劉菲菲，李 雪，金木蘭

規(guī)范化特殊染色技術(shù)對(duì)肺真菌感染性疾病病理診斷的意義

劉菲菲，李 雪，金木蘭

目的 探討規(guī)范化特殊染色技術(shù)在肺真菌感染性疾病病理診斷中應(yīng)用的意義。方法 選取2011年9月～2016年3月北京朝陽(yáng)醫(yī)院最終病理診斷為肺真菌感染性疾病104例，行HE染色、HE染色聯(lián)合傳統(tǒng)手工特殊染色法染過(guò)碘酸雪夫氏染色(PAS)及六胺銀和HE染色聯(lián)合全自動(dòng)特殊染色法染PAS及六胺銀，將兩種特染技術(shù)規(guī)范化比較，鏡下觀察分析結(jié)果(均為初次染色結(jié)果，不包括復(fù)染結(jié)果)，以最終病理診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，與臨床初診結(jié)果比較。結(jié)果 肺真菌感染性疾病確診率和真菌分型率，從低到高順序一致，為臨床初步診斷(29.8%和19.2%)、HE染色法(32.7%和32.7%)、HE染色聯(lián)合傳統(tǒng)手工特殊染色法染PAS和六胺銀(90.4%和87.5%)、HE染色聯(lián)合全自動(dòng)特殊染色法染PAS和六胺銀(98.1%和94.2%)。這4種方法從兩方面比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.01)，第4種方法與前兩種比較方法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.01)，與第3種方法比較確診率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，分型率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但全自動(dòng)特殊染色法染PAS及六胺銀操作步驟更簡(jiǎn)單，化學(xué)試劑規(guī)范化，無(wú)人工和環(huán)境因素影響，耗時(shí)短，脫片和復(fù)染張數(shù)更少。結(jié)論 HE染色法聯(lián)合全自動(dòng)特殊染色法染PAS和六胺銀更加規(guī)范化，有助于提高肺真菌感染性疾病的確診率和真菌分型率。

肺疾病；全自動(dòng)特殊染色；規(guī)范化；真菌

隨著近年來(lái)各種高效廣譜抗生素、免疫抑制劑及抗惡性腫瘤藥物的廣泛使用，再加上器官移植、導(dǎo)管技術(shù)以及外科其他介入性治療的全面成熟與發(fā)展，導(dǎo)致因條件致病性真菌所引起的系統(tǒng)性真菌感染日益增多[1]。而肺部真菌感染占深部真菌感染的首位，50%～60%侵犯支氣管、肺[2]。但其癥狀、體征和影像學(xué)表現(xiàn)缺乏特異性，部分真菌感染病灶和炎癥、結(jié)核、腫瘤病灶難以鑒別，易誤診，從而導(dǎo)致治療方案的制定不夠精確[3]。因此，快速、準(zhǔn)確的診斷出真菌類型就顯得尤為重要。但其實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵在于規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化病理技術(shù)的支持。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院2011年9月～2016年3月經(jīng)最終病理診斷確診為肺真菌感染性疾病104例。男性59例，女性45例，年齡20～82歲，中位年齡52.2歲。標(biāo)本來(lái)源：支氣管黏膜活檢36例，肺穿刺活檢16例，外科手術(shù)肺活檢52例(開(kāi)胸肺活檢20例，電視胸腔鏡肺活檢32例)，患者具有基礎(chǔ)病者占81%，以高血壓、糖尿病為主占50%以上，其次惡性腫瘤約16%，肺結(jié)核約13%，還有其它少見(jiàn)基礎(chǔ)病冠心病、哮喘、鼻竇炎、氣管炎及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。治療后好轉(zhuǎn)94例(90.4%)，完全康復(fù)3例(2.9%)，死亡7例(6.7%)。

