黃幼生，解 娜，張藝馨，羅志飛，薛逢貴

·論 著·

胃癌組織microRNA表達譜檢測及生物信息學分析

黃幼生，解 娜，張藝馨，羅志飛，薛逢貴

目的 探討微小RNA(microRNA, miRNA)在胃癌組織中的表達特征。方法 采用Exiqon miRNA芯片檢測3對胃癌組織及其配對正常胃黏膜組織中miRNA差異表達情況，隨機選取10個上調或下調差異表達的miRNA應用qPCR技術驗證；應用生物信息學分析差異表達的miRNA及其靶向基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。結果 芯片結果顯示，在3對胃癌組織中有111個miRNA出現(xiàn)差異表達(差異倍數(shù)>2，P<0.05)，其中上調表達95個，下調表達16個。進一步行qPCR驗證的10個miRNA的表達情況與miRNA芯片結果一致(P=0.040)。聚類分析顯示胃癌組織與癌旁組織存在明顯的差異表達，基因本體(gene ontology, GO)及pathway分析顯示差異表達的miRNA涉及胃癌的凋亡、周期轉換、分化、侵襲、轉移及各種腫瘤通路的激活等。結論 胃癌組織中miRNA存在異常表達，可能涉及胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

胃腫瘤；miRNA；差異表達；生物信息學；miRNA芯片

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，在我國發(fā)病率及病死率均位居惡性腫瘤的第2位[1-2]。胃癌組織學上存在高度的異質性，闡明胃癌發(fā)病的分子機制是改善治療、提高患者預后的關鍵。微小RNA(microRNA, miRNA)是一類大小21～25個核苷酸的非編碼RNA(noncoding RNAs, ncRNAs)，一般來源于染色體的非編碼區(qū)域，由約70 nt大小的可形成發(fā)夾結構的前體加工而來，其作用是在轉錄水平上對基因表達產(chǎn)生抑制性作用[3]。越來越多的資料顯示，miRNA具有表達的特異性，能夠準確區(qū)分組織的來源，其結構或表達異常與腫瘤的發(fā)生密切相關，涉及腫瘤的浸潤、轉移、分期及預后等[3-6]。這些研究表明，miRNA在腫瘤組織中的異常表達具有輔助診斷及靶向開發(fā)治療藥物的潛力。本實驗應用Exiqon miRNA寡核苷酸芯片檢測3對胃癌及其配對正常胃黏膜組織中的miRNA表達特征，行qPCR驗證。應用生物信息學分析差異表達的miRNA生物學功能及其對胃癌發(fā)生、發(fā)展中所起的作用，為進一步闡明胃癌的發(fā)病機制及探索開發(fā)胃癌分子靶標奠定分子理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 收集海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院2014年1月新鮮切除的標本，切除后立即液氮保存，選擇3對胃癌及其配對正常胃黏膜組織(距離腫瘤邊緣5 cm)。患者信息包括年齡、性別、發(fā)生部位等均從臨床病例信息中心獲取，患者術前均未接受化療或放療，病例診斷、分期、分型由兩位高級職稱病理專家根據(jù)石蠟組織HE切片確診。標本使用已獲得患者知情同意并經(jīng)過海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會討論通過。

1.2 主要試劑 TRIzol Reagent為Invitrogen Life Technologies產(chǎn)品；RNasey Mini試劑盒購自QIAGEN公司；miRCURYTM Array Power標記試劑盒(Cat #208032-A)、miRCURYTM LNA芯片(v.18.0)為Exiqon公司產(chǎn)品。miRcute miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒、miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒購自北京天根生物公司。

1.3 組織總RNA提取及純化 對胃癌及其配對組織中加入適量TRIzol(1 mL/20 mg)，使用BioPulverizer進行組織破碎勻質，隨后RNA提取及純化步驟按TRIzol及RNasey Mini試劑盒使用說明書進行。使用NanoDrop ND-1000測量純化后的RNA濃度，凝膠電泳檢測RNA完整性。

1.4 RNA標記與芯片雜交 抽提的RNA通過質檢后，使用miRCURYTM Array Power標記試劑盒對miRNA進行標記。具體操作由上?？党缮锕就瓿?，簡而言之，1 μg的RNA加水至2 μL，加1 μL的CIP Buffer和CIP酶(Exiqon)。混合后置于37 ℃下30 min。隨后，將樣品置于95 ℃下5 min終止反應。加入3 μL Labeling Buffer，1.5 μL Fluorescent Label (Hy3)，2.0 μL DMSO，2.0 μL Labeling Enzyme。在16 ℃下反應1 h后將樣品置于65°C下15 min終止反應。標記完成后，將樣品與miRCURYTM LNA Array (v.18.0)芯片雜交，根據(jù)Exiqon的實驗方法進行：(1)25 μL樣品與25 μL雜交緩沖液混合，95 ℃下變性2 min，然后置于冰上2 min。(2)與芯片在56 ℃下雜交16～20 h，雜交系統(tǒng)為Nimblegen Systems, Inc., Madison, WI, USA。(3)雜交完成后，使用Wash Buffer Kit (Exiqon公司)清洗芯片，應用Axon GenePix 4000B芯片掃描儀掃描芯片。

