朱素英,王宜磊

(菏澤學(xué)院生命科學(xué)系,山東菏澤 274015)

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響應(yīng)曲面法對(duì)產(chǎn)藍(lán)色素鏈霉菌YLA0的高產(chǎn)色素條件優(yōu)化

朱素英,王宜磊*

(菏澤學(xué)院生命科學(xué)系,山東菏澤 274015)

以鏈霉菌YLA0作為出發(fā)菌株來優(yōu)化其高產(chǎn)藍(lán)色素的培養(yǎng)條件,單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,篩選出C/N比、pH、培養(yǎng)時(shí)間三個(gè)單因素,利用Box-Behnken的響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化。結(jié)果表明,鏈霉素YLA0高產(chǎn)藍(lán)色素的最佳培養(yǎng)條件為:C/N比為14∶1、pH7.63、培養(yǎng)時(shí)間169.69 h,得率11.67 mg/100 mL。該條件下的實(shí)際值為優(yōu)化值的97.04%,說明該模型可靠,可用于鏈霉菌YLA0高產(chǎn)藍(lán)色素培養(yǎng)條件的優(yōu)化。

鏈霉菌YLA0,響應(yīng)曲面法,藍(lán)色素,優(yōu)化

天然色素因其無毒、非致癌性以及在環(huán)境中可降解,在食品、紡織、化妝品等行業(yè)逐漸受到人們的重視[1-2]。利用微生物生產(chǎn)色素,具有易于培養(yǎng),繁殖快,不受季節(jié)、空間和環(huán)境的影響等優(yōu)于動(dòng)物色素與植物色素的多種特點(diǎn)[3-5]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)微生物產(chǎn)藍(lán)色素除了可以用作染料外,有些微生物藍(lán)色素還具有一定的藥用和營養(yǎng)價(jià)值。南海海洋細(xì)菌Pseudomonassp.產(chǎn)生的藍(lán)色素,以及靈菌紅素具有抗腫瘤活性[7-9]等,藍(lán)色素作為三大基本色素之一,可以和紅、黃色素調(diào)成各種顏色。另外國內(nèi)外從微生物中提取藍(lán)色素研究相對(duì)其它色素較少[5],目前研究產(chǎn)生藍(lán)色素微生物主要集中在鏈霉菌[7-8],其它的還有節(jié)桿菌屬[10]、假單胞菌屬[11]、紫色桿菌屬[12]、杜搟氏菌屬[8]等少數(shù)種類,因此利用微生物生產(chǎn)藍(lán)色素研究尤為重要。

本研究以首次從菏澤牡丹根際分離誘變得到的鏈霉菌YLA0作為實(shí)驗(yàn)材料,通過發(fā)酵培養(yǎng),研究多種單因素對(duì)鏈霉菌YLA0產(chǎn)藍(lán)色素的影響,以及在單因素的基礎(chǔ)上首次利用響應(yīng)曲面法對(duì)鏈霉菌YLA0高產(chǎn)藍(lán)色素的培養(yǎng)條件優(yōu)化,為鏈霉菌YLA0產(chǎn)藍(lán)色素進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鏈霉菌(Streptomycessp.)YLA0 從菏澤牡丹根際分離出的產(chǎn)藍(lán)色素鏈霉菌(Streptomycessp.)YLA11菌株,經(jīng)誘變、篩選而獲得。藍(lán)色素的鏈霉菌(Streptomycessp.)YLA0菌株已被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,其保藏編號(hào)為CGMCC No:11335。固體斜面培養(yǎng)基 高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基;種子培養(yǎng)基 參考文獻(xiàn)[13];發(fā)酵培養(yǎng)基 高氏一號(hào)培養(yǎng)基:可溶性淀粉20.0 g,干酪素0.5 g,硝酸鉀(KNO3)1.0 g,氯化鈉(NaCl)0.5 g,磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.5 g,硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.5 g,硫酸鋅(ZnSO4)0.01 g,硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)0.01 g,蒸餾水1000 mL,pH7.4。試劑和藥品均為國產(chǎn)分析純。

