徐 慶,陳列歡,秦 臻,陳啟明,邱勇雋,趙黎明,*

(1.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,食品科學(xué)與工程系,上海 200237;2.惠州長龍生物技術(shù)有限公司,廣東惠州 516000)

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殼二糖、殼三糖單體制備及其結(jié)構(gòu)分析

徐 慶1,陳列歡2,秦 臻1,陳啟明1,邱勇雋1,趙黎明1,*

(1.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,食品科學(xué)與工程系,上海 200237;2.惠州長龍生物技術(shù)有限公司,廣東惠州 516000)

殼寡糖因自身結(jié)構(gòu)特征而存在多種生物活性,目前對殼寡糖的活性研究大部分是不同聚合度的混合物。為獲得單一聚合度殼二糖、殼三糖,采用了專一性殼聚糖酶對殼聚糖進(jìn)行降解,運(yùn)用薄層色譜法(TLC)判斷酶解反應(yīng)終點(diǎn),并采用高效液相色譜法(HPLC)法進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明酶解組分主要為殼二糖、殼三糖,含量分別為65.63%,32.48%。將酶解后的混合組分采用實(shí)驗(yàn)室自制的陽離子交換樹脂QY-H003對酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離,以鹽酸濃度為C1=1.25 mol/L、C2=1.55 mol/L為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫得到兩個組分。采用TLC、HPLC、紅外光譜(FT-IR)及核磁共振氫譜(1HNMR)檢測手段對組分進(jìn)行分析。分離純化獲得的殼二糖、殼三糖組分經(jīng)HPLC法檢測,純度分別98.06%,96.00%。殼二糖回收率達(dá)92.46%、殼三糖回收率達(dá)95.53%。該制備工藝放大后可實(shí)現(xiàn)高純度殼二糖、殼三糖單體規(guī)?；苽?為殼二糖、殼三糖的生理活性研究及應(yīng)用提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

殼聚糖,酶解,離子交換色譜法,殼二糖,殼三糖

殼寡糖(Chitooligosaccharide,COS),又稱幾丁寡糖,其分子結(jié)構(gòu)是由D-氨基葡萄糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖通過β-1,4-糖苷鍵連接而成,聚合度在2～10內(nèi)的低分子殼聚糖[1]由殼聚糖經(jīng)過酸或酶等方法降解而成。殼寡糖因分子量小、水溶性好、無毒、帶正電、生物兼容性好[2]等優(yōu)勢而廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等方面[3]。現(xiàn)大量研究表明殼寡糖具有降血糖[4]、降血脂[5]、降膽固醇[6]、抗癌[7]、抗腫瘤[8-9]、抗菌抑菌[10]及能提高機(jī)理免疫能力[11]等活性。

殼二糖、殼三糖具有良好的抗菌、抗氧化作用[12-14]。Frantz等[15]采用金屬親和色譜,可制備純度高于95%以上的殼二糖、殼三糖,但上樣量低。琚洋洋[16]采用凝膠色譜法制備出殼二糖、殼三糖單體純度分別為95.7%,97.1%,但340 mL的分離填料,上樣量仍處于毫克級。高麗霞等[17]采用Bio-Gel P6和Bio-Gel P6 Fine凝膠柱進(jìn)行,純化后可制備純度高于95%的殼三糖,但這一過程中需要二次純化,制備周期較長。與金屬親和色譜和凝膠色譜相比,離子交換色譜分離精度高、上樣量大。Li等[18]以CM Sephadex C-25為填料分離全脫乙?；臍す烟?得到的殼二糖、殼三糖純度可達(dá)99.3%、98.9%,但產(chǎn)量每天分別只有75、60 mg,同時該法以NaCl溶液為洗脫劑,在制備過程中引入了鹽,增大分離難度,且產(chǎn)率有限。Xiong等[19]采用離子交換色譜法,以Dowex50WX8-20為分離介質(zhì),可分離制備殼二糖、殼三糖,兩者純度均超過98%,但該填料價格昂貴,不適合大規(guī)模應(yīng)用。

