付長雪,劉芳芳,都璐珩,李范洙,張 先

(延邊大學農(nóng)學院食品科學系,吉林延吉 133000)

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生物質熱解液和殼聚糖復合保鮮劑對辣椒炭疽病菌抑菌作用研究

付長雪,劉芳芳,都璐珩,李范洙*,張 先*

(延邊大學農(nóng)學院食品科學系,吉林延吉 133000)

為探究生物質熱解液在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應用及復合保鮮劑開發(fā),采用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀分析檢測了生物質熱解液的化學成分,以辣椒炭疽病菌為實驗菌種,用生長速率法進行了生物質熱解液和殼聚糖對辣椒炭疽病菌的抑菌實驗,通過共毒因子法確定了生物質熱解液和殼聚糖的相互作用。結果表明:生物質熱解液和殼聚糖對辣椒炭疽病菌的EC50值分別為50倍和0.7 g/L;生物質熱解液對辣椒炭疽病菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MFC)分別為32.5倍和29倍;兩者以不同比例混合使用時對辣椒炭疽病菌的抑制具有增效作用,且生物質熱解液和殼聚糖EC50溶液按1∶1比例混合時共毒因子最大。

生物質熱解液,殼聚糖,辣椒炭疽病菌,抑菌作用,復合保鮮劑

生物質資源是地球上存在的一種豐富的可再生能源。我國生物質資源來源主要分四大類:農(nóng)業(yè)資源、林業(yè)資源、禽類糞便和能源植物。研究發(fā)現(xiàn),生物質熱解技術是生物質資源利用的重要途徑[1-2]。

目前,對生物質資源利用的研究主要以木醋液為主,已有大量研究證明其具有促進植物生長和防治農(nóng)作物病蟲害及保鮮的作用[3-5],且安全無毒性[6-7]。研究表明,植物中抗菌、殺菌的有效成分主要有香精油,香精油一般為醋、酮、酸和萜烯的化合物,此外單寧、甾體類、黃酮類、有機酸和蛋白質等也具有抑菌作用[8]。生物質熱解液(bio-liquid),是生物質熱解技術獲得的生物油精制分離得到的水溶性提取物,其化學組成主要有有機酸、醇、酚、醛、酮類等[9],因此推測生物質熱解液也具有一定的抗菌殺菌作用。

殼聚糖是一種天然無毒的高聚物,是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物[10]。存在廣泛,且安全、無毒、可降解,具有良好的抗菌性和吸附性。與一般的抑菌劑相比有廣譜、抗菌活性高、殺菌率高等優(yōu)點[11]。

辣椒炭疽病,是危害辣椒的主要病害之一。在高溫高濕條件下,流行蔓延快,危害時間長,危害重,損失大[12]。傳統(tǒng)的預防措施主要為噴施殺菌劑,盡管達到了防治效果,但辣椒表面殘留的殺菌劑對人類健康存在致癌、致畸等慢性毒性。

因此,本實驗以生物質熱解液為原料,研究其對辣椒炭疽病菌的抑制作用并開發(fā)生物質熱解液和殼聚糖復合抑菌劑,研究復合保鮮劑對辣椒炭疽病菌抑菌效果,以期為生物質資源的綜合利用及綠色復合抑菌劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生物質熱解液 2012年廣州迪森集團提供,以木屑為原料，采用中溫快速熱解法制造的生物油,生物油與水按1∶1比例混合,常壓蒸餾,收集100～120 ℃時的餾出液；殼聚糖 脫乙酰度大于95%以上，山東省萊州市海力生物制品有限公司；辣椒炭疽病菌 吉林省蔬菜花卉研究院。

Shimadzu QP2010 GC/MS氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 日本島津公司;DHG-9143BS-Ⅲ型電熱恒溫鼓風干燥箱、SW-CJ-1FD型超凈工作臺 上海新苗醫(yī)療器械機械制造有限公司;DNP-9082BS-Ⅲ型電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津泰勒斯儀器有限公司;FA1004B型分析天平 上海昂尼儀器儀表有限公司;SX-700型高壓蒸汽滅菌鍋 日本TOMY公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物質熱解液化學成分GC-MS分析 采用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀分析Shimadzu QP2010 GC/MS。

色譜條件:色譜柱為DB-5 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱。程序升溫:柱溫50 ℃(保留2 min),以10 ℃/min升溫至280 ℃,保持30 min。汽化室溫度250 ℃,載氣為高純He(99.999%),流速1.0 mL/min;分流進樣,分流比20.0,溶劑延遲時間:1.0 min。

質譜條件:離子源為電子轟擊(EI)源;離子源溫度230 ℃,電子能量70 eV,接口溫度280 ℃。質量分析器為單四極桿,質量范圍20～500 amu,檢測電壓為0.90 kV。