1.2 試劑及方法 (1)常規(guī)HE染色。(2)傳統(tǒng)手工PAS染色步驟：切片脫蠟至水，入0.5%高碘酸液氧化10 min，流水沖洗2 min，蒸餾水洗2次，雪夫試劑染10～20 min，充分水洗。蘇木精對(duì)比染色1 min，分化、返藍(lán)、水洗，脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固(試劑盒購(gòu)自珠海貝索公司)。(3)傳統(tǒng)手工六胺銀染色法：試劑(購(gòu)自北京益利公司)：①六胺銀貯備液：3%六次甲基四胺水溶液100 mL，5%硝酸銀水溶液5 mL。臨用時(shí)將兩種液體混合呈乳白色，瞬間透明。②六胺銀硼砂染色液：六胺銀貯備液25 mL，蒸餾水25 mL，5%硼砂水溶液2 mL[4]。步驟：①切片脫蠟至水，5%鉻酸水溶液氧化1 h，流水沖洗5 min。②浸入1%亞硫酸鈉水溶液1 min，除鉻酸，自來(lái)水沖洗5 min，蒸餾水充分洗滌。③置入六胺銀硼砂染色液內(nèi)60 ℃溫箱1 h，至切片呈黃褐色，鏡下觀察真菌呈黑褐色為止。蒸餾水洗3次。④0.2%氯化金水溶液調(diào)色5 min，蒸餾水洗。⑤2%硫代硫酸鈉水溶液3 min，自來(lái)水洗。⑥乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固[4]。(4)全自動(dòng)特殊染色法染PAS和六胺銀，均采用全自動(dòng)特殊染色儀(型號(hào)NexEs，美國(guó))，使用的PAS和六胺銀染色試劑盒(75人次)購(gòu)自羅氏診斷公司，PAS時(shí)長(zhǎng)39 min，六胺銀時(shí)長(zhǎng)120 min，兩種染色可同時(shí)進(jìn)行，時(shí)長(zhǎng)120 min。

1.3 分析方法 (1)病理技術(shù)規(guī)范化比較：通過(guò)比較傳統(tǒng)手工特殊染色法和全自動(dòng)特殊染色法在操作步驟的復(fù)雜程度、化學(xué)試劑的規(guī)范化、人工及環(huán)境因素影響、耗時(shí)、脫片和復(fù)染張數(shù)幾方面，顯示其兩者之間的差異。(2)三種組合由一名主治和一名副高級(jí)醫(yī)師進(jìn)行鏡下閱片并診斷：①HE染色。②HE染色聯(lián)合傳統(tǒng)手工特殊染色法染PAS和六胺銀。③HE染色聯(lián)合全自動(dòng)特殊染色法染PAS和六胺銀。結(jié)果再與臨床初診和最終病理診斷結(jié)果做比較，從肺真菌感染確診率、真菌分型率和真菌類型分布比例幾方面進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 傳統(tǒng)手工特殊染色法和全自動(dòng)特殊染色法規(guī)范化比較 傳統(tǒng)手工特殊染色和全自動(dòng)特殊染色相比，在操作步驟復(fù)雜程度(步驟數(shù)量和掌握難易度)、化學(xué)試劑規(guī)范化(是否為商品化試劑)，人工和環(huán)境因素影響(主要是人工控溫、控時(shí)、控制染色效果及外界溫、濕度等因素)幾方面后者優(yōu)于前者，并且后者染PAS和六胺銀所需時(shí)間更短，為120 min，脫片、復(fù)染張數(shù)也較少，分別為2張(表1)。

2.2 肺真菌感染確診率和真菌分型率比較 肺真菌感染確診率和真菌分型率從低至高順序一致，均為臨床初步診斷31例和20例(29.8%和19.2%)、HE染色法34例和34例(32.7%和32.7%)(圖1)、HE染色聯(lián)合傳統(tǒng)手工特殊染色法染PAS和六胺銀94例和91例(90.4%和87.5%)、HE染色聯(lián)合全自動(dòng)特殊染色法染PAS和六胺銀102例和98例(98.1%和94.2%)(圖2、3)。這4種方法從兩方面比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.01)，第4種方法與前兩種比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.01)，與第3種比較確診率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，分型率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

2.3 真菌類型分布 最終病理診斷為肺真菌感染且分出類型者共100例，前3位是曲霉菌60例(60.0%)、隱球菌21例(21.0%)、毛霉菌17例(17.0%)。順序相同者為HE染色聯(lián)合傳統(tǒng)手工特殊染色法染PAS和六胺銀91例，曲霉菌55例(60.4%)、隱球菌20例(22.0%)、毛霉菌14例(15.4%)，HE染色聯(lián)合全自動(dòng)特殊染色法染PAS和六胺銀98例，曲霉菌58例(59.2%)、隱球菌21例(21.4%)、毛霉菌17例(17.4%)。順序不同者為臨床初步診斷20例，曲霉菌13例(65.0%)、毛霉菌4例(20.0%)、隱球菌2例(10.0%)，HE染色法34例，曲霉菌27例(79.4%)、毛霉菌5例(14.7%)、隱球菌2例(5.9%)(表3)。