以上報道的殼二糖、殼三糖的制備規(guī)模大多停留在毫克級,且使用的填料不易獲得,難以規(guī)?；苽?無法滿足大量基礎(chǔ)研究和應(yīng)用開發(fā)需求。為了更大規(guī)模的制備殼二糖、殼三糖單體,本研究以殼聚糖為原料,采用專一性殼聚糖對其進(jìn)行降解,篩選了一種吸附容量較高的介質(zhì),并建立了一種殼二糖、殼三糖單體的制備工藝,制備規(guī)模達(dá)克級,對制備的殼二糖、殼三糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征分析,可為殼二糖、殼三糖規(guī)模化制備及研究應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖 萊州海力生物制品有限公司,脫乙酰度>95%;專一性殼聚糖酶 實(shí)驗(yàn)室篩選,酶活440.2 U/mg;強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂QY-H003 實(shí)驗(yàn)室自制;高效硅膠板 1.05554.0001、乙腈(HPLC級) 德國Merck公司;殼寡糖DP 1～7混合標(biāo)準(zhǔn)品 惠州長龍生物技術(shù)有限公司,純度>95%。

Agilent 1260 Infinity高效液相色譜分析系統(tǒng):配有ELSD安捷倫G246B檢測器 美國安捷倫公司;色譜柱:Asahipak NH2P-504E柱(4.6 mm ID×250 mm L) 日本Shodex公司;中壓冷水夾套層析柱(16 mm ID×50 cm H) 上海華美實(shí)驗(yàn)儀器廠;BT100定時恒流泵、90-1型恒溫磁力攪拌器 上海滬西實(shí)驗(yàn)儀器廠;752N紫外可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮實(shí)驗(yàn)儀器廠;LGJ-18C型冷凍干燥機(jī)器 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 殼寡糖制備 準(zhǔn)確稱取10.00 g的殼聚糖,加入200 mL水均勻攪拌,30 min后,加入4.8 mL濃鹽酸。加速攪拌，配成5%(w/v)的殼聚糖溶液,用0.2 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)制溶液為酶的最適pH為5.6。向體系中加入10.0 mg殼聚糖酶,在酶最適溫度37 ℃條件下,轉(zhuǎn)速為120 r/min進(jìn)行水解反應(yīng),每隔8 h取樣,100 ℃,10 min滅酶,以8000 r/min離心10 min,采用TLC法分析酶解液組分并判斷反應(yīng)終點(diǎn),達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)后將酶解液置于100 ℃加熱10 min終止反應(yīng),以8000 r/min離心10 min,去除沉淀。將上清液進(jìn)行濃縮、冷凍干燥制成殼寡糖固體。

1.2.1.1 酶解反應(yīng)時間的確定 采用TLC法[20]分析取的樣品離心后的上清液,具體方法如下:在高效硅膠板上進(jìn)行點(diǎn)樣,上樣量1.5 μL,各點(diǎn)間距為5 mm,距離層析板底端10 mm,上行法展開。展距為80 mm,采用的展開體系為正丙醇∶氨水∶水=60∶4∶30,以大茴香醛為顯色劑,采用浸漬法，電烤爐均勻火烤至顯色。顯色劑配法:移取25 mL大茴香醛溶于450 mL無水乙醇中,后向體系中緩慢加入25 mL濃硫酸,再向其加入5 mL乙酸,混勻。

1.2.1.2 酶解終產(chǎn)物的HPLC分析 采用安捷倫1260系列高效液相色譜分析儀對酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析。色譜條件:色譜柱Shodex NH2P-504E(4.6 mm ID×250 mm L)。柱溫30 ℃;流速V=1.0 mL/min;進(jìn)樣濃度5.0 mg/mL;進(jìn)樣量10 μL。檢測器:安捷倫G246B型蒸發(fā)光散射。以乙腈(B)和水(A)為流動相采用梯度洗脫,條件如表1:

