趙 英，劉曉慧，劉小翠，盧永昌?

（1.青海民族大學(xué)藥學(xué)院，青海西寧810007；2.青海省青藏高原植物資源化學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧810007；3.青海民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，青海西寧810007）

羊肚菌等9種食用菌抗氧化活性研究

趙 英1，2，劉曉慧3，劉小翠1，2，盧永昌1,2?

（1.青海民族大學(xué)藥學(xué)院，青海西寧810007；2.青海省青藏高原植物資源化學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧810007；3.青海民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，青海西寧810007）

通過(guò)對(duì)DPPH自由基清除能力、還原能力和清除羥基自由基能力的研究，比較羊肚菌、圓孢蘑菇、杏鮑菇、香菇、圓菇、白玉菇、平菇、金針菇和姬菇的甲醇提取物的抗氧化能力。結(jié)果顯示：9種食用菌甲醇提取物具有不同程度的抗氧化活性，其中圓孢蘑菇甲醇提取物對(duì)DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，其EC50值為346.50 μg/mL，羊肚菌甲醇提取物的鐵氰化鉀還原力最強(qiáng)，平菇甲醇提取物的羥基自由基清除能力最強(qiáng)，其EC50為 863.74 μg/mL。

羊肚菌；圓孢蘑菇；平菇；抗氧化活性

近代醫(yī)學(xué)指出，體內(nèi)自由基反應(yīng)與一些疾病的發(fā)生、發(fā)展和老化進(jìn)程密切相關(guān)。活性氧能對(duì)許多生物大分子，比如對(duì)DNA、蛋白質(zhì)產(chǎn)生破壞，造成其相關(guān)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞功能的損傷[1]。到目前為止，醫(yī)學(xué)界已發(fā)現(xiàn)近百種疾病都與自由基有關(guān)，尤其是退化性疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤、白內(nèi)障、衰老、關(guān)節(jié)炎和肝病等[2]。而抗氧化劑能捕獲并中和自由基，從而去除自由基對(duì)人體的損害。為此，人們?cè)絹?lái)越注重發(fā)現(xiàn)和研究天然抗氧化劑。食用菌不僅具有人體需要的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還含有很多活性成分，這些活性成分在抗氧化、抗癌、抗腫瘤、降血脂血糖等方面具有良好的作用[3]。本文選用市面上常見(jiàn)食用菌及部分珍稀食用菌，包括：羊肚菌（Morehella esculenta(L.)Per），圓孢蘑菇（Agaricus gennadii(Chot.et Boud)P.D.Orton），杏鮑菇（Pleurotus eryngii Quel.），香菇（Lentinus edodes(Berk.)sing），圓菇（Mushroom），白玉菇（Pleurotus nebrodensis），平菇（Pleurotus ostreatus），金針菇（F.velutipes and Pleurotus ostreatus），姬菇（Pleurotus ostreatus）進(jìn)行試驗(yàn)分析，采用DPPH自由基清除能力、鐵氰化鉀還原能力及羥基自由基清除能力測(cè)定評(píng)價(jià)9種食用菌甲醇提取物的抗氧化能力，旨在為日常生活品質(zhì)的提高及食用菌的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原料

羊肚菌和圓孢蘑菇由青海民族大學(xué)盧永昌教授采集提供。白玉菇、香菇、圓菇、平菇、姬菇、金針菇和杏鮑菇均購(gòu)買(mǎi)于青海省西寧市華聯(lián)超市。

1.2 試驗(yàn)試劑

1，1二苯基-2-苦肼基自由基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl free radical，DPPH，純度＞97%）購(gòu)自日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、鹽酸購(gòu)自天津市大茂化學(xué)劑廠,均為分析純；TRIS購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；鄰二氮菲購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸購(gòu)自上海譜振生物有限公司；無(wú)水甲醇；蒸餾水。

1.3 儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，T6新悅，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，R-215，瑞士步琪；離心機(jī)，TD3，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，HH-6，金壇市杰瑞爾電器有限公司；數(shù)控超聲波清洗器，KH-300DE，昆山禾創(chuàng)產(chǎn)生儀器有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 原料的預(yù)處理

將9種食用菌置于電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)在40℃干燥20 h，使食用菌充分干燥。取出，用粉碎機(jī)將其粉碎，過(guò)80目篩，干粉包裝密封，備用。