1.5 數(shù)據(jù)分析 使用GenePix Pro 6.0讀取芯片掃描圖像，并提取探針的信號值。相同的探針取中值合并。保留在所有樣品中均≥30.0的探針，對全部芯片進行中值標準化，篩選差異表達探針。使用Fold change(>2.0)和P值(P<0.05)篩選兩組樣品間差異表達的miRNA。最后，對差異表達miRNAs進行聚類并繪制聚類圖。差異表達的miRNA Raw 數(shù)據(jù)提交上傳至美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)的基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus database, GEO數(shù)據(jù)庫)，通過號為GSE78091。

1.6 qPCR檢測 選取10個差異表達的miRNA進行qPCR驗證，模版為上述3對胃癌及其配對正常胃黏膜組織標本。應用Primer 6.0引物設計軟件設計miRNA引物，引物合成由英駿生物公司完成，通用引物序列為5′-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3′，miRNA特異性引物序列見表1。應用ABI ViiA7 Real-time PCR儀進行逆轉錄及PCR反應：miRNA逆轉錄采用miRcute miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒，具體操作按試劑盒說明書進行。PCR反應試劑盒采用miRcute miRNA 熒光定量檢測試劑盒。反應體系：2×SYBR Green mix 10 μL，通用引物(10 μmol/L)0.4 μL，特異引物(10 μmol/L)0.4 μL，cDNA 1 μL，50×ROX Reference Dye 1 μL，RNase-free水補充至體積20 μL。反應條件：94 ℃預反應2 min，94 ℃ 20 s、60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算miRNA相對表達值，U6 snRNA為內參。PCR結果應用SPSS 18.0軟件Studentt檢驗進行統(tǒng)計學分析，顯著性檢驗水準α=0.05。

1.7 生物信息學分析 檢索miR2Disease與miRCancer數(shù)據(jù)庫，查詢癌癥相關miRNA, BioVenn軟件在線分析，查找本文中的差異表達miRNA與miR2Disease與miRCancer數(shù)據(jù)庫腫瘤相關miRNA三方重疊數(shù)據(jù)。利用在線miRTarBase軟件(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/)下載差異表達miRNA實驗已驗證的靶向基因，并應用在線DAVID系統(tǒng)(http://david.ncifcrf.gov/)將獲得的靶向基因進行基因本體(gene ontology, GO)及KEGG pathways富集分析。

表1 miRNA特異性引物及U6引物列表

2 結果

2.1 總RNA提取質量分析 為盡可能保持組間數(shù)據(jù)的一致性，本組實驗選擇了病理信息及臨床資料相對接近的3對胃癌病例。3例均為男性，55～58歲(平均56.7歲)，TNM分期ⅢA的彌漫性胃癌(Lauren分類)患者。

3對胃癌及其配對組織提取的總RNA經(jīng)NanoDrop ND-1000檢測，各標本總RAN OD260/280在1.97～2.01之間，總含量均超過30 μg；凝膠電泳鑒定顯示，各標本均有3條清晰的泳帶，28S、18S清晰明亮(圖1)。這些結果表明提取的總RNA含量充足，可用于下一步芯片檢測及qPCR分析。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖1C～3C.胃癌組織；1N～3N.正常胃黏膜組織

2.2 胃癌組織miRNA表達芯片結果分析 3對病例經(jīng)芯片雜交，GenePix Pro 6.0讀取芯片掃描圖像，SAM軟件數(shù)據(jù)分析篩選。有超過2 000個miRNA檢測到表達，400個miRNA在胃癌組織及其正常胃黏膜組織間出現(xiàn)不同程度的差異表達(具體請查詢GEO：GSE78091)。其中，相對正常胃黏膜組織，有95個miRNA在胃癌組織內出現(xiàn)顯著的上調表達，16個出現(xiàn)顯著的下調表達(差異倍數(shù)>2，P<0.05)(圖2A)，前10個上調及下調表達的miRNA見表2。

表2 差異表達的前10個miRNA(胃癌/配對正常胃黏膜組織)

