寧映霞，董巍檑，陳 阿，許 暢，崔迎紅，李 翔

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州 510120；2. 南華大學(xué)第一附屬醫(yī)院，衡陽 421001；3. 湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長沙 410013）

DFOG對卵巢癌OVCAR3源性球細胞遷移和Tw ist1/FoxM 1表達的影響

寧映霞1，董巍檑2，陳 阿3，許 暢3，崔迎紅3，李 翔3

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州 510120；2. 南華大學(xué)第一附屬醫(yī)院，衡陽 421001；3. 湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長沙 410013）

目的：檢查金雀異黃素（genistein，GEN）及其新型合成類似物7-二氟甲氧基-5，4’-二-正辛烷氧基金雀異黃素（7-difluoromethoxyl-5，4'-di-n-octyl genistein，DFOG）對人卵巢癌OVCAR3源性球細胞遷移和Twist1/ FoxM1蛋白表達的作用。方法：Transwell小室細胞遷移試驗檢測細胞遷移率。蛋白質(zhì)印跡分析細胞Twist1和FoxM1蛋白表達水平。結(jié)果：與OVCAR3細胞相比，OVCAR3源性球細胞遷移率更高。GEN（40μM）或DFOG（5μM和10μM）抑制OVCAR3源性球細胞遷移。此外，GEN（40μM）或DFOG（5μM和10μM）平行地下調(diào)Twist1和FoxM1蛋白表達。結(jié)論：GEN及其類似物DFOG抑制OVCAR3源性球細胞體外遷移與其抑制Twist1和FoxM1蛋白表達相關(guān)。

金雀異黃素；7-二氟甲氧基-5，4’-二-正辛烷氧基金雀異黃素；卵巢癌；卵巢癌干細胞樣細胞；細胞遷移

越來越多的證據(jù)表明腫瘤干細胞是惡性腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的主要原因，而現(xiàn)有的治療手段無法針對腫瘤干細胞這一導(dǎo)致腫瘤治療失敗、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的原因性細胞［1］。我們先前的研究表明，5，4’-二-正辛烷氧基-7-二氟甲氧基金雀異黃素（7-difluoromethyl-5，4’-di-n-octylgenistein，DFOG）抑制具卵巢干細胞樣細胞特性的SKOV 3和A 2780源性球細胞自我更新能力［2，3］。本文的研究目的在于確定金雀異黃素（genistein，GEN）及其新型合成類似物DFOG能否抑制人卵巢癌OVCAR3源性球細胞遷移和調(diào)控Twist1及FoxM1蛋白表達。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑DFOG（分子量：544，性狀：黃色粉末，純度：98%）參照文獻［4］方法合成和結(jié)構(gòu)確證，由湖南師范大學(xué)曹建國教授惠贈。金雀異黃素（Sigma-Aldrich公司）。鼠抗人β-actin單克隆抗體源自美國Santa Cruz Biotechnology，Inc.公司；兔抗人Twist1多克隆抗體源自美國Abcam，Inc. 公司；鼠抗人FOXM1抗體（K-19）（美國Santa Cruz Biotechnology 公司）；增強化學(xué)發(fā)光檢測試劑購自美國Amersham Pharmacia Biotech公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與球培養(yǎng)人卵巢癌細胞系OVCAR3購自中國科學(xué)院細胞中心（中國上海市）。參照文獻［2，3］描述的方法和步驟，完成細胞培養(yǎng)和腫瘤球培養(yǎng)，取OVCAR3細胞系第2代球細胞作為OVCAR3源性球細胞。

1.3 Transwell小室遷移試驗取帶Transwell嵌合小室（8 μm孔徑聚碳酸酯膜）6孔培養(yǎng)板（美國corning公司），每孔加入1.0mL完全干細胞條件培養(yǎng)基作為趨化試劑（下室）；然后，放置嵌合小室，用無生長因子干細胞條件培養(yǎng)基懸浮細胞，每嵌合小室（上室）接種5000個細胞；培養(yǎng)24 h，用棉簽清除未遷移的細胞；用甲醇固定下室面膜上的遷移細胞，并進行HE染色。在光學(xué)顯微鏡下，計數(shù)每孔通過膜遷移的細胞數(shù)，以O(shè)VCAR3細胞或溶媒（0.1% DMSO）處理OVCAR3源性球細胞為100%標化細胞遷移率。

1.4 蛋白質(zhì)印跡參照先前發(fā)表文獻［5，6］的方法和步驟完成蛋白質(zhì)印跡分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析各組實驗數(shù)據(jù)錄入Spss 20.0 for windows evaluation 軟件建立數(shù)據(jù)庫，用均數(shù)±標準差（±sD）表示，采用One Way ANOVA方差分析；方差齊性檢驗，在方差齊性時，多組均數(shù)間比較采用LSD法，在方差不齊時，多組均數(shù)間采用Tukey's檢驗。P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OVCAR3細胞與OVCAR3源性球細胞體外遷移能力的比較與OVCAR3細胞相比，OVCAR3源性球細胞遷移率顯著地增高（P＜0.05；圖1）。