表1 HPLC法分析殼寡糖洗脫條件Table 1 The elution conditions of HPLC method analysis chitooligosaccharide

1.2.1.3 含量的計(jì)算

式(1)

其中,Wi表示組分i的含量,%;Ai表示HPLC圖譜中組分i的峰面積;A表示HPLC分析圖譜中所有峰的峰面積總和。

1.2.2 殼寡糖單體的分離

1.2.2.1 樹脂的篩選 量取預(yù)處理好的各種樹脂5 mL置于250 mL錐形瓶中,向錐形瓶中加入50 mL濃度為10 g/L自制的殼寡糖溶液,以150 r/min的轉(zhuǎn)速處理12 h,采用減重法測定溶液中殼寡糖含量,采用產(chǎn)量法如式2計(jì)算各樹脂靜態(tài)吸附量Q:

式(2)

式中,Q為樹脂體積吸附量,g/mL;C0為初始?xì)す烟侨芤簼舛?g/L;C為吸附后最終溶液中殼寡糖濃度,g/L;V為溶液體積,mL;V0為加入的樹脂體積,mL。

1.2.2.2 殼二糖、殼三糖的分離過程 采用吸附容量最高的強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂QY-H003進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn),取預(yù)處理好的QY-H003樹脂70.4mL裝入層析柱中,并用去離子水洗至澄清,平衡后上樣,柱子溫度T=25 ℃,按照上樣量與樹脂體積比為60.0mg/mL上樣4.22g。上樣后先用去離子水進(jìn)行洗脫,待洗脫至中性后開始以濃度為C1=1.25mol/L,C2=1.55mol/L兩種不同濃度的鹽酸為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫并同時進(jìn)行收集,流速為2.0mL/min時開始收集,前期每9min40s收集一管,共20管。后期每19min20s收集一管,共10管。采用滴定法測定各管酸濃度,繪制酸濃度隨時間變化曲線。利用減重法測定各管糖濃度,繪制糖濃度洗脫曲線。采用TLC法對收集管成分進(jìn)行定性分析,合并相同組分,多次旋蒸脫酸后,冷凍干燥成粉末。

回收率的計(jì)算:將合并后制得的單體質(zhì)量與該組分上樣量之比即為回收率。計(jì)算如式(3)所示:

式(3)

式中,Yi表示成分i的回收率(%);mi表示成分i回收的質(zhì)量(g);mc表示組分i的上樣量(g)。

1.2.3 殼二糖、殼三糖單體的表征

1.2.3.1 TLC法分析 取殼二糖、殼三糖單體均配成1%濃度的水溶液采用TLC法分析,具體方法詳見1.2.1.1。

1.2.3.2 HPLC法分析 將制備的殼二糖、殼三糖單體配成5.0 mg/mL濃度的水溶液用于HPLC分析,具體方法參考1.2.1.2。

1.2.3.3 FT-IR法分析 采用KBr壓片法,使用Nicolet 6700型傅立葉變換紅外波譜儀對酶解產(chǎn)物及制備的單體在紅外波數(shù)為4000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,掃描32次,分辨率4 cm-1。

1.2.3.41HNMR法分析 殼寡糖單體的核磁氫譜采用瑞士BrukerAVANCEIII400 MHz超導(dǎo)核磁共振儀分析,氘代水溶解殼二糖、殼三糖。

2 結(jié)果與討論

2.1 殼寡糖的制備

2.1.1 酶解反應(yīng)時間的確定 該專一性殼聚糖酶是屬于內(nèi)切型酶,在特定條件下可將殼聚糖降解成殼二糖、殼三糖。反應(yīng)時間會影響最終的酶解液的組分的組成,酶解過程中每8 h的酶解液組分分析結(jié)果如圖1所示,TLC圖譜結(jié)顯示,前四次(32 h前)取樣,酶解產(chǎn)物主要為殼二糖、殼三糖、殼四糖。反應(yīng)32 h之后,殼四糖的占比逐漸減少,反應(yīng)至120 h時酶解產(chǎn)物主要是殼二糖、殼三糖,其他含量極少。實(shí)驗(yàn)表明,酶解反應(yīng)120 h,殼聚糖可被殼聚糖酶降解成主要含殼二糖、殼三糖混合組分,因此，酶解時間選擇120 h。

