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紫草對(duì)重癥急性胰腺炎肺損傷的實(shí)驗(yàn)研究

2017-07-31 23:58劉斌焰劉斌鈺邢雁霞郭敏芳
關(guān)鍵詞:紫草死亡率胰腺

劉斌焰,劉斌鈺,李 祥,邢雁霞,郭敏芳,劉 宏

(山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西大同037009)

紫草對(duì)重癥急性胰腺炎肺損傷的實(shí)驗(yàn)研究

劉斌焰,劉斌鈺,李 祥,邢雁霞,郭敏芳,劉 宏?

(山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西大同037009)

目的觀察紫草對(duì)大鼠重癥急性胰腺炎(SAP)肺組織病理變化及血清TNF-α、IL-6和NO的影響。方法選用Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(NS組)、模型組(SAP組)、紫草3 g/kg(H-紫草組)和紫草1 g/kg組(L-紫草組),檢測(cè)術(shù)后24 h和72 h肺組織病理變化及血清TNF-α、IL-6和NO水平。結(jié)果 H-紫草組和L-紫草組死亡率明顯低于SAP組;H-紫草組和L-紫草組NO活性較高與SAP組相比P〈0.01;而血清TNF-α和IL-6的含量顯著降低,與SAP組比較。肺組織病理變化:SAP組可見肺間質(zhì)充血、水腫,炎性細(xì)胞浸潤嚴(yán)重,肺泡腔部分融合成肺大泡。H-紫草組和L-紫草組大鼠肺組織炎癥反應(yīng)明顯較模型組減輕。結(jié)論紫草能降低SAP大鼠死亡率,提高血清NO活性、降低TNF-α和IL-6含量,減輕SAP所致的肺損傷。

紫草;重癥急性胰腺炎(SAP);一氧化氮(NO);腫瘤壞死因子(TNF-α);白細(xì)胞介素-6(IL-6);

重癥急性胰腺炎(Severe Acute Pancreatitis,SAP)以并發(fā)癥多、預(yù)后差、病變發(fā)展快、死亡率高為臨床特點(diǎn)[1]。SAP致病機(jī)制尚不明了,與胰的自身消化有關(guān),常并發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS),甚至多器官功能障礙綜合征(MODS)而死亡。早期以肝、腎和肺等胰外器官的損傷最為常見,超過50%的SAP患者會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的肺部并發(fā)癥[2-4]。SAP約80%的死因與急性肺損傷(acute lung injury,ALI)的病變過程相關(guān)[5]。目前中藥已成為治療SAP的常規(guī)方法[6]。紫草是傳統(tǒng)中草藥,最初記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,是紫草科(Boraginaceae)多年生草本植物,新疆紫草或內(nèi)蒙紫草的干燥根。新疆紫草稱軟紫草,在我國有悠久的藥用歷史,其味甘咸,性寒,具有涼血活血,解毒透疹之功用[7];中藥紫草用于治療感染炎癥性的疾病已有上千年記載,課題組前期研究發(fā)現(xiàn)紫草對(duì)SAP合并的肝腎損傷有比較好的療效[8],本課題探討紫草對(duì)SAP合并肺損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)藥物

紫草購于大同市思邁樂藥店;浸泡,水煎,過濾濃縮成1∶1藥液(每mL含生藥1 g),4℃冰箱保存?zhèn)溆?。用時(shí)分別配成60%和20%的水溶液,按照5 mL/kg給予。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠,體質(zhì)量350 g左右,由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(晉)2014-001。

1.3試劑

?;悄懰徕c為美國Sigma公司產(chǎn)品;腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)試劑盒為上海西塘公司產(chǎn)品;一氧化氮(NO)試劑盒為南京建成產(chǎn)品。

1.4方法

取Wistar大鼠60只,隨機(jī)分為4組,假手術(shù)組(NS組),僅行開腹術(shù)并只輕翻動(dòng)胰腺數(shù)次后關(guān)腹,模型組(SAP組)、紫草3 g/kg(H-紫草組)和紫草1 g/kg組(L-紫草組),均制成SAP模型,用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉。麻醉后,常規(guī)備皮,正中開腹,用小動(dòng)脈夾夾閉膽管出肝門處,1 mL注射器針頭經(jīng)十二指腸大乳頭逆行向膽胰管內(nèi)勻速注入5%?;悄懰徕c(0.4 mL/kg),等2 min后,取下小動(dòng)脈夾,拔出微量注射器,縫合腹壁。制成重癥急性胰腺炎模型[9]。術(shù)后H-紫草組和L-紫草組立即分別給予3 g/kg和1 g/kg紫草,每日2次灌胃;SAP組和NS組分別給予NS做對(duì)照,每日觀察大鼠情況并繼續(xù)給藥。