高速冷凍離心機(jī) 湖南赫西離心機(jī)儀器有限公司;HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子有限公司;DZF-6050型真空干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)公司;TU-1810型紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鏈霉菌YLA0的培養(yǎng) 將低溫保存的鏈霉菌YLA0菌種活化后接種在斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行產(chǎn)孢,長出孢子后,挑2環(huán)孢子接種到種子培養(yǎng)液中,種子培養(yǎng)液為于250 mL錐形瓶裝30 mL的無菌培養(yǎng)液,于30 ℃,200 r/min搖床培養(yǎng)24 h后,再轉(zhuǎn)接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)液中,30 ℃搖床培養(yǎng)200 r/min培養(yǎng)7 d。

1.2.2 色素的提取方法 發(fā)酵液于5000 r/min離心10 min,得上清液再次12000 r/min離心15 min,將第二次離心所獲得的上清液經(jīng)截流分子量10 kDa濾膜超濾,超濾濃縮液中加濃H2SO4進(jìn)行酸沉,后再次5000 r/min離心15 min,棄上清液,得沉淀一,在沉淀一中加入40%的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至7.5,沉淀一溶解,得清液A,向清液A加入無水乙醇,進(jìn)行醇沉處理,醇沉處理完畢離心分離得沉淀二,將沉淀二烘干至恒重,得純化固體藍(lán)色色素。

1.2.3 藍(lán)色素含量測(cè)定方法 藍(lán)色素含量測(cè)定參考文獻(xiàn)[14],將得到的藍(lán)色素溶解定容于100 mL乙醇溶液,用分光光度計(jì)進(jìn)行全波長掃描,在波長596 nm處有最大吸收峰,最大吸收波長596 nm下測(cè)色素溶液的光密度(OD)。

藍(lán)色素得率的計(jì)算方法:Y(%)=W/L×100

式(1)

式(1)中:Y為藍(lán)色素得率,W為得到純化固體藍(lán)色色素質(zhì)量,L為發(fā)酵液的體積。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 無機(jī)離子對(duì)藍(lán)色素產(chǎn)量的影響 在高氏一號(hào)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,固定其它物質(zhì)的量不變,按照0.05 g/100 mL培養(yǎng)基加入不同的無機(jī)鹽,代替培養(yǎng)基中的NaCl。115 ℃,高壓滅菌15 min,接種后30 ℃培養(yǎng)。

1.2.4.2 碳源、氮源對(duì)藍(lán)色素產(chǎn)量的影響 在高氏一號(hào)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,分別用2 g/100 mL的葡萄糖、甘露糖等取代淀粉作為碳源,分別用0.1 g/100 mL等量的硝酸銨、氯化銨等物質(zhì)取代硝酸鉀進(jìn)行氮源利用情況實(shí)驗(yàn),分別研究不同碳源和氮源對(duì)藍(lán)色素產(chǎn)量的影響。115 ℃,高壓滅菌15 min,接種后30 ℃培養(yǎng)。

1.2.4.3 C/N(碳/氮)比對(duì)藍(lán)色素產(chǎn)量的影響 以高氏一號(hào)培養(yǎng)基為基礎(chǔ),固定氮源的量不變(KNO3為1 g/L),分別稱量100 mL培養(yǎng)基中不同量的淀粉(3.2,2.88,2.56,2.24,1.92,1.6,1.28,0.96,0.64,2.0 g使C/N為12.5)使C/N比符合表5要求。115 ℃,高壓滅菌15 min,接種后30 ℃培養(yǎng)。

1.2.4.4 初始pH對(duì)色素產(chǎn)量的影響 在高氏一號(hào)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,分別用10%的HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH為3、4、5、6、7、8、9、10、11常規(guī)滅菌冷卻后以10%的接種量接種,觀察初始pH對(duì)色素產(chǎn)生的影響。

1.2.4.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)色素產(chǎn)生的影響 從發(fā)酵培養(yǎng)的第24 h開始,每隔24 h發(fā)酵瓶中取10 mL菌液。再經(jīng)12000 r/min離心10 min,棄沉淀后,測(cè)量在596 nm處的OD值。依據(jù)色素圖譜觀察色素產(chǎn)生量的變化,直到色素濃度不再變化。

1.2.5 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以無機(jī)離子濃度、碳源、氮源、不同C/N、初始pH、培養(yǎng)時(shí)間作為單因素來探明對(duì)色素產(chǎn)生的影響,數(shù)據(jù)結(jié)果運(yùn)用excel2007處理。

在以上單因素的基礎(chǔ)上,選擇C/N、初始pH和培養(yǎng)時(shí)間三個(gè)因素,Design Expert進(jìn)行Box-Behnken三因素三水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