為觀察胃癌及其正常胃黏膜組織中miRNA表達譜是否具有顯著差異性，根據(jù)芯片中所有miRNA的表達特征，無監(jiān)督層次聚類與相關分析被執(zhí)行。結果顯示6組miRNA很清晰的分為兩大組，對應胃癌組及其配對組(圖2B)，表明大量的miRNA在胃癌組織中出現(xiàn)了明顯的表達變化。

2.3 qPCR驗證 為驗證miRNA芯片數(shù)據(jù)的可靠性，10個差異表達的miRNA(7個上調表達，3個下調表達)被隨機選取執(zhí)行qPCR檢測。結果顯示，在這3對胃癌組織中，有7個miRNA出現(xiàn)上調表達，2個出現(xiàn)下調表達，1個未檢測出差異性表達。與芯片檢測的結果基本一致(P=0.040)，表明miRNA芯片檢測結果真實有效(圖3)。

2.4 生物信息學分析 檢索miR2Disease與miRCancer數(shù)據(jù)庫，共獲得780個癌癥相關miRNA，其中與胃癌相關的miRNA共256個。將本組中的差異表達miRNA與這兩群數(shù)據(jù)相比較，通過BioVenn在線軟件分析發(fā)現(xiàn)有24個miRNA與兩大數(shù)據(jù)庫腫瘤相關miRNA重疊，其中與胃癌相關的17個，有8個miRNA表達與其它已驗證的數(shù)據(jù)一致，包括：hsa-miR-106b、hsa-miR-1284、hsa-miR-138、hsa-miR-191、hsa-miR-20a、hsa-miR-23b、hsa-miR-543、hsa-miR-98。

圖2 胃癌組織miRNA差異表達譜分析圖

A.聚類分析圖：1N～3N.配對的正常胃黏膜組織；1C～3C.胃癌組織；紅色表示高表達miRNA，綠色表示低表達miRNA；B.相對配對組織胃癌miRNA表達變化火山圖：左側為下調表達，右側為上調表達的miRNA；豎綠線以外點為差異表達超過2倍數(shù)量的miRNA，橫綠線以上表示P>0.05的miRNA，紅色點代表差異有統(tǒng)計學意義的差異表達miRNA

從mitarBASE數(shù)據(jù)庫[7]下載已驗證的這8個miRNA的靶向基因(至少有兩種方法證實)，共獲得93個基因。利用DAVID數(shù)據(jù)庫提供的基因功能注釋工具(GO及KEGG pathways富集分析)對這93個靶基因進行功能和調控通路分析，結果表明，這些miRNA的異常表達可能與基因表達、DNA轉錄、細胞周期、細胞凋亡、細胞增生等調控失常有關，涉及miRNA腫瘤相關、p53及Akt等信號途徑的激活(圖4)。

圖3 miRNA差異表達qPCR及芯片結果對比圖(胃癌/配對組織)

圖4 KEGG分析P值前10個信號途徑

3 討論

目前在人類組織中發(fā)現(xiàn)近2 000個miRNA，調控大概1/3的人類基因表達。miRNA對靶基因mRNA的作用取決于其與靶基因轉錄體序列互補的程度，通過與靶基因完全互補結合，切割靶mRNA，或與靶基因不完全互補結合，抑制靶基因的翻譯，與靶基因互補結合時，直接靶向切割mRNA；當與靶基因不完全結合時，起調節(jié)基因表達的作用[3-4]。隨著對miRNA研究和認識的加深，異常表達的miRNA可引起相關癌基因的激活或抑癌基因的失活，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展被證實，參與調控腫瘤細胞凋亡、血管生成、細胞周期調節(jié)及腫瘤的浸潤、轉移等[3-4]。

基因芯片是篩選疾病相關miRNA最常用的方法之一，應用該項技術發(fā)現(xiàn)人類大部分常見惡性腫瘤均有miRNA的表達異常[3-5,8]。Volinia等[6]應用基因芯片研究540例腫瘤組織標本的miRNA表達模式，發(fā)現(xiàn)miRNA在不同腫瘤組織中的表達具有組織特異性，上調表達的miRNA-191、miRNA-59、miRNA-17、miRNA-20a、miRNA-92、miRNA-15、miRNA-106a等21個miRNA組合性檢測能正確區(qū)分胃癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、結腸癌和肺癌組織。本實驗利用Exiqon miRNA芯片檢測3對胃癌組織及其配對正常胃黏膜組織，發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中有88個miRNA表達上調，21個表達下調，qPCR的驗證結果與芯片一致，表明胃癌組織中存在miRNA的表達異常。

