尚遠(yuǎn)宏,田金鳳

(攀枝花學(xué)院,四川攀枝花 617000)

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梓葛凍干粉針對(duì)腦缺血/再灌注損傷大鼠腦微血管通透性的保護(hù)作用

尚遠(yuǎn)宏,田金鳳

(攀枝花學(xué)院,四川攀枝花 617000)

本文探討梓葛凍干粉針對(duì)腦缺血/再灌注損傷大鼠腦微血管通透性的影響。選擇雄性SD大鼠272只,隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、葛根素注射液組和梓葛凍干粉針3個(gè)劑量組。線栓法復(fù)制大鼠缺血再灌注模型,分別缺血2 h,于再灌注1、4、7、14 d給藥后,取腦提取微血管,用RT-PCR法測定腦微血管中閉合蛋白(Occludin)、緊密連接蛋白-5(Claudin-5)、閉合小帶蛋白-1(ZO-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的mRNA表達(dá)。結(jié)果表明,與模型組相比,再灌注4、7、14 d,梓葛凍干粉針16.40、32.70、65.40 mg·kg-1能抑制腦缺血/再灌注大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層微血管中MMP-9 mRNA表達(dá)的升高(p<0.01);并促進(jìn)微血管中Claudin-5、Occludin、ZO-1 mRNA表達(dá)(p<0.05)。說明梓葛凍干粉針通過抑制MMP-9基因表達(dá),并促進(jìn)Claudin-5、Occludin、ZO-1基因表達(dá),進(jìn)而保護(hù)和改善腦微血管通透性。

梓葛凍干粉針,Claudin-5,Occludin,ZO-1,MMP-9,腦微血管通透性

梓葛凍干粉針主要由《千金方》中方劑“羌活湯”中藥食同源的葛根提取的葛根素和熟地黃提取的梓醇組成,并由西南大學(xué)中藥研究所依據(jù)食療養(yǎng)生防病思路自主研制的治療腦卒中的制劑(專利公開號(hào)CN101574361A)[1]。葛根為豆科植物野葛的干燥塊根,是中國南方一些省區(qū)的一種常食蔬菜,其味甘涼可口,常作煲湯之用,也可作為藥物應(yīng)用。其分離的葛根素是異黃酮類衍生物,水溶性差,具有擴(kuò)冠、抗氧化、保護(hù)心肌和腦神經(jīng)作用,臨床上用于治療冠心病、心絞痛、高血壓等疾病。熟地黃原名地黃,補(bǔ)血滋陰,益精填髓。

表1 Real-time PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小Table 1 Primer sequences used for Real-time PCR and the products' size

其分離的梓醇是一種環(huán)烯醚萜葡萄糖苷類化合物,易溶于水,具有抗癌、神經(jīng)保護(hù)、抗炎、利尿、降血糖及抗肝炎病毒等作用。梓葛凍干粉針充分利用了食物原料的特性來調(diào)節(jié)機(jī)體功能,使人類獲得健康或愈疾防病。

腦微血管是腦微循環(huán)的主要組成部分和物質(zhì)交換場所,也是腦缺血損傷的最敏感部位[2]。而腦微血管通透性主要取決于內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接,緊密連接不僅是細(xì)胞間屏障,而且是具有控制細(xì)胞生長發(fā)育和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的膜蛋白結(jié)構(gòu)。其中,跨膜蛋白Occludin、Claudin-5和膜相關(guān)蛋白ZO-1的結(jié)構(gòu)、功能異常與微血管通透性破壞密切相關(guān)[3-4],且MMP-9能降解緊密連接蛋白Claudins和Occludins,在腦缺血再灌注損傷急性期加重血腦屏障破壞,使腦微血管通透性增強(qiáng),并參與腦水腫和腦出血的組織損傷過程[5-6]。課題組發(fā)現(xiàn)梓葛凍干粉針改善腦缺血/再灌注損傷大鼠腦微血管通透性可能與抑制MMP-9蛋白表達(dá),并促進(jìn)Claudin-5、Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)有關(guān)[7],但是該制劑對(duì)影響腦微血管通透性的4個(gè)相關(guān)蛋白的基因表達(dá)變化尚不清楚。本研究擬通過復(fù)制腦缺血/再灌注損傷大鼠模型,考察梓葛凍干粉針對(duì)影響大鼠腦微血管通透性的4個(gè)相關(guān)蛋白與其基因表達(dá)變化的關(guān)聯(lián)性,并為梓葛凍干粉針的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梓葛凍干粉針(規(guī)格:49 mg/瓶,成分為葛根素和梓醇)[8-9]西南大學(xué)中藥研究所;葛根素注射液 成都天臺(tái)山制藥有限公司;TRlzol Reagent 美國ambion公司;qPCR Master Mix 德國TaKaRa公司;RT mix 美國Vazyme公司;DEPC 美國Sigma公司;Agarose 上?；蚬?葡聚糖-40 美國Fisher公司;HEPES 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司;T-PER組織蛋白提取液 美國Pierce生物技術(shù)公司;蛋白酶抑制劑 美國sigma公司;其他常規(guī)化學(xué)試劑 均為分析純，成都科龍化工試劑廠。