表1 兩種特殊染色技術(shù)的規(guī)范化比較

表2 104例肺真菌感染確診病例的4種診斷方法與最終病理診斷結(jié)果的比較[n(%)]

確診率：確診例數(shù)/總例數(shù)；真菌分型率：真菌分型例數(shù)/總例數(shù)

表3 104例肺真菌感染確診病例4種診斷方法在真菌分布上與最終病理診斷結(jié)果的比較[n(%)]

①A①B①C①D②A②B②C②D③A③B③C③D

圖1 真菌數(shù)量較多時(shí)，HE染色可以鑒別：A.曲霉菌；B.毛霉菌；C.隱球菌；D.肺孢子菌HE染色鑒別較為困難 圖2 真菌的全自動(dòng)特殊染色(曲霉菌、毛霉菌)：A.曲霉菌全自動(dòng)PAS染色；B.曲霉菌全自動(dòng)六胺銀染色；C.毛霉菌全自動(dòng)PAS染色；D.毛霉菌全自動(dòng)六胺銀染色；染色更明顯，易辨別真菌結(jié)構(gòu)，區(qū)分兩種類型 圖3 真菌的全自動(dòng)特殊染色(隱球菌、肺孢子菌)：A.隱球菌全自動(dòng)PAS染色；B.隱球菌全自動(dòng)六胺銀染色；C.肺孢子菌全自動(dòng)PAS染色；D.肺孢子菌全自動(dòng)六胺銀染色；染色更突出，較易發(fā)現(xiàn)真菌及辨別其結(jié)構(gòu)

3 討論

近年來(lái)，肺真菌感染性疾病日益增多，但臨床初診的誤診率很高，分析原因：(1)肺真菌感染缺乏特異性臨床表現(xiàn)。原發(fā)疾病的存在也會(huì)掩蓋真菌感染的臨床征象。(2)影像學(xué)上缺乏特異性。有些影像學(xué)表現(xiàn)酷似粟粒樣結(jié)核，有些真菌感染所致結(jié)節(jié)和腫塊影與腫瘤很難鑒別。(3)真菌感染病理改變主要為炎性浸潤(rùn)和肉芽腫性改變，與細(xì)菌性感染和結(jié)核無(wú)明顯區(qū)別，致使病灶無(wú)特征性。(4)臨床醫(yī)師對(duì)肺真菌感染認(rèn)識(shí)不足[5]。

肺活檢組織病理學(xué)檢查是確診侵襲性肺部真菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)[6-7]。參考侵襲性肺部真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則(草案)，對(duì)臨床侵襲性肺部真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]比較發(fā)現(xiàn)，只要具有組織病理學(xué)診斷即可確診。獲取方法有支氣管鏡黏膜/新生物活檢、經(jīng)支氣管肺活檢、CT引導(dǎo)下經(jīng)皮-胸腔針刺肺活檢、外科肺活檢[8]，實(shí)驗(yàn)選取病例均由以上方法收集。有些國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)多報(bào)道肺真菌感染主要為念珠菌肺炎[9-10]，原因是以痰或支氣管灌洗液真菌培養(yǎng)作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，而念珠菌為人類口腔的正常定值菌，20%～55%正常人的痰液中可以分離出念珠菌屬。在非免疫缺陷患者侵襲性肺部真菌感染卻很少見(jiàn)，發(fā)病率為0.2%～4.5%[10]，導(dǎo)致誤診。本實(shí)驗(yàn)以肺組織病理為標(biāo)準(zhǔn)，與國(guó)外報(bào)道[11-12]的診斷標(biāo)準(zhǔn)和肺部真菌感染曲霉菌占首位相一致。與國(guó)內(nèi)近期文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果：肺真菌感染以曲霉菌占第1位，其次為隱球菌和毛霉菌，念珠菌肺炎少見(jiàn)[13]也相符合。上述文獻(xiàn)均支持病理學(xué)檢查是確診該病的金標(biāo)準(zhǔn)。