Design Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面數(shù)據(jù)分析和繪圖。其它數(shù)據(jù)利用excel 2007進(jìn)行分析和繪圖,方差分析利用spss 22.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)藍(lán)色素產(chǎn)生的影響

表2 無機(jī)離子對(duì)色素產(chǎn)生的影響Table 2 Effect of inorganic ions on pigment production

2.1.2 碳源、氮源對(duì)產(chǎn)藍(lán)色色素的影響 由表3可以看出,鏈霉菌YLA0能夠較好利用的碳源為:木質(zhì)素、淀粉、半纖維素、木聚糖、麥芽糖,只有木質(zhì)素可以產(chǎn)生極深藍(lán)色的藍(lán)色素,且菌絲生物量可達(dá)5.828 g/100 mL,半纖維素可以產(chǎn)生深藍(lán)色的藍(lán)色素,但菌絲生物量產(chǎn)生較少,其它三種只能產(chǎn)生顏色較淺的藍(lán)色素。不能作為藍(lán)色色素分泌的碳源物質(zhì)有:木糖、蔗糖和羧甲基纖維素鈉、果膠;能分泌少量色素的碳源物質(zhì)為:葡萄糖、甘露糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇。

表3 碳源對(duì)藍(lán)色素產(chǎn)生的影響Table 3 Effects of carbon source on the blue pigment production

注:較好利用:+++,利用:++,利用較差:+,不利用:-,表4同。

表4 氮源對(duì)藍(lán)色素產(chǎn)生的影響Table 4 Effects of nitrogen sources on the production of blue pigment

表5 不同C/N對(duì)色素產(chǎn)生的影響Table 5 Effects of C/N ratio on the pigment production

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)色素產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of culture time on the yield of blue pigment production

由表4看出,該菌不能利用磷酸銨、磷酸二氫銨、牛肉膏、酵母提取物、干酪素做氮源產(chǎn)生色素,但除氯化銨和磷酸二氫銨利用較弱外,其它的基本上都能利用其生長;產(chǎn)生色素較少的氮源物質(zhì)有硫酸銨、氯化銨、草酸銨,因此銨鹽不利于色素的產(chǎn)生。牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨和酵母提取物做氮源均不能產(chǎn)生藍(lán)色素;產(chǎn)生藍(lán)色素較好的氮源是玉米粉，硝酸鉀次之、尿素再次之;就生物量來說,干酪素明顯高于其它氮源,在進(jìn)行種子培養(yǎng)時(shí)可考慮加入。

2.1.3 不同C/N對(duì)色素產(chǎn)生的影響 由表5可知,C/N為14∶1時(shí),產(chǎn)生色素的量最大,生物量也較大。

2.1.4 初始pH對(duì)色素產(chǎn)生的影響 由表6可以看出,初始pH為7左右時(shí)最適于色素的分泌和菌絲體的生長。

表6 pH對(duì)藍(lán)色素產(chǎn)生的影響Table 6 Effects of pH on the pigment production

表8 響應(yīng)曲面二次回歸模型的方差分析Table 8 Results of the analysis of variance to the response surface quadratic model

注:**表示在p<0.01時(shí)極顯著;*p<0.05時(shí)顯著。2.1.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)色素分泌的影響 對(duì)圖1色素OD值折線圖的分析,發(fā)現(xiàn)鏈霉菌YLA0在培養(yǎng)過程中,在48 h開始產(chǎn)生色素,但產(chǎn)量較小,144 h開始大量產(chǎn)生,從168 h開始增速變緩,甚至216 h時(shí)，OD值開始稍有下降。根據(jù)成本節(jié)約原則,選取168 h為提取時(shí)間的終點(diǎn)。

2.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化培養(yǎng)條件

利用design-expert軟件,培養(yǎng)條件的Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7。

表7 藍(lán)色素產(chǎn)量的響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 7 Response surface design and results of the blue pigment production

利用表7實(shí)驗(yàn)結(jié)果,design-expert軟件二次多項(xiàng)式回歸擬合,藍(lán)色素OD值對(duì)自變量的方程為:Y=-20.60975+2.56559A-1.15605B+0.2515C+0.11662AB-0.00067708AC+0.00286458BC-0.29035A2-0.003525B2-0.000861285C2

