陳繼梅，胡婭嫻，戴陽

·論著·

實時熒光定量PCR法檢測乙型肝炎病毒YMDD變異的臨床意義

陳繼梅1，胡婭嫻1，戴陽2

目的：探討拉米夫定治療慢性乙型肝炎期間發(fā)生乙型肝炎病毒HBV YMDD變異情況及其與病毒載量、肝功能的關(guān)系。方法:對慢乙肝患者分別檢測血清HBV YMDD變異、HBV DNA 載量及肝功能，并對檢驗結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果:3年間共發(fā)生HBV YMDD變異共59例，其中HBV YIDD變異29例(49.15%)，HBV YVDD變異41(69.49%)例，2者共同變異11(18.64%)例，YIDD與YVDD變異比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.057，P<0.05)。發(fā)生變異的慢乙肝患者HBV DNA陽性率為59/59(100%)，同期對照未發(fā)生變異HBV DNA陽性率為40/150(26.67%)，2組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=91.34，P<0.05)。發(fā)生不同變異各組與未發(fā)生變異組病毒載量比較，差異有顯著性(組間F=11.175，P<0.05)，而變異組之間HBV DNA之間不存在顯著性差異，肝功能僅TBIL結(jié)果單獨YIDD變異組與未變異組有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論：本地區(qū)HBV YMDD變異以HBV YVDD為主；變異各組HBV DNA陽性率及HBV載量都顯著高于未變異組，表明YMDD變異株HBV DNA復(fù)制活躍。肝功能除了TBIL，變異與否與肝功能水平高低無關(guān)，提示不同的HBV YMDD突變模式可能與患者病情無關(guān)。

乙型肝炎，慢性； 拉米夫定； HBV YMDD 變異； 實時熒光定量PCR

乙型肝炎病毒(hepatitis b virus,HBV)的基因復(fù)制是利用自身的RNA依賴DNA多聚酶完成的逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制，拉米夫定正是利用此特點做為治療手段，以乙肝病毒DNA多聚酶作為治療靶點,來達(dá)到抑制病毒復(fù)制的目的，是HBV復(fù)制強(qiáng)有力的抑制劑。拉米夫定治療慢乙肝有明確的療效,但有文獻(xiàn)報道長期服用會導(dǎo)致HBV DNA多聚酶活性區(qū)核苷酸序列的變異，即酪氨酸、蛋氨酸、天門冬氨酸、天門冬氨酸區(qū)域變異(YMDD變異)[1]。YMDD變異的發(fā)生主要有2種形式,一種為YIDD變異,另一種為YVDD變異。發(fā)生變異后,拉米夫定失去結(jié)合靶點,嚴(yán)重影響治療效果,檢測YMDD基序變異對及時調(diào)整治療方案、提高療效有重要的指導(dǎo)意義。本資料采用實時定量PCR技術(shù)檢測慢乙肝患者拉米夫定用藥期間HBV YMDD變異發(fā)生情況,使用兩條特異性探針同時對YIDD和YVDD變異進(jìn)行檢測。筆者研究了我院近3年期發(fā)生YMDD變異慢乙肝患者的59例并對其HBV DNA載量、及肝功能進(jìn)行對比研究，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 資料 全部病例均為我院2013年4月-2016年4月門診及住院使用拉米夫定治療的慢性乙型肝炎患者, 診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《2010年慢性乙型肝炎防治指南》(2010年版)[2]。經(jīng)過檢測，3年間我院共檢出YMDD變異慢乙肝患者共59例，其中男39例，平均年齡(40.24±13.68)歲；女10例，平均年齡(45.8±8.38)歲。同時選取同期使用拉米夫定治療未發(fā)生YMDD變異的慢乙肝患者150例做為對照，其中男117例，平均年齡(41.74±11.58)歲；女33例，平均年齡(48.18±14.34)歲。

1．2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 所有患者均空腹采集外周靜脈血于紅色真空采血管中，同時抽取標(biāo)本各3 mL 2管，其中1管做肝功能，另1管做HBV YMDD及HBV病毒量檢測，及時分離血清并置-20℃保存，1周內(nèi)測定。