近年來，關于胃癌組織miRNA異常表達的報道逐漸增多[3,9-11]。Guo等[9]用芯片掃描分析發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中有12個miRNA表達增高。Ueda等[10]分析353對胃癌組織miRNA表達特征發(fā)現(xiàn)，有22個miRNA表達上調，13個表達下調，與胃癌的分型、預后、轉移等有關。陽圣等[11]分析21對胃癌病例，發(fā)現(xiàn)有88個miRNA表達異常。最近研究顯示，miR-340[12]、miR-181a-5p[13]、miR-196b-5p[14]、miR-375[14]等在胃癌中也出現(xiàn)異常表達，與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關。這些研究顯示胃癌組織中存在多量miRNA的異常表達，但不同的研究表達異常的miRNA重合率較低，重復性差。本文通過檢索miR2Disease與miRCancer數(shù)據(jù)庫，共獲得256個胃癌相關miRNA，來源于400篇文獻。本文芯片分析發(fā)現(xiàn)的111個miRNA只有24個先前有過報道，僅17個曾報道與胃癌相關，該17個miRNA中有8個與本文數(shù)據(jù)完全一致。造成重復性差的原因在文獻中沒有得到很好的闡明，作者認為可能與胃癌組織高度異質性、個體、種族的差異性及采用的研究方法不同有關。

miRNA雖只有短短22個核苷酸，卻通過靶向序列的互補性調控大量的靶基因，發(fā)揮其生物學功能，因而挖掘miRNA的靶向基因是研究miRNA功能的重要手段[3-5,8]。目前，預測miRNA靶向基因的在線工具多種多樣，比較有名的有Targetscan、miRbase和pictar等[15]。然而這些軟件預測的靶向基因重復性較差，預測出來的靶向基因數(shù)量龐大，驗證效果并不是很理想，說明依據(jù)miRNA和基因結構互補性預測靶向基因的方式還需要很大的提高。目前，有不少miRNA數(shù)據(jù)庫可以檢索已被實驗證實的miRNA靶向基因，利用這些數(shù)據(jù)庫分析miRNA的功能更加簡單易行。本文通過檢索mitarBASE數(shù)據(jù)庫[7]獲得93個至少通過兩種方法驗證的胃癌相關miRNA(hsa-miR-106b、hsa-miR-1284、hsa-miR-138、hsa-miR-191、hsa-miR-20a、hsa-miR-23b、hsa-miR-543、hsa-miR-98)靶向基因，隨后應用DAVID 數(shù)據(jù)庫提供的基因功能注釋工具發(fā)現(xiàn)這些miRNA的表達涉及基因表達、DNA轉錄、細胞周期、細胞凋亡、細胞增生等調控，可能與miRNA腫瘤相關、p53及Akt等信號途徑激活有關，且這些調控功能及涉及的信號途徑大多已被文獻證實[3-5,8]。

綜上所述，胃癌組織中存在多量的miRNA表達異常，這些異常表達的miRNA涉及胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程。更進一步的實驗證實已發(fā)現(xiàn)的差異表達miRNA的作用方式及功能有助于闡明胃癌發(fā)生、進展的分子機制。

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Expression profile of microRNAs and bioinformatics analysis in human gastric cancer tissues

HUANG You-sheng, JIE Na, ZHANG Yi-Xin, LUO Zhi-fei, XUE Feng-gui
(DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofHainanMedicalUniversity,Haikou570102,China)

Purpose This experiment was designed to investigate the expression profile of miRNAs (microRNA) in human gastric cancer tissues. Methods The expression profiles of miRNAs were compared between 3 pairs of GC and adjacent normal tissues using an Exiqon miRNA array, following which quantitative PCR (qPCR) was employed to confirm the results of the miRNA array, and 10 miRNAs were selected. Bioinformatics was used to analyze the biological function of the differentially expressed miRNAs and its target genes in gastric cancer. Results Compared with adjacent mucosal tissues, 95 miRNAs were up-regulated and 16 miRNAs were down-regulated in GC(>2 folds，P<0.05). The qPCR results were consistent with microarray-based expression analysis (P=0.049). Furthermore, the online GO and pathway analysis revealed that miRNAs might involve RNA transcription, RNA metabolism, gene expression, gene silencing, and other biological functions in GC. Conclusion There is abnormal expression of miRNAs in gastric cancer, and the abnormal expression of miRNAs may be related to GC tumorigenesis.

gastric neoplasms; microRNA; differential expression; bioinformatics; microRNA array

國家自然科學基金(81260321)

海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科，海口 570102

黃幼生，男，副教授，副主任醫(yī)師。Tel: (0898)66723333，E-mail: hys768811@163.com

時間：2017-6-20 11:17 網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170620.1117.001.html

R 735.2

A

1001-7399(2017)06-0591-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.06.001

接受日期：2017-04-14