根據(jù)表7結(jié)果,利用design-expert軟件進(jìn)行繪圖分析,從圖2可以看出三者的交互效應(yīng),等高線越扁,交互效應(yīng)越明顯,等高線越圓,交互效應(yīng)影響越小,從圖可以看出,AB、BC等高線較扁,說明PH與C/N、C/N與培養(yǎng)時(shí)間之間的交互響應(yīng)對(duì)藍(lán)色素的產(chǎn)量影響最顯著。

圖2 交互作用對(duì)鏈霉菌YLA0藍(lán)色素產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots showing the effects of interactions on the production of blue pigmengt from Streptomyces sp. YLA0

利用Design-expert軟件進(jìn)一步分析,根據(jù)表7數(shù)據(jù),獲得藍(lán)色素產(chǎn)量最高的鏈霉菌YLA0的最佳培養(yǎng)條件為:C/N比為14∶1、pH7.63、培養(yǎng)時(shí)間169.69 h,其吸光度(OD值)為1.69,最佳條件下理論得率12.03 mg/100 mL,即每100 mL發(fā)酵液,含有12.03 mg的藍(lán)色素。

2.3 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

為驗(yàn)證優(yōu)化條件的可行性,在實(shí)驗(yàn)室條件下以C/N比為14∶1、pH7.63、培養(yǎng)時(shí)間169.69 h(約為169 h 41 min),高氏一號(hào)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)進(jìn)行培養(yǎng)鏈霉菌YLA0,三個(gè)重復(fù),提取獲得藍(lán)色素的OD值平均值為1.64,得率為 11.67 mg/100 mL?？芍獙?shí)際值為優(yōu)化值的97.04%。說明優(yōu)化條件是可行有效的。

3 結(jié)論

利用響應(yīng)曲面法研究鏈霉菌YLAO培養(yǎng)條件對(duì)其藍(lán)色素產(chǎn)生的影響,首先確定了無機(jī)離子、碳源、氮源等被利用的情況,選取不同C/N、初始pH、培養(yǎng)

時(shí)間三個(gè)影響顯著單因素梯度(其它單因素梯度實(shí)驗(yàn)因篇幅限制省略),結(jié)果顯示添加適量Mn2+,木質(zhì)素,玉米粉有利于藍(lán)色素的產(chǎn)生,14∶1的碳氮比,pH7,培養(yǎng)時(shí)間162 h為最佳單因素培養(yǎng)條件;在單因素基礎(chǔ)上,利用Design-expert軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì),對(duì)鏈霉素YLAO產(chǎn)藍(lán)色素產(chǎn)量與碳氮比、pH、培養(yǎng)時(shí)間建立二次多元回歸方程,獲得高產(chǎn)色素的最佳條件為C/N比為14∶1、pH7.63、培養(yǎng)時(shí)間169.69 h,其吸光度為1.69,最佳條件下理論得率12.03 mg/100 mL。且經(jīng)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證，OD值為1.64，得率為11.67 mg/100 mL,說明模型是合理可行的,可很好的預(yù)測(cè)鏈霉素YLAO的藍(lán)色素產(chǎn)量。

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Optimization of fermentative conditions for high yield blue pigmentfromStreptomycessp.YLA0 using response surface methodology

ZHU Su-ying,WANG Yi-lei*

(Department of Life Science,Heze University,Heze 274015,China)

Streptomycessp. YLA0 was used as the experimental material to optimize the culture condition of high yield blue pigment. Based on the single factor experiment,C/N ratio,pH and culture time as three single factors were selected and optimized by Box-Behnken response surface design. The results showed that the optimal culture conditions ofStreptomycinsp. YLA0 were as follows:C/N ratio was 14∶1,pH7.63,culture time was 169.69 h,and the yield was 11.67 mg/100 mL. Under this condition,the actual value was 97.04% of the optimized value,and the results showed that the model was reliable and could be used to optimize the culture condition ofStreptomycessp. YLA0.

Streptomycessp. YLA0;response surface methodology;blue pigment;optimization

2016-12-08

朱素英(1980-)，女，碩士，講師，研究方向：生物有效成分的提取與利用，E-mail:zhu-suying@126.com。

*通訊作者:王宜磊(1964-)，男，本科，教授，研究方向：微生物生理學(xué)及發(fā)酵工程，E-mail:279095893@qq.com。

微生物與發(fā)酵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目；菏澤學(xué)院校級(jí)項(xiàng)目(XYKJ16)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)13-0167-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.031