1.2.2 血清HBV載量及YMDD檢測 儀器為美國SLAN Real Time PCR Detection System 7300熒光定量檢測儀，試劑購自艾康生物有限公司，HBV載量及YMDD檢測嚴(yán)格按照說明書操作，同時設(shè)置HBV臨界陽性對照、HBV強(qiáng)陽性對照、陰性對照及4個標(biāo)準(zhǔn)品，按常規(guī)提取HBV DNA，每例患者提取物分別加入A,B,C 3管，A管加入HBV定量反應(yīng)混合液，B管加入YVDD反應(yīng)混合液，C管加入YIDD反應(yīng)混合液。檢測熒光選擇：定量及YMDD檢測(FAM)、內(nèi)標(biāo)(VIC)。擴(kuò)增程序如下:步驟1：1次，溫度95℃，時間3 min；步驟2：分別是(1)溫度94℃，時間15 s。(2)溫度62℃，時間30 s，循環(huán)40次。HBV病毒載量(A管)以HBVDNA≥1×103copirs/mL為陽性結(jié)果。YMDD變異結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下。見表1。

表1 乙型肝炎病毒基因YMDD突變結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

1．2．3 肝功能生化指標(biāo)檢測 儀器為日立7180全自動生化分析儀，試劑購自溫州東甌津瑪生物科技有限公司；質(zhì)控血清購自英國朗道公司。以血清總膽紅素(TBIL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)，膽堿脂酶(CHE)指標(biāo)作為觀察指標(biāo)。TBIL采用釩酸鹽氧化法；ALT,AST,CHE均采用雙試劑速率法，室內(nèi)質(zhì)控全部在控。

2 結(jié)果

2.1 HBV YMDD變異 我院3年間共發(fā)生HBV YMDD共59例，其中YIDD變異29例(49.15%)，單獨YIDD變異18例(30.51%)，YVDD變異41例(69.49%)，單獨YVDD變異30例(50.85%)。YIDD+YVDD 2者共同變異11(18.64%)例, YIDD與YVDD變異經(jīng)卡方檢測χ2=5.057，P<0.05，2者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。顯示本地區(qū)慢乙肝患者HBV YMDD變異以YVDD為主要變異株。同期做YMDD監(jiān)測的未發(fā)生YMDD變異的慢乙肝患者150人做為對照組，其HBV DNA陽性率為40/150(26.67%)，發(fā)生YMDD變異的慢乙肝患者HBV DNA陽性率為59/59(100%)，經(jīng)卡方檢測χ2=91.34，P<0.05。2者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，即發(fā)生YMDD變異組HBV DNA陽性率遠(yuǎn)高于未發(fā)生變異組。

2.2 發(fā)生變異組與未發(fā)生變異組各項檢驗結(jié)果比較 根據(jù)變異不同分為單獨YIDD、單獨YVDD、共同變異、未發(fā)生變異等4組，分別統(tǒng)計各組HBVDNA載量及肝功能水平。見表2。

本資料結(jié)果顯示，發(fā)生變異各組與未發(fā)生變異組病毒載量(HBVDNA)比較，組間F=11.175，P<0.05，存在顯著性差異。單獨YIDD變異、單獨YVDD變異、共同變異與未發(fā)生變異組比較F值分別為0.356，0.303和0.427，P均<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而變異組之間HBVDNA載量比較皆不存在顯著性差異。TBIL水平單獨YIDD變異與其他各組比較F值分別為13.605，18.345，13.605，P均<0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異外，其他肝功能結(jié)果與是否變異不存在顯著性差異，提示不同的HBV YMDD基因突變模式可能與患者肝功能水平高低無關(guān)。

表2 變異組與未發(fā)生變異組肝功能及病毒載量比較

注：*單獨YIDD變異、單獨YVDD變異、共同變異與未發(fā)生變異組比較F值分別為0.356、0.303和0.427，P均<0.05，▲TBIL水平單獨YIDD變異與其他各組比較F值分別為13.605，18.345，13.605，P均<0.05。