對(duì)非腫瘤性肺疾病，按通常診斷順序與原則，首先觀察HE染色切片，在此基礎(chǔ)上來(lái)決定是否需做特殊染色，六胺銀及PAS染色常用來(lái)顯示多數(shù)真菌[8]。光鏡下，HE染色曲霉菌菌絲呈淡紫色，菌絲壁淡紫藍(lán)色。也可用PAS染色，把菌絲染成品紅色，理想的方法是用六胺銀染色，可把菌絲染成棕黑色，少量的菌絲也易發(fā)現(xiàn)。HE染色也著染毛霉菌，PAS染色染色不佳，六胺銀染色能很清晰地顯示菌絲。在切片上曲霉菌和毛霉菌有時(shí)不易鑒別，特別是當(dāng)毛霉菌的菌絲較狹窄，而菌絲里見(jiàn)到一些橫隔的情況。一般來(lái)說(shuō)，曲霉菌菌絲具有二叉型分支，直徑較小，菌絲壁平行，有橫隔，用六胺銀法染色也較深[14]。隱球菌菌體HE染色呈淡紅色或不著色，菌體外有透明區(qū)。常規(guī)HE染色下隱球菌易漏診，PAS染色、GMS染色可提高陽(yáng)性率[15]。肺孢子菌的HE染色見(jiàn)包囊壁不著色，呈透明的暈圈狀，鑒別較為困難，一般加以六胺銀染色，肺孢子菌包囊壁棕到黑色，結(jié)構(gòu)顯示清楚。而白色念珠菌HE染色其芽生孢子和假菌絲呈淡藍(lán)色，兩者同時(shí)見(jiàn)到才可以診斷。特別是急性期或陳舊性病灶更難兼?zhèn)?，需多方法?lián)合診斷[14]。所以真菌在組織中用HE染色一般著色不佳，不留心觀察易漏診，因此需用特殊染色法顯示，最常用的是PAS和六胺銀[16]。只有當(dāng)真菌數(shù)量多到一定程度時(shí)HE染色法才可以鑒別，所以漏診幾率很大，六胺銀和PAS特殊染色作為輔助診斷必不可少。

兩種實(shí)驗(yàn)方法結(jié)果與最終病理診斷結(jié)果真菌類型分布順序一致，具有參考意義。從技術(shù)規(guī)范化比較可以觀察到全自動(dòng)特殊染色法染PAS和六胺銀明顯優(yōu)于傳統(tǒng)手工特殊染色法染PAS和六胺銀。因?yàn)楹笳卟僮鞑襟E復(fù)雜，對(duì)于操作者的技術(shù)要求高，化學(xué)試劑如六胺銀染色部分還需人工配制，染色過(guò)程暴露于外界，染色效果需鏡下觀察、控制。結(jié)果受人工和環(huán)境因素影響，脫片和復(fù)染數(shù)大于前者，分別超出2例和8例，易造成誤差或失誤，缺乏嚴(yán)謹(jǐn)性。且前者脫片的2例，同于后者，說(shuō)明與組織本身有關(guān)，與實(shí)驗(yàn)方法無(wú)關(guān)，側(cè)面驗(yàn)證了前者結(jié)果的精準(zhǔn)性。另外，染色效果不佳也是后者復(fù)染數(shù)多的主要原因(PAS 1張、六胺銀5張)。在傳統(tǒng)手工特殊染色法中，PAS染色步驟較簡(jiǎn)單，影響因素較少，實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定[17]，但染色的敏感性稍不如六胺銀染色。從染色原理分析：可能是六胺銀染色中的鉻酸比PAS的過(guò)碘酸有更強(qiáng)的氧化能力，暴露出更多的醛基[18]。所以使得它更活躍而不易操作，如果溫度過(guò)高或者染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都會(huì)使結(jié)締組織著色太深，影響染色質(zhì)量，影響結(jié)果的觀察[17]，需每隔10 min鏡下觀察染色情況，因此耗時(shí)更長(zhǎng)而不精準(zhǔn)，特別是染色張數(shù)較多時(shí)。同樣傳統(tǒng)手工PAS染色耗時(shí)差異也較大，較高溫度時(shí)為10 min，較低溫度(冬季)為20 min左右。這些都是導(dǎo)致后者用時(shí)更長(zhǎng)的原因，如有復(fù)染更延遲了出結(jié)果的時(shí)間。