熒光定量PCR儀 瑞士Roche公司;Elx800型酶標(biāo)儀 美國Bio Tek儀器有限公司;BI 2000數(shù)字圖像分析系統(tǒng) 成都泰盟軟件公司。

1.2 動(dòng)物分組及給藥

取雄性SD大鼠272只(由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供應(yīng),合格證號(hào):SCXK(渝)2007-0001),體質(zhì)量(280±25) g,SPF級(jí),隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、葛根素注射液組和梓葛凍干粉針3個(gè)劑量組。假手術(shù)組32只,其余各組48只動(dòng)物,線栓法復(fù)制大鼠I/R模型[10],再灌注時(shí)即刻給藥(再灌注0 h),尾靜脈注射給藥,每天1次(10 mL·kg-1,體質(zhì)量),造模后有4個(gè)考察時(shí)間點(diǎn)(缺血2 h再灌注1、4、7、14 d),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組取材8只造模成功動(dòng)物,假手術(shù)組和模型組給同等體積的生理鹽水。

1.3 樣品采集及操作

參照文獻(xiàn)方法[7,11],采集腦微血管。RT-PCR樣本處理:取0.1 g腦微血管沉淀加入1 mL TRIzol試劑,-80 ℃保存(備RNA提取用)。

1.4 RT-PCR法分析

根據(jù)試劑盒說明書操作,先提取總RNA,定量后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),上PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增曲線:94 ℃ 5 min;94 ℃ 20 s,60 ℃ 30 s,循環(huán)45次,60 ℃單點(diǎn)檢測信號(hào)。溶解曲線:95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,95 ℃ 15 s,連續(xù)檢測信號(hào),最后得PCR產(chǎn)物并分析數(shù)據(jù)(2-⊿⊿Ct法計(jì)算,以(-actin為內(nèi)參照基因,與假手術(shù)組(作基準(zhǔn)值,對(duì)照)相比,得到目的基因表達(dá)的相對(duì)定量值(RQ值),將RQ值統(tǒng)計(jì)分析)。根據(jù)GenBank中已知序列,按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)引物的要求,引物由上海生物工程公司合成,目標(biāo)基因的序列見表1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 腦缺血/再灌注大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層微血管中總RNA提取結(jié)果

各組腦組織提取總RNA的OD260/OD280比值均在1.6～1.8之間,表明提取的總RNA完整性好。提取的微血管中總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳可見28、18、5 S三個(gè)條帶,無明顯降解條帶,無DNA污染條帶,表明提取的總RNA純度較高。見圖1。

圖1 總RNA電泳鑒定結(jié)果Fig.1 The electorphoersis identification of total RNA注:1、Marker;2、葛根素注射液組;3、假手術(shù)組; 4、5、6、梓葛凍干粉針16.40、32.70、 65.40 mg·kg-1組;7、模型組。

2.2 梓葛凍干粉針抑制腦缺血/再灌注大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層微血管中MMP-9 mRNA表達(dá)的升高