圖1 酶解過程中產(chǎn)物的TLC圖譜Fig.1 Thin layer chromatography analysis of hydrolysis products注:S指殼寡糖1～7混合標(biāo)準(zhǔn)品,1～15分別指第1～15次取樣。

2.1.2 酶解終產(chǎn)物HPLC分析 制備的酶解組分采用HPLC分析的結(jié)果圖譜如圖2A、圖2B所示,其中圖2A為聚合度1～7標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜,1～7糖的出峰時間分別為7.30、9.35、12.71、17.74、22.75、25.78、27.87 min,圖2B顯示的是酶解產(chǎn)物殼寡糖的HPLC圖譜,其兩主峰出峰時間及峰面積具體數(shù)據(jù)如表2所示,可知出峰時間分別為9.43、12.73 min,與標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的是殼二糖、殼三糖。采用峰面積歸一法,結(jié)合式(1)可知酶解產(chǎn)物中殼二糖、殼三糖的含量各占比例分別65.63%,32.48%。

圖2 殼寡糖的HPLC圖譜Fig.2 HPLC spectrum of chitooligosaccharides注:A:1～7糖混合標(biāo)準(zhǔn)品,B:殼聚糖酶解產(chǎn)物。 表2 兩組分的HPLC數(shù)據(jù)Table 2 The HPLC data of two components

組分主峰保留時間(min)主峰峰面積(Ai)總面積(A)峰面積占比(%)DP294393067614180666563DP3127346058714180663248

2.2 殼寡糖單體的分離

2.2.1 樹脂的篩選 測定離子交換樹脂 D113、HD-8、D001、D315、D152、QY-H003,12 h后,結(jié)果如圖3所示。6種樹脂對應(yīng)的吸附容量分別為19.9、2.8、83.3、0.9、25.3、91.7 mg/mL,其中型號為QY-H003樹脂對殼寡糖的吸附容量最高,選取該型號樹脂用于分離實(shí)驗(yàn)。

圖3 6種樹脂對殼寡糖的吸附容量Fig.3 Static adsorption quantity of six kinds of resin

圖4 收集各管的酸濃度、糖濃度及TLC分析Fig.4 Each tube acid concentration and chitooligosaccharide concentration of collection注:S指殼寡糖1～7混合標(biāo)準(zhǔn)品,1、2、3…30指收集的管號。

2.2.2 殼二糖、殼三糖的分離過程 收集管組分的分析：采用滴定法測定各管中的酸濃度,其測定結(jié)果如圖4A所示。前6管酸濃度急劇上升,其原因是由于層析柱開始是殘留水,第7管～30管酸濃度平穩(wěn)上升,可以體現(xiàn)梯度洗脫過程的穩(wěn)定性。

采用減重法測定各管的糖含量并繪制洗脫曲線。其測定結(jié)果如圖4B所示?？梢钥闯鲇腥齻€洗脫峰,出峰時間分別為48 min 20 s、87 min、183 min 40 s。表明有三種物質(zhì)被洗脫下來。且中間物質(zhì)的含量面積最大,對應(yīng)含量最高。

對收集的各管采用TLC法分析結(jié)果如圖4C,在6號管開始,殼二糖被解吸附,13號管結(jié)束。13號管開始,殼三糖開始被解吸附,至28號管結(jié)束。為得到更高純度,合并7～12號收集管,14～28號收集管。并旋蒸脫酸、冷凍干燥獲得兩個組分,獲得的殼二糖的質(zhì)量為2.56 g,殼三糖的質(zhì)量為1.31 g,根據(jù)回收率式(3)可知:

2.2.3 殼二糖、殼三糖單體的表征

2.2.3.1 TLC法分析 制備的殼二糖、殼三糖采用TLC法分析,結(jié)果如圖5所示,制備的殼二糖比移值Rf1=0.424,與標(biāo)準(zhǔn)品中殼二糖的比移值Rfm=0.417一致,制備的殼三糖的比移值Rf2=0.320與標(biāo)準(zhǔn)對照品殼三糖的比移值Rfn=0.317一致。說明制備的殼二糖、殼三糖與標(biāo)準(zhǔn)品一致。

圖5 單體TLC分析圖譜Fig.5 Thin layer chromatography analysis of glucosamine oligomers注:S指標(biāo)準(zhǔn)品,2、3分別指制備的殼二糖、殼三糖。

2.2.3.2 HPLC法分析 采用HPLC法分析制備的殼二糖、殼三糖單體,結(jié)果分別如圖6A、圖6B所示,兩單體的保留時間及峰面積如表3所示。殼二糖保留時間是9.17 min,殼三糖保留時間是12.27 min,與標(biāo)準(zhǔn)品圖2A殼二糖、殼三糖出峰時間一致。兩者的純度計(jì)算方法與含量計(jì)算方法一致,根據(jù)式(1),可得殼二糖含量為98.06%、96.00%。

圖6 單糖HPLC圖譜分析Fig.6 HPLC spectrum of chitooligosaccharide monomers注:(A)殼二糖,(B)殼三糖,圖8同。 表3 制備的殼二糖、殼三糖HPLC數(shù)據(jù)Table 3 The HPLC data of chitobiose and chitotriose

組分主峰保留時間(min)主峰峰面積(Ai)總面積(A)峰面積占比(%)殼二糖917195880219974639806殼三糖1227132840513836619600

2.2.3.3 FT-IR法分析 采用FT-IR法分析制備的殼二糖、殼三糖,在波長為4000～400 cm-1進(jìn)行掃描。結(jié)果如圖7顯示,兩者紅外掃描圖譜極為相似,有相同的特征峰。與Pan等[21]研究對比可知,3426.3 cm-1左右是糖環(huán)中O-H及N-H的伸縮振動吸收峰,在2937.7 cm-1左右是糖環(huán)中C-H的伸縮振動吸收峰。1627.1 cm-1左右是酰胺I譜帶。1523.1 cm-1左右是酰胺II譜帶,1400.5 cm-1左右環(huán)羥基C-H變形振動,1090.9 cm-1左右的峰是C-O伸縮振動峰。892.9 cm-1左右是β-構(gòu)型糖苷鍵,630.4 cm-1位置是指O-H面外彎曲的振動峰。

圖7 殼二糖和殼三糖紅外光圖譜Fig.7 The IR spectra of chitobiose and chitotriose

2.2.3.41HNMR法分析 采用氫譜核磁法分析制備的殼二糖、殼三糖,參考Sugiyama等[22]對殼寡糖的氫譜的分析,對殼二、三糖單體中結(jié)構(gòu)單元不同位置的氫原子化學(xué)位移分析如8A、圖8B所示,兩者結(jié)構(gòu)極為類似,在各自的結(jié)構(gòu)單元中相同位置的氫原子化學(xué)位移基本一致,說明兩者有共同的結(jié)構(gòu)單元。與Trombotto等[23]對全脫乙酰化殼寡糖的氫譜分析結(jié)果對比,區(qū)別在于:殼二糖、殼三糖圖譜在δ=1.9 ppm附近都出現(xiàn)了一個雙重峰,原因是制備的殼寡糖單體中極少數(shù)存在N-乙酰基,該處化學(xué)位移代表的是N-乙?；霞谆|(zhì)子的化學(xué)位移;殼三糖圖譜在δ=5.2 ppm附近出現(xiàn)的一個較寬的吸收峰是由N-乙酰氨基葡萄糖還原末端α異頭碳上的H質(zhì)子引起的。