特殊染色技術(shù)在相當(dāng)一段時(shí)間對(duì)病理常規(guī)染色是一種輔助，在幫助病理醫(yī)師完成病理診斷方面發(fā)揮著巨大作用[19]。但在化學(xué)試劑的購(gòu)置、貯存、保管、使用、等方面存在許多問(wèn)題。同時(shí)自行配置各類染色試劑，還受技術(shù)人員經(jīng)驗(yàn)、技巧、能力及病理科規(guī)模，試劑使用周期等因素的影響，差別較大。而商品化試劑的使用會(huì)使特殊染色技術(shù)走向標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化，使操作變得簡(jiǎn)單、快捷、精準(zhǔn)。全自動(dòng)特殊染色法染PAS和六胺銀使用了商品化試劑盒，不僅保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性，更加具有規(guī)范化和穩(wěn)定性。再聯(lián)合HE染色，對(duì)于肺真菌感染性疾病，無(wú)論從確診率還是分型率，均比傳統(tǒng)手工特殊染色法高，分別高出7.7%(8例)和6.7%(7例)。因此對(duì)該病的診斷是有意義的，有助于提高真菌感染的確診率和分型率。

隨著病理技術(shù)的發(fā)展，HE染色技術(shù)引用了全自動(dòng)染色封片工作站，免疫組化染色也早已運(yùn)用了全自動(dòng)免疫組化染色儀，這些都為病理科實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制提供便捷而可靠的工具，為臨床病理診斷提供有力依據(jù)，對(duì)病理實(shí)驗(yàn)室的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展接軌也起到重要作用。所以全自動(dòng)特殊染色系統(tǒng)的運(yùn)用也會(huì)是病理特殊染色技術(shù)發(fā)展的必然趨勢(shì)。但由于試劑成本較高，對(duì)比國(guó)內(nèi)組織化學(xué)特殊染色病理收費(fèi)低的情況，阻礙了其推廣和發(fā)展。而對(duì)于病理診斷它實(shí)現(xiàn)了傳統(tǒng)手工特殊染色法向標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的轉(zhuǎn)型，提高了病理報(bào)告的精準(zhǔn)性，縮短了發(fā)報(bào)告的時(shí)間，為臨床快速制定有效的治療方案給予了極大的幫助，值得提倡。

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Significance of standardized special staining technology for pathological diagnosis of pulmonary fungal infectious diseases

LIU Fei-fei, LI Xue, JIN Mu-lan
(DepartmentofPathology,BeijingChaoyangHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100020,China)

Purpose To explore the significance of the application of standardized special staining technique in pathologic diagnosis of pulmonary fungal infectious diseases. Methods Final pathologic diagnosis of 104 cases pulmonary fungus infection disease in Beijing Chaoyang hospital from September 2011 to March 2016 were selected; HE staining only, HE staining combined with the traditional manual special staining method PAS and hexamine silver, and HE staining combined with automatic special staining PAS and hexamine-silver were used and compared. The two kinds of special staining technology were compared; the microscopic observation, analysis results (all the first staining results, not including the results of complex staining), the results on the basis of final pathologic diagnosis were also compared with the clinical preliminary diagnosis. Results Lung fungal infectious disease diagnosis rate and fungal classification rate, from low to high order consistence, showed that for the primary clinical diagnosis (29.8% and 19.2%), HE staining (32.7% and 32.7%), HE staining combined with traditional manual special staining method PAS and hexamine silver (90.4% and 87.5%), and HE staining combined with auto-matic special staining PAS and hexamine-silver (98.1% and 94.2%). The four methods were statistically significant on two aspects (P<0.01,P<0.01); the fourth method was significantly different from the first two (P<0.01,P<0.01). The fourth method was significantly different from the third kind of diagnosis rate (P<0.05), typing rate was no significant difference (P>0.05). But automatic special dyeing method of PAS and hexamine silver steps were more simple, with standardized chemical reagents, no artificial and environmental factors, short time-consuming, and less number of dropping-off and restaining of the section. Conclusion HE staining and its combination with automatic special staining of PAS and hexamine silver are much more standardized, and help to improve the diagnosis of pulmonary fungal infectious diseases and fungal classification rate.

lung diseases; automatic special staining; standardization; fungi

首都醫(yī)科大學(xué)附屬朝陽(yáng)醫(yī)院病理科，北京 100020

劉菲菲，女，技師。E-mail: suiyinglff0123@126.com 金木蘭，女，教授，博士生導(dǎo)師，通訊作者。Tel: (010)85231355，E-mail: kinmokuran@163.com

時(shí)間：2017-6-20 11:18 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170620.1117.013.html

R 563；R 519

A

1001-7399(2017)06-0653-06

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.06.013

接受日期：2017-03-23