通過SYBR Green I染料法實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測腦缺血再灌注大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層微血管中MMP-9基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,假手術(shù)組皮層腦組織中有少量MMP-9 mRNA表達(dá)。腦缺血再灌注后,各考察時(shí)間點(diǎn)(1、4、7、14 d),與假手術(shù)組相比,模型組的大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層微血管中MMP-9 mRNA表達(dá)均呈升高趨勢,分別升高487.0%、349.8%、301.6%和276.8%(p<0.01),顯示造模成功,且隨著觀察時(shí)間延長而逐漸下降,其中再灌注后第1 d時(shí)大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層微血管中MMP-9 mRNA表達(dá)相對(duì)最高,與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[12-14]。與模型組相比,葛根素注射液組(30.00 mg·kg-1),梓葛凍干粉針16.40、32.70、65.40 mg·kg-1組均能極顯著降低大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層微血管中MMP-9 mRNA表達(dá)水平(p<0.01)。見圖2。

圖2 梓葛凍干粉針對(duì)腦缺血/再灌注1、4、7、14 d大鼠 缺血側(cè)腦皮質(zhì)層MMP-9 mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Effects of Zige lyophilized powder on MMP-9 mRNA levels of the cortex in focal cerebral注:在相應(yīng)時(shí)間下,與假手術(shù)組比較##p<0.01; 與模型組相比*p<0.05,**p<0.01。圖3～圖5同。

2.3 梓葛凍干粉針促進(jìn)腦缺血/再灌注大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層微血管中Claudin-5 mRNA、Occludin mRNA和ZO-1 mRNA表達(dá)

腦缺血再灌注后,各考察時(shí)間點(diǎn)(1、4、7、14 d),與假手術(shù)組相比,模型組的大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層微血管中Claudin-5 mRNA表達(dá)均呈降低趨勢,分別降低35.44%、32.73%、29.44%和29.08%(p<0.01),顯示造模成功。與模型組相比,葛根素注射液組(30.00 mg·kg-1),梓葛凍干粉針32.70 mg·kg-1和65.40 mg·kg-1組均能極顯著升高大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層微血管中Claudin-5 mRNA表達(dá)水平(p<0.01),而梓葛凍干粉針16.40 mg·kg-1組僅在7 d時(shí)能顯著升高Claudin-5 mRNA表達(dá)水平(p<0.05)。見圖3。

圖3 梓葛凍干粉針對(duì)腦缺血/再灌注1、4、7、14 d大鼠 缺血側(cè)腦皮質(zhì)層claudin-5 mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effects of Zige lyophilized powder on claudin-5 mRNA levels of the cortex in focal cerebral ischemia-reperfusion

腦缺血再灌注后,各考察時(shí)間點(diǎn)(1、4、7、14 d),與假手術(shù)組相比,模型組的大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層微血管中Occludin mRNA表達(dá)均呈降低趨勢,分別降低37.81%、32.09%、21.07%和23.11%(p<0.01),顯示造模成功。與模型組Occludin mRNA表達(dá)相比,除葛根素注射液組(30.00 mg·kg-1)在再灌注1 d升高無差異外,葛根素注射液其余時(shí)間組(30.00 mg·kg-1),梓葛凍干粉針16.40、32.70、65.40 mg·kg-1組均能極顯著升高大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層微血管中Occludin mRNA表達(dá)水平(p<0.01)。見圖4。

圖4 梓葛凍干粉針對(duì)腦缺血/再灌注1、4、7、14 d大鼠 缺血側(cè)腦皮質(zhì)層occludin mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effects of Zige lyophilized powder on occludin mRNA levels of the cortex in focal cerebral ischemia-reperfusion

腦缺血再灌注后,各考察時(shí)間點(diǎn)(1、4、7、14 d),與假手術(shù)組相比,模型組的大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層微血管中ZO-1 mRNA表達(dá)均呈降低趨勢,分別降低41.08%、23.11%、21.08%和23.16%(p<0.01),顯示造模成功。與模型組ZO-1 mRNA表達(dá)相比,除葛根素注射液組(30.00 mg·kg-1)和梓葛凍干粉針16.40 mg·kg-1組在再灌注1 d時(shí)升高無差異外,葛根素注射液其余時(shí)間組(30.00 mg·kg-1),梓葛凍干粉針16.40 mg·kg-1(4、7、14 d)、32.70 mg·kg-1和65.40 mg·kg-1組均能顯著升高大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層微血管中ZO-1 mRNA表達(dá)水平(p<0.01,p<0.05)。見圖5。

圖5 梓葛凍干粉針對(duì)腦缺血/再灌注1、4、7、14 d大鼠 缺血側(cè)腦皮質(zhì)層ZO-1 mRNA表達(dá)的影響Fig.5 Effects of Zige lyophilized powder on ZO-1 mRNA levels of the cortex in focal cerebral ischemia-reperfusion

