duì)于這些檢測(cè)方法的樣品檢驗(yàn)量，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)研究[10]。

本試驗(yàn)在分析2010～2012年三個(gè)年度純化水微生物限度檢測(cè)報(bào)告的基礎(chǔ)上，擬以自制純化水為研究對(duì)象，基于中國(guó)和歐美藥典的方法，對(duì)比研究了不同方法和培養(yǎng)基的檢測(cè)效果，明確了最佳檢驗(yàn)量，同時(shí)明確了更靈敏的培養(yǎng)基，建立了更科學(xué)的純化水檢測(cè)方法。該方法的建立對(duì)于提高純化水微生物限度檢查的有效性、真實(shí)性和簡(jiǎn)便性具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，并與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)接軌。

1 材料和設(shè)備

1.1 材料

純化水（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司）。

1.2 試劑及培養(yǎng)基

氯化鈉（天津大茂化學(xué)試劑廠）；磷酸二氫鉀（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；磷酸氫二鈉（天津博迪化學(xué)試劑廠）；蛋白胨培養(yǎng)基（北京三藥科技開發(fā)公司）；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（縮寫NA，北京三藥科技開發(fā)公司）；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（縮寫RBA，北京三藥科技開發(fā)公司）；平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（縮寫PCA，青島海博生物技術(shù)公司）；酵母蛋白胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（縮寫R2A，青島海博生物技術(shù)公司，德國(guó)默克）。

1.3 設(shè)備

TW-STV3A型薄膜過(guò)濾器（瑞安市圖班生物技術(shù)設(shè)備），XGL.GWX-0.36B型脈動(dòng)真空蒸汽滅菌器（山東新華醫(yī)療器械），F(xiàn)D240型干熱滅菌烘箱（德國(guó)賓德），S20K型pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器），PL202-S型電子天平（梅特勒-托利多儀器），AVC-4A1型垂直凈化工作臺(tái)（安斯克生物技術(shù)設(shè)備公司，ESCO），BD240型恒溫培養(yǎng)箱（德國(guó)賓德）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 檢驗(yàn)量的對(duì)比研究

分別取1 mL和10 mL的純化水，采用《中國(guó)藥典》2015年版（CP2015）四部中的薄膜過(guò)濾法進(jìn)行其微生物限度檢查[2]。

取少量pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液注入過(guò)濾杯中，以濕潤(rùn)濾膜。濕潤(rùn)濾膜后取10 mL或1 mL純化水樣及20～30 mL的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，過(guò)濾，取出濾膜，薄膜菌面朝上，分別置于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，細(xì)菌35℃，培養(yǎng)3 d，霉菌/酵母菌23℃，培養(yǎng)5 d[2]（作者已按照企業(yè)操作規(guī)程對(duì)該方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證）。菌落計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。

2.2 培養(yǎng)基檢測(cè)效力的對(duì)比研究

采用《美國(guó)藥典》USP-38（USP38）、《歐洲藥典》EP7.0（EP7.0）、《英國(guó)藥典》BP2015（BP2015）和CP2015中規(guī)定的薄膜過(guò)濾法[4，6，8]，設(shè)定檢測(cè)量為10 mL，分別使用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基PCA和R2A培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)培養(yǎng)。具體操作方法同“2.1”項(xiàng)下方法，取濾過(guò)后薄膜，分別置于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基和R2A瓊脂培養(yǎng)基的平板表面進(jìn)行培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 檢驗(yàn)量對(duì)比研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同檢測(cè)量的純化水微生物檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以看出，對(duì)于1 mL檢驗(yàn)量的薄膜過(guò)濾法，19個(gè)水點(diǎn)的微生物限度質(zhì)量均良好，只有2個(gè)水點(diǎn)檢測(cè)出微生物污染，且菌落數(shù)少，檢出率低（2/19），未發(fā)現(xiàn)任何不良趨勢(shì)。對(duì)于10 mL檢驗(yàn)量的薄膜過(guò)濾法，菌體檢出率較高（7/19），是1 mL檢驗(yàn)量時(shí)菌體檢出率的3.5倍，5、10、15、18和19號(hào)水點(diǎn)均反映輕微微生物侵染，能夠更好地反映純化水的微生物限度情況。13號(hào)水點(diǎn)微生物污染程度接近警戒線，便于發(fā)現(xiàn)不良趨勢(shì)，及時(shí)采取針對(duì)純化水系統(tǒng)清潔維護(hù)的整改措施?？梢?jiàn)，薄膜過(guò)濾法具有較好的集菌效果，10 mL的純化水檢測(cè)量適合于純化水的微生物限度檢查，樣本代表性較好，菌體檢出率高，能夠更加準(zhǔn)確和真實(shí)地反映純化水質(zhì)量，保證純化水系統(tǒng)的持續(xù)、穩(wěn)定、有效運(yùn)行。