圖8 單體的1HNMR譜圖Fig.8 The 1HNMR spectrum of monomers

3 結(jié)論

本文采用了專一性殼聚糖酶降解殼聚糖,在殼聚糖濃度為5%,酶添加量為10 mg,反應(yīng)溫度為37 ℃,轉(zhuǎn)速120 r/min的條件下,反應(yīng)120 h可制備出含殼二糖65.63%,殼三糖32.48%的混合物。利用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂QY-H003以濃度分別為C1=1.25 mol/L、C2=1.55 mol/L的鹽酸為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫,以柱溫T=25 ℃,流速V=2.0 mL/min,上樣量為4.22 g的洗脫條件對殼二、三糖混合物進(jìn)行分離,可獲得2個組分,經(jīng)TLC法、HPLC法、FT-IR法及1HNMR法檢測確定了兩組分分別為殼二糖、殼三糖。通過HPLC法對兩組分進(jìn)行含量分析,結(jié)果表明,殼二糖含量98.06%,殼三糖含量96.00%,采用減重法計(jì)算可知?dú)ざ腔厥章蔬_(dá)92.46%、殼三糖回收率達(dá)95.53%。該制備工藝簡單,上樣量大，制備單體純度高，產(chǎn)品回收率高。有望實(shí)現(xiàn)殼二糖、殼三糖單體規(guī)?；a(chǎn),能為殼二糖、殼三糖的基礎(chǔ)研究應(yīng)用提供物質(zhì)保障。

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Monomer preparation and structure analysis of chitobiose and chitotriose

XU Qing1,CHEN Lie-huan2,QIN Zhen1,CHEN Qi-ming1,QIU Yong-jun1,ZHAO Li-ming1,*

(1.State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,East China University of Scienceand Technology,Department of Food Science and Engineering,Shanghai 200237,China;2.Huizhou Long Dragon Biotechnology Co.,Ltd,Huizhou 516000,China)

Chitooligosaccharides has a variety of bioactivities due to its special structure features. Currently,almost all of chitooligosaccharides used in activity research were mixtures of polymers with different degrees of polymerization(DP). In this study,the specific chitosan enzyme was used to degrade chitosan to prepare chitobiose and chitotriose. The TLC analysis was then used to determine the end point of enzymatic hydrolysis reaction,and the component of hydrolysis products were analyzed by HPLC. The results showed that the enzymatic hydrolysates consisted of chitobiose(65.63%)and chitotriose(32.48%).Then,chitobiose and chitotriose were separated by a home-made cation ion exchange resin(QY-H003)with hydrochloric acid solutions at different concentrations(C1=1.25 mol/L,C2=1.55 mol/L). Further analysis was developed by TLC,HPLC,FT-IR and1HNMR.The purity of separated chitobiose and chitotriose were 98.06% and 96.00%,respectively. The recovery rate was 92.46% and 95.53%,respectively. It indicates that the preparation process was suited for scale production of chitobiose and chitotriose with high purity,and it benefits for the future bioactivity studies and applications of chitooligosaccharides.

chitosan;enzymatic hydrolysis;ion exchange chromatography;chitobiose;chitotriose

2017-03-08

徐慶(1989-)，碩士研究生，研究方向：分離提取技術(shù)，E-mail:kappa1006@yahoo.com。

*通訊作者:趙黎明(1977-)，博士，教授，研究方向：食品加工技術(shù)、分離提取技術(shù)，E-mail:zhaoliming@ecust.edu.cn。

國家自然基金項(xiàng)目(31371725);上海市曙光計(jì)劃(15SG28)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)13-0013-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.003