2.2 OVCAR3細胞與OVCAR3源性球細胞Tw ist1和FoxM 1蛋白表達的比較與OVCAR3細胞相比，OVCAR3源性球細胞Twist1和FoxM1蛋白表達明顯上調(diào)（圖2）。

2.3 DFOG對OVCAR3源性球細胞遷移的影響與溶媒（0.1% DMSO）處理OVCAR3源性球細胞比較，GEN（40μM）或DFOG（5μM和10μM）抑制OVCAR3源性球細胞遷移（P＜0.05；圖3）。

圖1 OVCAR3源性球細胞展示出更高細胞遷移率（Mean±SD，n=3）OVCAR3：OVCAR3細胞；OCSLC：OVCAR3源性球細胞。OVCAR3細胞與OVCAR3細胞源性球細胞比較：*P＜0.05。

圖2 OVCAR3源性球細胞高表達Twist1和FoxM1蛋白OVCAR3：OVCAR3細胞；OCSLC：OVCAR3源性球細胞。

圖3 DFOG抑制OVCAR3源性球細胞遷移（Mean±SD，n=3）GEN（40.0 μM）或DFOG（5.0 μM和10.0 μM）處理OVCAR3源性球細胞與溶媒（0.1% DMSO）處理OVCAR3源性球細胞比較：*P＜0.05；DFOG（10.0 μM）處理OVCAR3源性球細胞與GEN（40.0 μM）或DFOG（5.0 μM）處理OVCAR3源性球細胞比較：#P＜0.05。

2.4 DFOG對OVCAR3源性球細胞Tw ist1和FoxM 1蛋白表達的影響圖4可見，GEN（40.0 μM）能有效地抑制OVCAR3源性球細胞Twist1和FoxM1蛋白表達；DFOG（5.0 μM和10.0 μM）處理顯著地下調(diào)OVCAR3源性球細胞Twist1和FoxM1蛋白表達。

圖4 DFOG下調(diào)OVCAR3源性球細胞Twsit1和FoxM1蛋白表達

3 討論

先前的實驗研究結(jié)果證明，從建立人卵巢癌細胞系得到的球細胞具有自我更新能力和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化表型［2，3，5，6］。本文采用Transwell小室細胞遷移試驗檢測的結(jié)果表明，與OVCAR3細胞相比，OVCAR3源性球細胞具有更高體外細胞遷移能力。從而說明更強體外細胞遷移能力是一種卵巢癌干細胞樣細胞的功能特性。

我們曾報道金雀異黃素類似物DFOG抑制從建立人卵巢癌細胞系得到的卵巢癌干細胞樣細胞腫瘤球形成［2，5，6］。本文實驗發(fā)現(xiàn)，與溶媒（0.1% DMSO）處理OVCAR3源性球細胞比較，GEN（40μM）或DFOG（5μM和10μM）抑制OVCAR3源性球細胞遷移。

Twist是一種高度保守的堿性-螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎發(fā)育中促進細胞運動方面起重要作用［7］。腫瘤細胞中，Twist被視為癌基因，因為其表達增加可通過誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）而促進疾病進程和轉(zhuǎn)移［8］。本文的實驗結(jié)果顯示，OVCAR3源性球細胞展示出更高Twist1蛋白表達水平。

我們先前發(fā)表文章指出，DFOG抑制SKOV3源性卵巢癌干細胞樣細胞自我更新與下調(diào)FoxM1蛋白表達相關(guān)［5］。Chen PM等研究建議FoxM1-MMP2信號軸活化促進肺癌細胞侵襲［9］。Qian J等的研究表明Twist1上調(diào)FoxM1促進胃癌細胞增殖［10］。在本文的研究中，我們發(fā)現(xiàn)OVCAR3源性球細胞過表達FoxM1蛋白。

值得注意的是，在本文的研究中，我們證實GEN及其新型合成類似物DFOG明顯下調(diào)OVCAR3源性球細胞Twist1和FoxM1蛋白表達。 總結(jié)上述實驗研究結(jié)果，我們有理由提出如下建議：（1）OVCAR3源性球細胞更強細胞遷移能力可能與Twist1和FoxM1蛋白過表達有關(guān)；（2）GEN及其新型合成類似物DFOG抑制OVCAR3源性球細胞作用與其下調(diào)Twist1和FoxM1蛋白表達相關(guān)。

［1］ Lele SB, Morrison CD, Odunsi K. Ovarian cancer spheroid cells with stem cell-like properties contribute to tumor generation, metastasis and chemotherapy resistance through hypoxia-resistant metabolism［J］. PLoS One.2014, 9(1): e84941.