3.2 培養(yǎng)基培養(yǎng)效力對(duì)比研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

使用不同培養(yǎng)基進(jìn)行微生物限度檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)表2。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)可以看出，對(duì)于相同樣本，使用營(yíng)養(yǎng)瓊脂和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板檢測(cè)和使用PCA培養(yǎng)基平板檢測(cè)的微生物檢出率較低（前者共有21個(gè)水點(diǎn)未檢出菌體，后者共有18個(gè)水點(diǎn)未檢出菌體），檢出情況基本一致，差異量均≤1 cfu/10 mL。并且使用營(yíng)養(yǎng)瓊脂與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基檢測(cè)需要制備兩張濾膜，工作量較大。而采用R2A瓊脂進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，每個(gè)水點(diǎn)只需要制備一張濾膜即可，并且菌體檢出率較高，共計(jì)14個(gè)水點(diǎn)微生物限度檢出（結(jié)果均<3 cfu/mL），每個(gè)水點(diǎn)的菌體檢出量均較多，最大差異量體現(xiàn)在：0622-08樣品，R2A培養(yǎng)基（檢出量21 cfu/10 mL）高于營(yíng)養(yǎng)瓊脂和玫瑰紅鈉瓊脂（檢出量10 cfu/10 mL）約1倍；0622-19樣品，R2A培養(yǎng)基（15 cfu/10 mL）高于營(yíng)養(yǎng)瓊脂和玫瑰紅鈉瓊脂（5 cfu/10 mL）約2倍?？梢?jiàn)，R2A瓊脂培養(yǎng)基具有較高的靈敏性，更適合于純化水中微生物限度的檢測(cè)。

4 討論

USP、EP、BP和CP中均規(guī)定采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行純化水微生物限度檢查，但對(duì)于純化水的檢驗(yàn)量都未明確規(guī)定，要求各單位根據(jù)實(shí)際用水情況和所安裝純水系統(tǒng)性能自定檢驗(yàn)量[10]。純化水水質(zhì)是決定檢驗(yàn)量的基礎(chǔ)，通過(guò)本文的系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)前大多企業(yè)為追求操作簡(jiǎn)單只選定1 mL作為檢驗(yàn)量是有所局限的，這個(gè)量并不能真實(shí)反映純化水的質(zhì)量，也不利于純化水系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)和維護(hù)。

純化水微生物限度年度質(zhì)量回顧和趨勢(shì)分析是確定檢驗(yàn)量的重要依據(jù)，本研究基于石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司3年來(lái)大量的純化水分析數(shù)據(jù)，找到了較合適的檢驗(yàn)量，供讀者參考應(yīng)用。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)使用營(yíng)養(yǎng)瓊脂和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果與使用PCA培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果基本一致，可能只檢出了水樣含菌總數(shù)的一部分，未能完全反映水樣中微生物的存在情況，這與顧孔珍等[11]的報(bào)道一致。R2A培養(yǎng)基屬于低營(yíng)養(yǎng)類培養(yǎng)基，其營(yíng)養(yǎng)成分較廣泛，能促進(jìn)受損細(xì)菌的恢復(fù)性再生長(zhǎng)，更適用于純化水的檢測(cè)。這將避免由于培養(yǎng)基靈敏度不夠而造成的純化水質(zhì)量不良趨勢(shì)無(wú)法被發(fā)現(xiàn)的情況，能夠及時(shí)準(zhǔn)確地反映純化水系統(tǒng)運(yùn)行情況，及時(shí)維護(hù)，延長(zhǎng)系統(tǒng)壽命。

本文研究所確定的方法可大大提高純化水微生物限度檢測(cè)的有效性，有利于生產(chǎn)和檢驗(yàn)中純化水質(zhì)量的控制。同時(shí)，也為其他制藥企業(yè)建立合適的純化水微生物限度法提供參考和指導(dǎo)。

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