3 討論

MMP-9與腦缺血再灌注損傷的關(guān)系十分密切[15],且其在繼發(fā)性腦損傷和血管源性水腫中起重要作用。梓葛凍干粉針16.40、32.70、65.40 mg·kg-1均能抑制MMP-9 mRNA的表達(dá)升高,進(jìn)而減少M(fèi)MP-9的生成,提示藥物降低腦缺血模型大鼠腦微血管通透性的機(jī)制可能與降低在腦微血管中MMP-9mRNA的表達(dá)有關(guān)。

腦缺血和再灌注導(dǎo)致腦微循環(huán)和微血管的許多變化,其中微血管通透性的改變?cè)诓∽冞^程扮重要角色[16]。研究表明,在考察相對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)(1、4、7、14 d),與假手術(shù)組比較,模型組的大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)層微血管中Occludin、Claudin-5、ZO-1 mRNA的表達(dá)均顯著下降,破壞了腦微血管細(xì)胞間緊密連接,進(jìn)而破壞血腦屏障結(jié)構(gòu)的完整性和功能正常發(fā)揮,使血管通透性增加,加重再灌注后腦水腫,使腦缺血/再灌注的損傷程度加重,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[3,17]。梓葛凍干粉針16.40、32.70、65.40 mg·kg-1均能抑制Occludin、Claudin-5、ZO-1 mRNA的表達(dá)降低,且3個(gè)劑量組對(duì)于3種結(jié)構(gòu)蛋白具有正向調(diào)節(jié)作用,此結(jié)果說明梓葛凍干粉針對(duì)腦缺血起到保護(hù)作用可能與升高腦微血管中Occludin、Claudin-5、ZO-1 mRNA表達(dá)有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究表明梓葛凍干粉針可以抑制MMP-9基因表達(dá),并促進(jìn)Claudin-5、Occludin、ZO-1基因表達(dá),此基因水平結(jié)果與其蛋白結(jié)果變化基本一致,提示其可保護(hù)和改善腦微血管通透性,為梓葛凍干粉針的臨床應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Study on the effect of Zige lyophilized powderfor injection against the microvascular permeability after cerebralischemia-reperfusion injury of rats in the celebral microcirculation

SHANG Yuan-hong,TIAN Jin-feng

(Panzhihua University,Panzhihua 617000,China)

This paper investigated the protective effect of Zige lyophilized powder for injection against the microvascular permeability after cerebral ischemia-reperfusion injury of rats in the celebral microcirculation. 272 male sprague-dawley rats were randomly divided into sham group,model group,puerarin injection group,three groups of Zige lyophilized powder. It made a cerebral ischemia-reperfusion model using the line in the left middle cerebral artery occlusion(MCAO)of rats in ischemia for 2 h and reperfusion for 1,4,7 and 14 d,the model of rats was established by intravenous injection of drugs. The expression of MMP-9,ZO-1,Occludin and Claudin-5 mRNA of the brain microvessel in the lateral ischemic cerebral cortex was detected by fluorescence quantitative PCR. In reperfusion for 4,7 and 14 d,compared with model group,Zige lyophilized powder groups(16.40,32.70 and 65.40 mg·kg-1)could reduce mmp-9 mRNA level in microvessel of the lateral ischemic cerebral cortex(p<0.01),and could increase claudin-5,occludin,zo-1 mRNA level(p<0.05)in the corresponding time. These results suggested that Zige lyophilized powder for injection could improve and protect the microvascular permeability by reducing MMP-9 and increasing claudin-5,occludin,zo-1 mRNA level.

Zige lyophilized powder for injection;Claudin-5;Occludin;Zo-1;MMP-9;microvascular permeability

2016-12-08

尚遠(yuǎn)宏(1980-)，男，博士，講師，研究方向：中藥藥理和食品研究，E-mail：shyh611@126.com。

四川省教育廳重點(diǎn)基金項(xiàng)目(14ZA0345, 15ZA0370);攀枝花市社會(huì)發(fā)展科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016 CY-S-10);攀枝花學(xué)院博士科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(bkqj2015026, bkqj2015023)；四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(GR-2015-E-01，szjj2017-110)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)13-0307-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.057