1.4.1生化指標(biāo)檢測(cè)

分別在術(shù)后不同時(shí)間取血分離血清,用雙抗體夾心法(ELISA)法測(cè)定血清TNF-α和IL-6含量;采用硝酸還原酶法測(cè)定NO。檢測(cè)方法按測(cè)試盒說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.4.2組織標(biāo)本制備

各組于術(shù)后24 h和72 h取肺組織,置10%中性甲醛液固定1 d,常規(guī)制成石蠟塊切片,蘇木精—伊紅(HE)染色,供病理檢測(cè)。

1.4.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件19.5處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,計(jì)量資料用F檢驗(yàn),死亡率用χ2檢驗(yàn),以P〈0.05作為顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1肉眼觀察

NS組大鼠在1 d后活動(dòng)與進(jìn)食趨于正常;模型組大鼠出現(xiàn)倦臥、少動(dòng)、食量減少、呼吸急促、精神低靡、背毛蓬松失去光澤等表現(xiàn),部分大鼠可見胰腺出血嚴(yán)重甚至壞死;H-紫草組和L-紫草組大鼠在2 d后活動(dòng)與進(jìn)食開始增加。解剖可見NS組大鼠胰腺無充血水腫,肺顏色正常,質(zhì)軟富彈性。SAP組,肺充血腫脹呈暗紅色,有大量黃色腹水,紫草組的組織損傷較SAP組有所減輕。

2.2死亡率比較

NS組全部存活。1 d的死亡率:SAP組55.56%(10/18),H-紫草組16.67%(3/18),L-紫草組27.78%(5/18),χ2=5.89 P 〈 0.05,χ2=2.85,P>0.05。3 d的死亡率:SAP組88.89%(16/18);H-紫草組27.78(5/18),L-紫草組50.00%(9/18),χ2=13.83,χ2=6.42,P〈0.01,紫草能降低SAP大鼠死亡率。

2.3 紫草對(duì)SAP大鼠血清TNF-α、IL-6和NO的影響

H-紫草組和L-紫草組NO水平較高、TNF-α和IL-6比較低,與SAP組比較P〈0.01;結(jié)果見表1、表2。

表1 紫草對(duì)SAP大鼠血清TNF-α和IL-6含量變化的影響(n=7)

表2 紫草對(duì)SAP大鼠血清NO含量變化的影響/μmol·L-1

2.3.1血清TNF-α和IL-6的測(cè)定結(jié)果

血清TNF-α和IL-6的檢測(cè),采用酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)試劑盒。在酶標(biāo)儀上測(cè)定(測(cè)定波長為450 nm)血清中TNF-α和IL-6含量,OD值的測(cè)定需要在加入終止液中止反應(yīng)后10 min之內(nèi)完成測(cè)定。結(jié)果見表1。

從表1可見,24 h血清TNF-α含量比72 h高,而IL-6則相反;SAP組大鼠血清TNF-α和IL-6含量最高,紫草3 g/kg組和紫草1 g/kg組與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P〈0.01。

2.3.2血清NO測(cè)定結(jié)果

采用硝酸還原酶法測(cè)定NO,結(jié)果見表2。

從表2可見,H-紫草組和L-紫草組NO水平較高,與SAP組比較(P〈0.01);

2.4肺組織在光鏡下的病理改變

以肺組織中性粒細(xì)胞浸潤作為觀察指標(biāo)。發(fā)現(xiàn)NS組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰,無中性粒細(xì)胞浸潤。模型組炎性細(xì)胞浸潤嚴(yán)重,肺泡腔部分融合成肺大泡,有局灶性出血。紫草組大鼠肺組織有炎性細(xì)胞浸潤,但比模型組輕。結(jié)果見圖1。

圖1 術(shù)后1、3 d 4組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化(×200)

3 討論

自1998年Rindernecht提出了SAP的“白細(xì)胞過度激活”學(xué)說以來,一直認(rèn)為SAP的發(fā)生發(fā)展與炎性細(xì)胞的激活及炎癥因子的釋放有關(guān)。TNF-α是引起ALI的關(guān)鍵性炎癥介質(zhì),在SAP病變的早期就升高,與SAP的嚴(yán)重程度和死亡率成正相關(guān),因此臨床把TNF-α作為判定其嚴(yán)重程度及預(yù)后的指標(biāo)[10]。TNF-α具有多種生物學(xué)效應(yīng),能促進(jìn)IL-6、IL-8等炎性細(xì)胞的合成和釋放,引起“瀑布”效應(yīng),進(jìn)而造成SIRS和MODS等嚴(yán)重后果[11]。因此炎癥反應(yīng)的有效調(diào)控也成為AP肺損傷防治的研究熱點(diǎn)。