1.4.2 樣品提取液制備

稱取上述備用9種食用菌粉5.0 g，置于錐形瓶中，按照料液比1∶3的比例加入純甲醇溶液，超聲提取30 min后，過(guò)濾，重復(fù)以上步驟2次，合并3次濾液，真空干燥后得9種食用菌甲醇提取物，稱取甲醇提取物0.1 g，甲醇定容至10 mL容量瓶中，作為儲(chǔ)備液待用。

1.4.3 DPPH自由基清除能力測(cè)定

取1.0 mL不同濃度的甲醇提取液加入到2.0 mL濃度為35 mL/L的DPPH溶液中，在室溫下，以100 r/min，離心30 min后，于517 nm處測(cè)定9種食用菌不同濃度甲醇提取液的吸光度。以抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照，并計(jì)算DPPH自由基清除能力。

式中：A0為空白組，即為不加入樣品溶液的DPPH體系的吸光度；A為加入樣品溶液的吸光度。

1.4.4 還原能力測(cè)定

采取鐵氰化鉀還原法[4]：分別量取2.5 mL不同濃度的甲醇提取物溶液，加入2.5 mL pH 6.6的磷酸鹽緩沖液，2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，混勻，50℃恒溫20 min后，體系中加入2.5 mL體積分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸，以2 200 r/min離心15 min，取上清液5 mL，再加入蒸餾水5 mL，0.1%的FeCl3溶液1 mL，于700 nm處測(cè)定吸光度，吸光度越高，證明還原能力越強(qiáng)。

1.4.5 羥基自由基清除能力測(cè)定

取8支10 mL的比色管，依次在1 mL pH 8.2的Tris-HCl溶液中，加入0.3 mL 7.5 mmol/L的磷酸亞鐵銨溶液，0.3 mL 7.5 mmol/L的鄰二氮菲溶液。其中1號(hào)作為空白組，3～8號(hào)加入1 mL不同濃度的羊肚菌甲醇提取液，2～8號(hào)中加入1 mL 7.5 mmol/L的H2O2溶液，最后將1～8號(hào)比色管定容至10 mL，置于37℃水浴中充分反應(yīng)1 h后，取出，于510 nm處測(cè)定吸光度，并計(jì)算相應(yīng)的羥基自由基清除能力。其他8種食用菌同法測(cè)定。

式中：A1和A2分別為體系不加H2O2和加H2O2時(shí)的吸光度，A3為加入甲醇提取物溶液后的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

DPPH分子是一種人工合成且穩(wěn)定的有機(jī)自由基，其結(jié)構(gòu)中含有3個(gè)苯環(huán)，1個(gè)N原子上有一個(gè)孤對(duì)電子[5]。其甲醇或乙醇溶液呈深紫紅色，并在515～520 nm范圍有最大吸收峰[6]。當(dāng)向DPPH自由基溶液中加入自由基清除劑，孤對(duì)電子被配對(duì)，呈深紫紅色的DPPH自由基被還原成黃色DPPH-H非自由基形式，其褪色程度與所接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因此可通過(guò)測(cè)定其吸光度進(jìn)行定量分析[7-8]。清除DPPH自由基是DPPH法的根據(jù)[9]。9種食用菌甲醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力有所差別，為了評(píng)價(jià)9種食用菌甲醇提取物的抗氧化能力和自由基清除能力，選擇清除率為50%時(shí)9種食用菌甲醇提取物的濃度(EC50)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，EC50值越小，其清除自由基能力越強(qiáng)。9種食用菌甲醇提取物的DPPH自由基清除結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 食用菌甲醇提取物的DPPH清除自由基能力

圖2 食用菌甲醇提取物的DPPH清除自由基能力

由圖可知：9種食用菌甲醇提取物對(duì)自由基清除能力均隨著濃度增加有顯著的提高，當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)，清除能力不再增加，且由其擬合曲線可得出半數(shù)清除濃度（EC50），羊肚菌、圓孢蘑菇、杏鮑菇、香菇、圓菇、白玉菇、平菇、金針菇和姬菇的EC50分別為 563.72、346.50、1 892.99、2 155.21、1 427.06、1 581.34、1 002.17、2 106.11和1 201.66 μg/mL。