［2］ 寧映霞, 曹建國.7-二氟甲氧基-5, 4'-二正辛烷氧基金雀異黃素對卵巢癌干細胞樣細胞自我更新和FoxM1表達的影響［J］. 湖南師范大學(xué)學(xué)報 (醫(yī)學(xué)版), 2014, (01): 10-13.

［3］ 寧映霞, 鄧宇傲, 曹建國. DFOG抑制卵巢癌A2780細胞系球形成細胞自我更新與活化FoxO3a相關(guān)［J］. 湖南師范大學(xué)學(xué)報 (醫(yī)學(xué)版), 2014, (02): 1-4.

［4］ Xiang HL, Liu F, Quan MF, Cao JG, Lv Y.7-difluoromethoxyl-5, 4’-di-n-octyl genistein inhibits growth of gastric cancer cells through down-regulating forkhead box M1［J］. World J Gastroenterol.2012, 18(33): 4618-4626.

［5］ Ning Y, Luo C, Ren K, Quan M, Cao J. FOXO3a-mediated suppression of the self-renewal capacity of sphere-forming cells derived from the ovarian cancer SKOV3 cell line by 7-difluoromethoxyl-5, 4'-di-n-octyl genistein［J］. Mol Med Rep.2014, 9(5): 1982-1988.

［6］ Ning YX, Li QX, Ren KQ, Quan MF, Cao JG.7-difluoromethoxyl-5, 4'-di-n-octyl genistein inhibits ovarian cancer stem cell characteristics through the downregulation of FOXM1［J］. Oncol Lett.2014, 8(1): 295-300.

［7］ Li J, Zhou BP. Activation of β-catenin and Akt pathways by Twist are critical for the maintenance of EMT associated cancer stem cell-like characters［J］. BMC Cancer.2011, 11: 49.

［8］ Su YW, Xie TX, Sano D, Myers JN. IL-6 stabilizes Twist and enhances tumor cell motility in head and neck cancer cells through activation of casein kinase 2［J］. PLoS One.2011, 6(4): e19412.

［9］ Chen PM, Wu TC, Shieh SH, Wu YH, Li MC, Sheu GT, Cheng YW, Chen CY, Lee H. MnSOD promotes tumor invasion via upregulation of FoxM1-MMP2 axis and related with poor survival and relapse in lung adenocarcinomas［J］. Mol Cancer Res.2013, 11(3): 261-71.

［10］ Qian J, Luo Y, Gu X, Zhan W, Wang X. Twist1 Promotes Gastric Cancer Cell Proliferation through Up-Regulation of FoxM1［J］. PLoS One.2013, 8(10): e77625.

Effects of DFOG on M igration and Expression of Tw ist1/FoxM 1 in Human Ovarian Cancer OVCAR3-derived Spheroids

Ning Ying-Xia1, Dong Wei-Lei2, Chen A3, Xu Chang3, Cui Ying-Hong3, Li Xiang3
(1. Department of Gynaecology and Obstetrics, The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510120, China; 2. Department of Gynaecology and Obstetrics, University of South China, Hengyang 421001, China; 3. Pharmaceutical Science, Medical College, Hunan Normal University, Changsha 410013, China)

Objective To investigate the effects of genistein (GEN) and its novel synthetic analogue 7-difluoromethoxyl-5, 4’-di-n-octyl genistein (DFOG) on the cell migration and the expression of Twist1/FoxM1 in human ovarian cancer OVCAR3-derived spheroids. M ethods Cell migration ratio was detected using Transwell cell migration assay. The expression of Twist1 and FoxM1 was analyzed using western blot. Results Compared with OVCAR3 parent cells, cell migration ratio was higher in OVCAR3-derived spheroids. Moreover, both GEN (40μM) and DFOG (5μM and10μM) could inhibited the cell migration ratio in OVCAR3-derived spheroids. And they could also parallelly down-regulate the protein expression of Twist1 and FoxM1. Conclusion Cell migration inhibited by GEN and its analogue DFOG is associated with inhibiting the expression of Twsit1 and FoxM1 in OVCAR3-derived spheroids.

genistein; 7-difluoromethoxyl-5, 4’-di-n-octyl genistein; ovarian cancer; ovarian cancer stem-like cells; cell migration

R737.31

A

1673-016X（2017）04-0001-03

2017-01-03

國家自然青年基金 (No.81301894)；廣東省科技計劃項目 (No.2014A020211028)；廣州市教育系統(tǒng)科研項目(No.1201410508)

董巍檑，E-mail：540325366@qq. com