1.2.2 抑菌率和EC50值測定 將不同濃度生物質熱解液和殼聚糖分別與高壓滅菌(121 ℃、20 min)后冷卻至50 ℃左右的PDA固體培養(yǎng)基混合均勻,分別配制成含不同濃度的生物質熱解液和殼聚糖的培養(yǎng)基。以不加熱解液和殼聚糖的培養(yǎng)基為空白對照(CK)并以含0.05%和0.1%醋酸的培養(yǎng)基為對照。

在已培養(yǎng)4～5 d的辣椒炭疽病菌平板上,用直徑為5 mm的打孔器在菌落的外緣生長旺盛處制備菌餅,用接種針挑取菌餅,菌絲面朝下輕放于帶藥培養(yǎng)基的中心并與培養(yǎng)基貼合[13]。每個培養(yǎng)皿中放置一個菌餅,每個稀釋濃度重復3次。

將接種后培養(yǎng)基放置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)至空白對照組菌落直徑大于培養(yǎng)皿直徑的2/3時,用游標卡尺測量辣椒炭疽病菌生長的菌落直徑(mm),并得出平均值。通過計算得出各處理濃度對辣椒炭疽病菌的抑菌率,分析比較熱解液和殼聚糖對辣椒炭疽病菌菌絲生長的影響。

以橫坐標為藥劑濃度的對數(shù)值,縱坐標為菌絲生長的抑菌率值,得出兩種藥劑對辣椒炭疽病菌的毒力回歸方程,并求得生物質熱解液與殼聚糖對辣椒炭疽病菌的EC50值[14]。

抑菌率(%)=[(空白對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對照組菌落直徑-菌餅直徑)]×100

1.2.3 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MFC)測定 采用直接配制法制備不同稀釋倍數(shù)的含生物質熱解液的PDA液體培養(yǎng)基。采用連續(xù)稀釋法制備不同稀釋濃度的含殼聚糖的PDA液體培養(yǎng)基。將PDA液體培養(yǎng)基倒入試管中,每個試管15 mL,每個濃度3次重復,以不加生物質熱解液和殼聚糖的試管為對照組。將制備好的辣椒炭疽病菌菌餅接種在試管中,在28 ℃恒溫培養(yǎng)后觀察結果,每隔12 h觀察一次菌絲的生長情況,連續(xù)觀察一周,以試管內(nèi)完全無菌絲生長的最小濃度為藥劑對辣椒炭疽病菌的最小抑菌濃度[15]。

在MIC實驗基礎上,將無菌絲生長的試管中的菌餅接種到PDA培養(yǎng)基中在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一周后判斷菌絲生長情況,以此時無菌絲生長的最小濃度為藥劑對辣椒炭疽病菌的最小殺菌濃度。

1.2.4 復配實驗設計 假設經(jīng)測定生物質熱解液、殼聚糖單劑A、B的EC50值分別為a和b,用共毒因子法評價生物質熱解液A和殼聚糖B混合液的增效作用。選擇5個配比,具體配制方法即先配制A、B的EC50溶液,再按體積比1∶5、1∶2、1∶1、2∶1、5∶1混合即得不同配比的混和液[16]。

共毒因子=[(混合液實際抑制率-混合液理論抑制率)/混合液理論抑制率]×100

當共毒因子>20,表示有增效作用;≤-20表示有拮抗作用;-20～20表示有相加作用[17]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 11.5和Excel軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 生物質熱解液化學成分分析

對生物質熱解液化學成分進行GC-MS分析,經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索,并核對質譜標準圖譜,各組分的含量按峰面積百分比計算得出,結果見表1。從生物質熱解液中共分析鑒定出23種組分,酸類物質相對含量最高,占所有檢出物的58.89%,其中醋酸的相對含量為40.34%;其次是胺類物質,占所有檢出物的17.84%;酮類物質的相對含量為12.83%,此外還有少量的醇類、酯類、酚類、醛類物質。酸類、胺類、酮類物質的總含量為89.56%,是生物質熱解液的主要組成成分。

相較于翟梅枝[18]等人的研究,除醛類物質外,生物質熱解液的化學成分與3種不同木醋液的化學成分相似,且與生物油[19]的化學組成種類基本一致,但各物質相對含量有差異。

表1 生物質熱解液化學成分分析表Table 1 Chemical composition of bio-liquid

2.2 生物質熱解液對辣椒炭疽病菌的抑菌作用

結果表明,生物質熱解液對辣椒炭疽病菌有較好的抑菌效果。如表2所示,隨著生物質熱解液稀釋倍數(shù)的增加,抑菌效果逐漸減小,在稀釋倍數(shù)為30倍時,生物質熱解液對辣椒炭疽病菌的抑菌率達到100%;當生物質熱解液稀釋倍數(shù)大于60倍時,抑菌率低于50%。相較于魏琦[20]等人的竹醋液對辣椒炭根據(jù)生物質熱解液稀釋倍數(shù)與其對辣椒炭疽病菌的抑菌率,求得生物質熱解液對辣椒炭疽病菌的毒力回歸方程為y=10.848x2-45.259x+50.85,R2=0.98391,通過回歸方程得出生物質熱解液的EC50值為50倍即20 mL/L,僅為苦參和板藍根提取物[21]的一半,與金銀花提取物EC50值相接近,說明生物質熱解液具有良好的抑菌效果。