IL-6是又一個(gè)關(guān)鍵性的炎癥介質(zhì),參與SAP的急性期發(fā)熱等反應(yīng),IL-6能促進(jìn)TNF-α的釋放,TNF-α又能誘導(dǎo)IL-6的合成和釋放,形成惡性循環(huán),導(dǎo)致胰腺組織出血壞死,AP病情加。因此IL-6可作為早期評(píng)價(jià)AP嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[12]。

本研究顯示SAP組血清的TNF-α和IL-6水平顯著增高,肺鏡下可見間質(zhì)性水腫和炎性細(xì)胞浸潤等特征性病理變化。紫草能降低SAP死亡率,與SAP組比較P〈0.01;紫草明顯降低血清TNF-α和IL-6含量,與SAP組比較P〈0.01;肺炎性細(xì)胞浸潤紫草組亦比模型組輕。

近年來研究發(fā)現(xiàn),NO在SAP的發(fā)病機(jī)制中有重要的作用。NO能明顯減輕胰和肺的病變,對(duì)SAP并發(fā)ALI具有一定的治療作用[13]。在各種應(yīng)激狀態(tài)下,NO對(duì)改善機(jī)體的微循環(huán)發(fā)揮了非常重要的作用,表現(xiàn)為擴(kuò)血管改善微循環(huán),抑制血小板(blood platelet,PLT)和白細(xì)胞(white blood cell,WBC)在內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附、聚集,預(yù)防血栓形成,還能抑制彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)和炎性細(xì)胞的浸潤[14]。本研究顯示紫草能增加SAP大鼠血清NO水平,改善胰腺血管微循環(huán),對(duì)大鼠SAP合并肺損傷具有保護(hù)作用。

紫草使SAP大鼠血清NO水平升高,顯著降低TNF-α和IL-6含量,使肺組織炎性細(xì)胞浸潤減少,從而減輕SAP肺組織的損傷,有效降低死亡率,其機(jī)制可能與改善微循環(huán),降低炎性細(xì)胞的激活,減少炎癥因子的釋放有關(guān),進(jìn)而對(duì)SAP引起的肺損傷有保護(hù)作用。

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The Experimental Study of Lithospermum on Lung Injury in Severe Acute Pancreatitis

LIU Bin-yan,LIU Bin-yu,LI Xiang,XING Yan-xia,GUO Min-fang,LIU Hong
(School of Life Science,Shanxi Datong University,Datong Shanxi,037009)

ObjectiveTo investigate the effect of Lithospermum on the pathological changes in lung tissue and TNF-α、IL-6、NO in serum induced by severe acute pancreatitis(SAP).MethodsWistar rats were randomly divided into four groups:sham operation group,model group,3g/kg Lithospermum treatment group and 1g/kg Lithospermum treatment group.The pathological changes in lung tissue and TNF-α、IL-6、NO in serum were detected at 24h and 72h after surgery.All experiment datas were showed by means± standard deviation.ResultsThe mortality of rat in 3g/kg Lithospermum treatment group and 1g/kg Lithospermum treatment group was significantly lower than that in the model group(p〈0.01);The activity of NO were higher in 3g/kg Lithospermum treatment group and 1g/kg Lithospermum treatment group was significantly lower than that in the model group(p〈0.01);The level of TNF-α and IL-6 in serum were decreased significantly than model group(p〈0.01);The pathological changes in lung tissue:,massive alveolar interstitial tissue edema,hemorrhage,and inflammatory cell infiltration were observed in model group,part of alveolar fused into bullae of lung.The inflammatory response of the lung in Lithospermum treatment group was more alleviated than in the model group.Conclusion Lithospermum can reduce mortality of Rat with SAP,increase the activity of NO,inhibit the level of TNF-α and IL-6,reduce lung injury induced by SAP.

lithospermum;severe acute pancreatitis(SAP);NO;tumor necrosis factor-a(TNF-α);interleukin-6(IL-6)

R657.5;R285.5

A

〔責(zé)任編輯 楊德兵〕

1674-0874(2017)01-0038-03

2016-09-23

山西大同大學(xué)科研資助項(xiàng)目[2013K2];山西大同大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新一般資助項(xiàng)目[XDC2016201];山西省大同市科技公關(guān)資助項(xiàng)目[2016100]

劉斌焰(1979-),男,山西大同人,碩士,講師,研究方向:胰腺炎的基礎(chǔ)研究;?劉宏,男,博士,教授,通信作者。

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