3 討論

我國是乙型病毒性肝炎的大國,全國約有1.3億慢性HBV攜帶者,其中約3千萬患者存在病毒復(fù)制或肝臟炎癥，有進(jìn)一步發(fā)展為慢性肝病、肝硬化和肝癌的風(fēng)險，國際共識認(rèn)為抗病毒治療是病原治療，是控制和預(yù)防慢性乙肝病毒感染根本治療方法。以往的治療主要依賴干擾素,缺點是治療效率低,副作用嚴(yán)重。核苷類似物藥物主要針對乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和乙肝病毒復(fù)制，其中具有代表性的、療效較好的藥物主要是拉米夫定,它的全稱為2'3'-雙脫氧-3'硫代胞嘧啶核苷，又稱3-TC。拉米夫定抗病毒的作用機(jī)制主要為:在細(xì)胞內(nèi)磷酸化，形成3TC-TP,它是拉米夫定的活性形式，與脫氧胞嘧啶競爭進(jìn)入合成的DNA鏈中,阻斷病毒DNA的合成；同時具有抑制HBV DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄的活性,抑制HBV復(fù)制，降低HBV DNA載量。對大多數(shù)乙型肝炎患者的血清HBV DNA檢測結(jié)果表明，拉米夫定能迅速抑制HBV復(fù)制，其抑制作用持續(xù)于整個治療過程，同時使血清氨基轉(zhuǎn)移酶降至正常[3]。拉米夫定只能抑制HBV復(fù)制，并不能真正的清除乙肝病毒，同時由于受感染肝細(xì)胞內(nèi)共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA的)存在和病毒與肝細(xì)胞的基因組整合，乙肝病毒感染的徹底根除目前是不可行的[3]，一般須長期用藥才能達(dá)到臨床效果，隨著治療時間的延長，部份慢乙肝患者會發(fā)生耐藥，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),此耐藥現(xiàn)象同HBV YMDD位點發(fā)生基因變異相關(guān)[4],導(dǎo)致其編碼的HBV多聚酶的YMDD功能區(qū)發(fā)生突變,稱為YMDD變異。最常見的YMDD變異是M(酪氨酸)被V(纈氨酸)或I(異亮氨酸)取代，即為YVDD或YIDD變異，這兩種變異均導(dǎo)致拉米夫定與HBV DNA聚合酶的親合力下降或消失，失去抑制HBV復(fù)制的作用，HBV變異后對乙肝診斷、治療、預(yù)防都產(chǎn)生重大影響[5]。

本文采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)對慢性乙型肝炎患者在使用拉米夫定期間YMDD變異進(jìn)行了監(jiān)測，同時對患者血清HBV DNA水平及肝功能水平進(jìn)行了檢測。檢測結(jié)果顯示，我院3年間共發(fā)生YMDD變異59例，其中YIDD變異29例(49.15%)，單獨YIDD變異18例(30.51%)，YVDD變異41例(69.49%)，單獨YVDD變異30例(50.85%)。YIDD+YVDD 2者共同變異11(18.64%)例,YIDD與YVDD變異經(jīng)卡方檢測，2者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。顯示本地區(qū)慢乙肝患者HBV YMDD變異以YVDD為主要變異株，與柳文菊[6]、方立慶[1]檢測結(jié)果基本一致，與方莉的檢測結(jié)果[7]不同，對于各地檢測結(jié)果的不同,方立慶[7]認(rèn)為HBV基因型/亞型的分布具有明確的地理區(qū)域性，不同地區(qū)流行的HBV基因型/亞型種類的差異可能就導(dǎo)致了YMDD變異類型具有差異性，這也可能是蕪湖地區(qū)HBV YMDD變異優(yōu)勢株與部份地區(qū)相似與其他地區(qū)不同的原因。發(fā)生YMDD變異的慢乙肝患者HBVDNA陽性率59/59(100%)，同期做YMDD監(jiān)測的未發(fā)生YMDD變異的慢乙肝患者150人，其HBVDNA陽性率為40/150(26.67%)，2者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，發(fā)生YMDD變異組HBVDNA陽性率遠(yuǎn)高于未發(fā)生變異組。發(fā)生變異各組與未發(fā)生變異組病毒載量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，單獨YIDD變異、單獨YVDD變異、共同變異與未發(fā)生變異組比較皆存在顯著性差異，變異各組HBV載量都顯著高于未變異組[8](F值分別為0.356，0.303和0.427，P均為0.000)；變異組HBVDNA之間不存在顯著性差異，即變異組之間HBVDNA載量無統(tǒng)計學(xué)差異，表明YMDD變異株HBV DNA復(fù)制活躍[7]，變異的產(chǎn)生導(dǎo)致了HBV DNA病毒復(fù)制的再次活躍，從而導(dǎo)致機(jī)體對抗病毒藥物的耐藥、肝炎癥狀復(fù)發(fā)等后果[9]。肝功能除了單獨HBV YIDD變異TBIL有統(tǒng)計學(xué)差異外，其他肝功能檢測差異無統(tǒng)計學(xué)意義。肝功能除了TBIL，變異與否與肝功能水平高低無關(guān)，顯示YMDD變異株導(dǎo)致肝功能損傷的相關(guān)性較弱，提示不同的HBV YMDD基因突變模式可能與患者病情無關(guān)[10]。

本資料結(jié)果顯示，YMDD變異不但使慢乙肝患者病毒陽性率明顯提高,患者100%出現(xiàn)HBV DNA陽轉(zhuǎn)，而且變異組病毒載量水平顯著高于未變異組，YMDD變異株HBV DNA復(fù)制活躍,這部分患者則可能不適用于拉米夫定繼續(xù)治療[11]。因些，在拉米夫定治療期間應(yīng)嚴(yán)密監(jiān)測YMDD變異及HBV病毒量及肝功能，以便及時發(fā)現(xiàn)YMDD變異及病情嚴(yán)重變化，對出現(xiàn)變異的患者及時調(diào)整用藥，從而達(dá)到最佳的治療效果。

[1] 方立慶,張振華,梁佳佳,等.拉米夫定治療慢性乙型肝炎發(fā)生病毒學(xué)反彈患者YMDD變異分析[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2012,47(10):1265-1267.