表2 生物質熱解液對辣椒炭疽病菌抑菌作用Table 2 The antifungal activities of bio-liquid against Colletotrichum nigrum

注:同一列中不同小寫字母代表差異顯著(p<0.05),表4、表6同。疽病菌抑菌效果的研究,相同濃度下,生物質熱解液對辣椒炭疽病菌的抑菌效果略低于竹醋液。熱解液50倍稀釋液的抑菌率相當于0.05%醋酸對照組的抑菌率,40倍稀釋液的抑菌率顯著大于0.1%醋酸對辣椒炭疽菌的抑菌率。

生物質熱解液對辣椒炭疽病菌的最小抑菌濃度見表3及圖2。生物質熱解液稀釋36倍及以上時,試管內(nèi)均有菌絲生長,在稀釋32.5倍及以下的試管中,無菌絲生長,以試管內(nèi)無菌絲生長的最小濃度為MIC,由此確定稀釋32.5倍為生物質熱解液對辣椒炭疽病菌的最小抑菌濃度。最小抑菌濃度實驗后從無菌絲生長的試管中將菌餅取出接種在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng),進一步確定生物質熱解液對辣椒炭疽病菌的MFC為稀釋29倍。

圖1 生物質熱解液對辣椒炭疽病菌抑菌作用Fig.1 The antifungal activities of bio-liquid against Colletotrichum nigrum

表3 生物質熱解液對辣椒炭疽病菌的MIC和MFC測定Table 3 MIC and MFC of bio-liquid against Colletotrichum nigrumon

圖2 生物質熱解液對辣椒炭疽病菌的MIC和MFC測定Fig.2 Effects of Bio-liquid against Colletotrichum nigrumon MIC and MFC

圖3 殼聚糖對辣椒炭疽病菌抑菌作用Fig.3 The antifungal activities of chitosan against Colletotrichum nigrum注：圖中左下角的數(shù)字為殼聚糖濃度，單位g/L。

注:試管內(nèi)有菌絲生長用“+”表示,無菌絲生長用“-”表示,表5同。2.3 殼聚糖對辣椒炭疽病菌的抑菌作用

殼聚糖對辣椒炭疽病菌的抑菌作用如表4及圖3所示,隨著殼聚糖濃度的升高,菌落直徑逐漸減小，抑菌率逐漸增加。當殼聚糖濃度大于0.7 g/L時,對辣椒炭疽病菌抑菌率均大于50%,表明殼聚糖對辣椒炭疽病菌也有較好的抑制作用。已有大量研究證明[22-24]殼聚糖作為一種廣譜抑菌劑,可以有效抑制多種細菌、真菌的生長和繁殖,一方面,殼聚糖可以和病菌表面產(chǎn)生的酸性物質如磷壁質酸、莢膜多糖等相互作用[25]形成復雜的高分子電解質,改變細胞膜的通透性,使膜功能發(fā)生紊亂,細胞內(nèi)物質電解質、蛋白質和內(nèi)酶外滲,從而產(chǎn)生抑菌效果;另一方面,大分子的殼聚糖會吸附在微生物細胞表面,形成一層高分子膜,阻止了營養(yǎng)物質向細胞內(nèi)運輸[26]從而起到殺菌和抑菌作用。

表4 殼聚糖對辣椒炭疽病菌抑菌作用Table 4 The antifungal activities of chitosan against Colletotrichum nigrum

根據(jù)殼聚糖濃度對數(shù)值與抑菌率的幾率值求得殼聚糖對辣椒炭疽病菌的毒力回歸方程為y=0.55677x2+1.2848x+0.75555,R2=0.98026,得出殼聚糖對辣椒炭疽病菌的EC50值為0.7 g/L。

從表5及圖4可以看出,殼聚糖濃度為0.625 g/L以下時,試管中有菌絲生長,殼聚糖濃度1.25 g/L開始,無菌絲生長,以無菌絲生長的最低濃度作為殼聚糖對辣椒炭疽病菌的最小抑菌濃度,即殼聚糖對辣椒炭疽病菌的MIC為1.25 g/L。不同濃度的殼聚糖所對應的平板中均有菌絲生長,說明殼聚糖對辣椒炭疽病菌僅有抑制作用,無殺菌作用。

表5 殼聚糖對辣椒炭疽病菌的MIC測定Table 5 Effects of chitosan against Colletotrichum nigrum on MIC