9種食用菌對(duì)DPPH自由基的清除能力由大到小依次為：圓孢蘑菇＞羊肚菌＞平菇＞姬菇＞圓菇＞白玉菇＞杏鮑菇＞金針菇＞香菇。抗壞血酸EC50可達(dá)到48.09 μg/mL，均高于9種食用菌。其中，某些食用菌會(huì)隨著其濃度增大到一定程度時(shí)清除率會(huì)降低，可能是由于，食用菌濃度增大以后提取液顏色加深，對(duì)吸光度的測(cè)定有影響，從而影響清除率。另一方面，一定濃度下DPPH溶液中，提供的自由基有限，隨著反應(yīng)物增多從而達(dá)到飽和。

結(jié)果表明，圓孢蘑菇、羊肚菌甲醇提取物雖低于抗壞血酸DPPH自由基清除能力，但明顯高于其他7種食用菌。

2.2 還原能力測(cè)定

抗氧化物質(zhì)提供電子能力的重要指標(biāo)可以用還原能力表示，其通過(guò)提供電子可以使自由基變成穩(wěn)定的分子，從而失去活性[4]。許多研究證實(shí)抗氧化活性同還原力是密切相關(guān)的[10]。本文通過(guò)鐵氰化鉀還原法測(cè)定9種食用菌的還原能力。9種食用菌還原能力測(cè)定即鐵氰化鉀還原法測(cè)定結(jié)果如圖3、圖4。

圖3 食用菌甲醇提取物還原能力測(cè)定

由圖可知：當(dāng)甲醇提取物濃度為6 000 μg/mL時(shí)，羊肚菌還原能力最強(qiáng)，且羊肚菌、平菇、金針菇和香菇還原能力仍呈上升趨勢(shì)。以擬合曲線比較9種食用菌還原能力發(fā)現(xiàn)，羊肚菌和圓孢蘑菇無(wú)論在低濃度時(shí)還是高濃度時(shí)都具有很高的還原能力，姬菇還原能力較弱，其他6種食用菌還原能力基本相似。

2.3 羥基自由基清除能力測(cè)定

圖4 食用菌甲醇提取物還原能力測(cè)定

自由基是引起人類疾病以及衰老的重要因素[11]，在人體內(nèi)的所有自由基中，羥基自由基是最活潑也是最具有毒性的。羥基自由基可以和細(xì)胞中的所有分子，例如有機(jī)酸、磷脂、氨基酸、糖類和核苷等快速反應(yīng)并對(duì)機(jī)體造成損害。所以，羥基自由基清除能力是反映外物對(duì)人體抗氧化性的重要指標(biāo)。9種食用菌羥基自由基清除能力測(cè)定結(jié)果如圖5、圖6。

圖5 食用菌甲醇提取物的羥基自由基清除能力測(cè)定

圖6 食用菌甲醇提取物的羥基自由基清除能力測(cè)定

由圖可知：9種食用菌甲醇提取物羥基自由基清除能力均隨著濃度增加有顯著的提高，當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)，清除能力不再增加，且由其擬合曲線可得出半數(shù)清除濃度（EC50），羊肚菌、圓孢蘑菇、杏鮑菇、香菇、圓菇、白玉菇、平菇、金針菇和姬菇的EC50分別為：939.84、945.88、1 297.10、1 346.94、1179.35、1 427.61、863.74、1 005.54和1 272.18μg/mL，9種食用菌對(duì)DPPH自由基的清除能力由大到小依次為：平菇＞羊肚菌＞圓孢蘑菇＞金針菇＞圓菇＞姬菇＞杏鮑菇＞香菇＞白玉菇。抗壞血酸EC50可達(dá)到85.03 μg/mL，均高于9種食用菌。結(jié)果表明，9種食用菌甲醇提取物對(duì)羥基自由基清除能力與DPPH自由清除能力有所差別，以平菇最高。

3 總結(jié)

本文從DPPH自由基清除能力、還原能力和羥基自由基清除能力3個(gè)方面評(píng)估了羊肚菌、圓孢蘑菇、杏鮑菇、香菇、圓菇、白玉菇、平菇、金針菇和姬菇9種食用菌甲醇提取物的抗氧化活性。綜合以上3個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，羊肚菌、圓孢蘑菇、平菇在不同抗氧化途徑中均具有良好的抗氧化活性，說(shuō)明食用菌中含有某些具有抗氧化能力的化合物。本文研究的缺陷是未對(duì)9種食用菌水提物的抗氧化性能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從而無(wú)法進(jìn)行比較，后續(xù)將繼續(xù)進(jìn)行研究。但研究結(jié)果仍然可為食用菌中天然的抗氧化成分提取分離制備，及其在醫(yī)藥、食品和化妝品應(yīng)用研究開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

[1]Thannickal V J，F(xiàn)anburg B L.Reactive oxygen species in cell signaling[J].Ajp Lung Cellular&Molecular Physiology，2001，279(6)：L1005-L1028.