[2] 中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會,中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會.慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[J].中華肝臟病雜志,2011,19(1):13-24.

[3] CHO SW,CHO YJ,CHEONG JY，et al. Add on lamivudine to adefovir monotherapy for the treatment of lamivudine-resistant chronic hepatitis B patients[J].Korean J Gastroenterol,2010，56(2):83-89.

[4] 許茵.乙型肝炎病毒YMDD的檢測與分析[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生雜志，2009,25(10)：1557-1558.

[5] 胡志東.乙型肝炎病毒變異的臨床研究進(jìn)展[J].國際病毒學(xué)雜志,2006,13(1):29-32.

[6] 柳文菊,江培學(xué),朱汝祥.3種檢測乙型肝炎病毒YMDD變異方法的比較[J].檢驗醫(yī)學(xué),2012,27(7):557-560.

[7] 方莉,雷嬌,趙維皎,等.乙型肝炎病毒YMDD變異株的檢測及其臨床意義[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2015,36(15):2197-2198,2201.

[8] 陳發(fā)林,郭永建,伍嚴(yán)安,等.拉米夫定治療慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒YMDD變異的研究[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2006,11(29):980-983.

[9] 王瑜敏,陶志華,朱燕英,等.慢性乙肝YMDD變異患者肝纖維化指標(biāo)、血清標(biāo)志物的檢測及意義[J].臨床肝膽病雜志,2007,23(3):174-175.

[10] 陳星,秦紅波,黃鈺君.拉米夫定耐藥的HBV反轉(zhuǎn)錄酶區(qū)基因突變模式分析[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床,2014,11(2):157-159,162.

[11] 肖曉光,張鳳華,王晶.應(yīng)用實時熒光PCR方法檢測乙型肝炎病毒基因YMDD變異[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2007,29(1):70-73.

Clinical significance of YMDD mutations of HBV detected by quantitative real-time PCR

CHEN Ji-mei,HU Ya-xian,DAI Yang.

(Wuhu Third People's Hospital, Anhui 241000, China)

Objective:To explore the status of YMDD mutations of HBV during lamivudine antiviral therapy of hepatitis B and its associations with HBV viral load and liver function.Methods:Serum HBV YMDD mutations, HBV viral load and liver functions were detected and analyzed from chronic hepatitis B patients visiting Wuhu Third People's Hospital from April 2013 to April 2016.Results:Totally 59 cases of HBV YMDD mutations occurred during the 3-year investigation, which included 29 YIDD mutations (49.15%),41 YVDD mutations (69.49%) and 11 YIDD/YVDD dual mutations (18.64%). The difference between YIDD mutations and YVDD mutations was significant (X2=5.057，P<0.05).The positive rate of HBV DNA of hepatitis B patients with YMDD mutations was 100% (59/59), whereas for those in controls without YMDD mutations, the positive rate of HBV DNA was 26.67% (40/150). There was significant difference between the 2 groups (X2=91.34，P<0.05). In comparison of HBV viral loads between the group without mutations and the groups with diverse mutations, the difference was significant (inter-groupsF=11.175,P<0.005), and no difference were found among groups with mutations. In addition, among parameters of liver function, only TBIL results exhibited difference between YIDD mutation group and negative control group. Conclusion:In Wuhu city, the majority of HBV YMDD mutations are YVDD ones.HBV DNA positivity and HBV viral load in mutation groups are significantly higher than in the negative control group, which indicates that active replication of HBV DNA is present in HBV variants with YMDD mutations. Except for TBIL, other liver function parameters have no associations with YMDD mutations, which hints that different modes of HBV YMDD mutations are independent of progression of chronic hepatitis B.

Hepatitis B,chronic; Lamivudine; HBV YMDD mutation; Real-time PCR

安徽省蕪湖市第三人民醫(yī)院 1.檢驗科;2.傳染科, 241000

陳繼梅(1970-)，女，副主任技師，大學(xué)。

10.14126/j.cnki.1008-7044.2017.04.007

R 512.62

A

1008-7044(2017)04-0398-04

2017-03-17)