表6 生物質熱解液與殼聚糖不同比例混合液對辣椒炭疽病菌的抑制作用Table 6 The acaricidal activities of mixtures containing different proportions of bio-liquid and chitosan against Colletotrichum nigrum

圖4 殼聚糖對辣椒炭疽病菌的MIC測定Fig.4 MIC of chitosan against Colletotrichum nigrum

2.4 生物質熱解液和殼聚糖復合保鮮劑對辣椒炭疽病菌的抑菌作用

生物質熱解液EC50值溶液與殼聚糖EC50值溶液按照不同比例混合后,通過毒力回歸方程求得生物質熱解液與殼聚糖對辣椒炭疽病菌的抑菌率,相加即為復合保鮮劑對辣椒炭疽病菌的理論抑菌率。生物質熱解液EC50值溶液與殼聚糖EC50值溶液不同混合比例的實際抑菌率、理論抑菌率及相互作用如表6所示。當生物質熱解液和殼聚糖復配比例為1∶2、1∶1、2∶1、5∶1時,實際抑菌率均為理論抑菌率的2倍左右,且對應的共毒因子均大于20,表明生物質熱解液與殼聚糖配合使用有增效作用。復配比例為1∶5時,共毒因子小于20,表明生物質熱解液和殼聚糖僅有相加作用無增效作用。復配比例為1∶1時共毒因子最大,為82.74,即稀釋50倍生物質熱解液與0.7 g/L殼聚糖按1∶1比例混合作為本實驗較好的復配比例。但就抑菌率來看,混合比例為5∶1時對辣椒炭疽病菌的實際抑菌率最大,且顯著高于其他混合比例。因此,實際如何應用,還需進一步考慮和驗證經(jīng)濟成本以及不同比例混合液對辣椒保鮮效果等問題。此外生物質熱解液以及與殼聚糖的復合劑對辣椒炭疽病菌的抑菌機理還有待進一步研究。

圖5 生物質熱解液與殼聚糖不同比例混合液 對辣椒炭疽病菌的抑制作用Fig.5 The acaricidal activities of mixtures containing different proportions of bio-liquid and chitosan against Colletotrichum nigrum

3 結論

對生物質熱解液化學成分進行GC-MS分析,結果表明:酸類、胺類、酮類物質的相對含量占89.56%,是生物質熱解液的主要組成成分。以辣椒炭疽病菌為供試植物病原菌,采用生長速率法評價了生物質熱解液與殼聚糖的抑菌活性。生物質熱解液對辣椒炭疽病菌的EC50值為50倍,最小抑菌濃度為32.5倍，最小殺菌濃度為29倍;殼聚糖對辣椒炭疽病菌的EC50值為0.7 g/L,最小抑菌濃度為1.25 g/L,殼聚糖對辣椒炭疽病菌無殺菌效果。生物質熱解液和殼聚糖復合使用對辣椒炭疽病菌的抑菌效果表明:兩者之間有增效作用,50倍生物質熱解液與0.7 g/L殼聚糖溶液1∶1比例的混合液增效作用最大。

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Study on the antibacterial effect of bio-liquidand chitosan compound preservative onColletotrichumnigrum

FU Chang-xue,LIU Fang-fang,DU Lu-heng,LI Fan-zhu*,ZHANG Xian*

(College of Agriculture,Yanbian University,Yanji 133000,China)

In order to explore the application of bio-liquid in agricultural production and preservative development,Gas chromatograph mass spectrometer was used to analyze the chemical composition of bio- liquid,Colletotrichumnigrumwas used as experimental strain,antibacterial experiment of bio-liquid and chitosan onColletotrichumnigrumwere experimented by growth rate method,and the interation between bio-liquid and chitosan was determined by the co-toxity factor method.The results showed that EC50of bio-liquid and chitosan onColletotrichumnigrumwere 50 times and 0.7 g/L. The minimum inhibitory concentration of biomass pyrolysis liquid on Pepper Anthracnose(MIC)and minimum bactericidal concentration(MFC)were 32.5 times and 29 times. Bio-liquid and chitosan mixed in different proprotions has synergistic effect,bio-liquid and chitosan EC50solution mixed by 1∶1 ratio has the largest co-toxicity factor.

biomass-liquid;chitosan;Colletotrichumnigrum;antimicrobial effect;compound preservative

2016-11-18

付長雪(1994-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工，E-mail：1633078222@qq.com。

*通訊作者:李范洙(1965-)，男，博士，副教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工，E-mail：fzli@ybu.edu.cn。 張先(1963-)，女，博士，副教授,研究方向：農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工，E-mail：zhangdory@aliyun.com。

吉林省重點科技發(fā)展計劃項目(20130204045NY)。

TS255.1

A

1002-0306(2017)13-0286-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.053