[2]Halliwell B，Whiteman M.Measuring reactive species and oxidative damage in vivo，and in cell culture：how should you do it and what do the results mean[J].British Journal of Pharmacology，2004，142(2)：231-255.

[3]唐鵬，李學(xué)英，王大忠.食用菌多糖藥理作用研究進(jìn)展[J].臨床合理用藥雜志，2014(17)：176-178.

[4]黃俊麗，張慜.松茸、黑牛肝菌、雙孢白蘑菇提取物體外抗氧化性試驗(yàn)研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，30(3)：342-347.

[5]Eklund P C，L?ngvik O K，W?rn? J P，et al.Chemical studies on antioxidant mechanisms and free radical scavenging properties of lignans[J].Organic&Biomolecular Chemistry，2005，3(3)：3336-3347.

[6]Brand-Williams W，Cuvelier M E，Berset C.Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity[J].LWT-Food Science and Technology，1995，28(1)：25-30.

[7]Shimada K，F(xiàn)ujikawa K，Yahara K，et al.Antioxidative properties of xanthan on the autoxidation of soybean oil in cyclodextrin emulsion[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry，1992，40(6)：945-948.

[8]Kumaran A，Karunakaran R J.Antioxidant and free radical scavenging activity of an aqueous extract of Coleus aromaticus[J].Food Chemistry，2006，97(1)：109-114.

[9]Karioti A，Mensah M H.Composition and Antioxidant Activity of the Essential Oils of Xylopia aethiopica(Dun)A.Rich.(Annonaceae)Leaves，Stem Bark，Root Bark，and Fresh and Dried Fruits，Growing in Ghana[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry，2004，52(26)：36-43.

[10]王根女.紫蘇中酚類物質(zhì)的微波輔助提取工藝及其抗氧化能力研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2010.

[11]牛育鴻，陳婭萍.運(yùn)動(dòng)、由基與衰老研究[J].榆林學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，19(2)：17-19.

Antioxidant Activities of Nine Edible Mushrooms Extracts

ZHAO Ying1，2，LIU Xiao-hui3，LIU Xiao-cui1，2，LU Yong-chang1,2?
(1.College of Pharmacy，Qinghai University for Nationalities，Xining Qinghai,810007;2.Key Laboratory of plant Resources of Qinghai-Tibet Plateau in Chemical Research，Xining Qinghai,810007;3.College of Chemistry and Chemistry Engineering，Qinghai University for Nationalities，Xining Qinghai,810007)

This is a study of antioxidation activities of nine methanol extracts by ability of scavenging DPPH free radical，reducing power and hydrogen peroxide scavenging activity.Including Morehella esculenta(L.)Pers，Agaricus gennadii(Chot.et Boud)P.D.Orton，Pleurotus eryngii Quel.，Lentinus edodes(Berk.)sing，Mushroom，Pleurotus nebrodensis，Pleurotus ostreatus，F(xiàn).velutipes and Pleurotus ostreatus.The results showed that there are different antioxidant activity of nine methanol extracts of edible mushroom species，the methanol extract of Agaricus gennadii(Chot.et Boud)P.D.Orton showed the strongest 2，2-diphenyl-1-picryhydrazyl(DPPH)scavenging capacity，and the EC50 values was 346.50μg/mL，respectively.The methanol extracts of Morehella esculenta(L.)Pers showed the strongest reducing power.And the methanol extracts of Pleurotus ostreatus showed the strongest Hydrogen peroxide scavenging activity，the EC50 of 863.74μg/mL.

morehella esculenta(L.)Pers;agaricus gennadii(Chot.et Boud)P.D.Orton;pleurotus ostreatus；antioxidant activity

S567.3

A

1674-0874(2017)02-0028-05

〔責(zé)任編輯 楊德兵〕

2017-02-08

趙英(1993-)，女，山西運(yùn)城人，在讀碩士，研究方向：藥物分析專業(yè)。?盧永昌，男，教授，通信作者。