溫硯子 張 平 黃建榮

（中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣東廣州 510275）

傳統(tǒng)上瘧原蟲的血涂片染色主要采用的是Giemsa染色法［1］。但Giemsa染色效果易受到染色液質(zhì)量（包括染色液制備時(shí)間、染色液的來源、是否進(jìn)行充分過濾等）、染色時(shí)間、沖洗時(shí)間等因素的影響［2-3］，穩(wěn)定性較差。在教學(xué)過程中，學(xué)生的操作參差不齊，呈現(xiàn)的染色效果差異很大，直接影響后續(xù)的觀察，影響到教學(xué)質(zhì)量的穩(wěn)定。Diff-Quik染色法是世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的一種快速染色方法［4］。主要是由以美藍(lán)和伊紅為基礎(chǔ)的Wright染色法改良而來，和Wright染色方法相比進(jìn)一步縮短了染色時(shí)間。而傳統(tǒng)Giemsa染色液采用天青B和曙紅Y為基礎(chǔ)，2種染料在水溶液中易氧化形成沉淀。和Giemsa染色法相比，Diff-Quik染色時(shí)間更短，染液穩(wěn)定無沉渣、染色背景清晰?；谶@些優(yōu)點(diǎn)，Diff-Quik染色法在國(guó)內(nèi)外已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，包括精子染色、血液染色、體液（體腔液和尿液）染色、穿刺細(xì)胞學(xué)標(biāo)本染色、甲狀腺穿刺細(xì)胞學(xué)染色及非腫瘤病變的細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察等［5-6］。本研究將比較Giemsa和Diff-Quik 2種染色方法對(duì)瘧原蟲血涂片染色后的效果。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1）由中山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的感染伯氏瘧原蟲（Plasmodium Berghei）的 BALB/C小鼠 2只（感染率約10%~20%）。

2）試劑：Giemsa 染液（Sigma，USA），Diff-Quik A/B 染液（Baso，中國(guó)），甲醇，清水，pH6.6 磷酸緩沖液。

3）器材：小鼠取血夾，剪刀，玻片，染色板，滴管，燒杯。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1）取感染瘧原蟲的BALB/C小鼠，剪尾末端，取適量的血于玻片上，制作血涂片，并將玻片進(jìn)行標(biāo)記。

2）甲醇固定，干燥后進(jìn)行染色。

3）染色（采用2種不同染色方法）。

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①Giemsa染色法：將玻片血膜朝下放置于染色板上，滴加1×Giemsa染液與涂片上血膜接觸，染色30~40 min。

②Diff-Quik染色法：將Diff-Quik A染液滴加至玻片上，覆蓋血膜，染色30 s；用pH6.6的磷酸緩沖液沖洗多余的染液，稍甩干；將Diff-Quik B染液滴加至玻片上，覆蓋涂片上的血膜，染色30 s。

4）洗片。將染色后的玻片放入盛滿清水的燒杯中，隨后取出，待玻片自然干燥后在油鏡下進(jìn)行觀察。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論

1）經(jīng)Giemsa染色的小鼠瘧原蟲血涂片，背景顏色較淡，紅細(xì)胞著色不深（圖1），在課堂教學(xué)中由于學(xué)生處理不當(dāng)（例如過度洗脫染液），甚至出現(xiàn)紅細(xì)胞完全不著色的情況。這樣的染色效果讓學(xué)生無法準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)小鼠瘧原蟲的感染率。同時(shí)，經(jīng)Giemsa染色后的瘧原蟲細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)顏色分辨不明顯，特別是細(xì)胞質(zhì)相對(duì)較小的環(huán)狀體，經(jīng)Giemsa染色后不能明顯展現(xiàn)它的典型結(jié)構(gòu)（圖1A），影響學(xué)生對(duì)瘧原蟲紅內(nèi)期各形態(tài)做出正確判斷。

圖1 伯氏瘧原蟲血涂片不同染色方法比較（400×）

2）Giemsa染液殘?jiān)^多，即使在對(duì)染液進(jìn)行過濾處理，但在染色后的血涂片上仍不可避免地出現(xiàn)一些殘?jiān)?，干擾初學(xué)者對(duì)血涂片中原蟲的觀察和分析。

3）Giemsa染色法耗時(shí)長(zhǎng)，需要 30~40 min，Diff-Quik染色法則只需要30 s。

Diff-Quick染色已經(jīng)被證實(shí)能夠很好地反映細(xì)胞質(zhì)細(xì)節(jié)［2，7］，Diff-Quik 染色后紅細(xì)胞及瘧原蟲的著色明顯，瘧原蟲的細(xì)胞核（紫紅色）和細(xì)胞質(zhì)（藍(lán)色）容易區(qū)分，并且血涂片背景干凈、清晰。將Diff-Quik染色法應(yīng)用于瘧原蟲血涂片染色的教學(xué)中，能確保教學(xué)順利進(jìn)行，以達(dá)到教學(xué)目的，也為實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量的教學(xué)提供保障。

此外，甲醇固定干燥后應(yīng)盡快進(jìn)行染色，否則細(xì)胞脫水嚴(yán)重，影響染色效果。用Diff-Quik染液A染色后，需要用磷酸緩沖液清洗多余的染液。多次試驗(yàn)效果顯示，需保證磷酸緩沖液的pH值為6.6，過堿溶液將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)不著色。

Giemsa染色后的瘧原蟲血涂片保存時(shí)間較長(zhǎng)，約2~3年［8］利用 Diff-Quik染色法獲得的玻片是否能進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間保存還需進(jìn)一步證實(shí)。與Giemsa染色相比，瘧色素累積形成的瘧色粒經(jīng)Diff-Quik染液染色后呈深藍(lán)色，不像Giemsa染色后表現(xiàn)出褐色，深藍(lán)色不易與細(xì)胞質(zhì)分開。