安娜+楊淵+沈蘭琳+朱卓+郭馨杰+薛智權(quán)

摘 要：從深圳灣紅樹(shù)林根際土壤和海水樣品中篩選到一株富油酵母，對(duì)其基本形態(tài)、油脂積累情況和生物學(xué)地位進(jìn)行研究，旨在為開(kāi)發(fā)其應(yīng)用潛力提供理論指導(dǎo)。利用松花粉垂釣法篩選得到富油酵母，用顯微鏡觀察其基本形態(tài)，采用尼羅紅染色法觀察油脂積累情況，擴(kuò)增18S rRNA序列對(duì)該富油酵母進(jìn)行分子鑒定，并用GC-MS分析菌株的油脂含量和組成情況。結(jié)果顯示，篩選得到一株富油酵母菌，在低氮培養(yǎng)基中72 h油脂積累即達(dá)到平臺(tái)期。18S rRNA序列鑒定其屬于Cyberlindnerasaturnus sp.。脂肪酸含量達(dá)到細(xì)胞干質(zhì)量的55%，主要成分為C15∶0、C16∶0和C17∶0的飽和脂肪酸，含量達(dá)到總脂肪酸的90%以上。該酵母菌適合用于生物柴油的生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：紅樹(shù)林；富油酵母；篩選；18S rRNA；GC-MS

中圖分類(lèi)號(hào)：TE667 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.07.002

Screening and Identification of Oil-rich Yeast from Mangrove Rhizosphere of Shenzhen Bay

AN Na， YANG Yuan， SHEN Lanlin， ZHU Zhuo， GUO Xinjie， XUE Zhiquan

（College of Life Science， Shanxi Agricultural University， Jinzhong， Shanxi 080301， China）

Abstract：Anoil-rich yeast strain was screened from mangrove rhizosphere soil and seawater samples of Shenzhen bay， and its morphology， oil accumulation and taxonomy were studied. The pine pollen fishing method was used for screening and its morphology was observed by microscope， Nile red staining was used to observe the oil content， the molecular identification of the oil rich yeast was conducted by enhancing 18S rRNA gene sequence， and GC-MS was used to analyze the oil content and composition. The result showed that the strains of the yeast identified by 18S rRNA gene belonged to Cyberlindnerasaturnus sp.， and the strains had the genus of rich oil. It is concluded that the yeast is suitable to producing biological diesel oil.

Key words：mangrove； oil-rich yeast； screening； 18S rRNA； GC-MS

近年來(lái)，隨著石油能源枯竭、全球資源短缺及環(huán)境污染等問(wèn)題的日益嚴(yán)重，生物柴油因其原料的可再生性、易生物降解、清潔無(wú)污染等特性，被認(rèn)為是傳統(tǒng)石油的最佳代替品之一，已成為國(guó)際研究熱點(diǎn)[1-3]。

深圳紅樹(shù)林位于陸地和海洋環(huán)境的動(dòng)態(tài)交界面，為熱帶亞熱帶海洋潮間帶獨(dú)特的生態(tài)系統(tǒng)。因周期性的海水侵襲、河口有機(jī)質(zhì)的沉積和落葉的腐敗作用使其中富含有機(jī)質(zhì)和腐殖質(zhì)，并形成了特殊的生態(tài)環(huán)境，其中生活著眾多生物，也蘊(yùn)含了極其豐富的微生物資源[4]。對(duì)鹽脅迫和富營(yíng)養(yǎng)化環(huán)境的長(zhǎng)期適應(yīng)，使得紅樹(shù)林微生物在形成特殊群落的同時(shí)，也可產(chǎn)生大量活性代謝產(chǎn)物。紅樹(shù)林土壤中的微生物不但在環(huán)境修復(fù)和城市污水處理中扮演著重要的角色[5-6]，同時(shí)也是多種重要工業(yè)和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中間產(chǎn)物的生產(chǎn)者[7]。其中的多種微生物能夠合成和積累大量的多不飽和脂肪酸和中長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸，在食品、保健品和生物新能源等行業(yè)中具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值[8-10]。

本研究從深圳紅樹(shù)林根際土壤和海水樣品中篩選到一株富油酵母菌株，研究了其基本形態(tài)、油脂積累情況，并用18S rRNA基因序列對(duì)其進(jìn)行鑒定，可為菌種工業(yè)化高產(chǎn)脂肪酸提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：葡萄糖30 g·L-1，胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，海水晶15 g·L-1，蒸餾水配制。固體培養(yǎng)基加20 g·L-1的瓊脂。

低氮培養(yǎng)基：葡萄糖30 g·L-1，胰蛋白胨1.5 g·L-1，酵母提取物1 g·L-1，海水晶1.5 g·L-1，KH2PO4 0.25 g·L-1，蒸餾水配制。

1.2 方 法

1.2.1 樣品采集與分離 從深圳灣紅樹(shù)林保護(hù)區(qū)采集紅樹(shù)林根際土壤和海水樣品，放入滅菌的密封離心管中帶回實(shí)驗(yàn)室，立即進(jìn)行菌株分離。分離采用松花粉垂釣法：在無(wú)菌平板中加入 2 mL 海水樣品和 10 mL 海水培養(yǎng)基，并加入少量松花粉（95 ℃烘箱處理1 h）作為誘餌，在室溫條件下培養(yǎng)1周。分別在接種土壤和海水的培養(yǎng)基中挑選菌種轉(zhuǎn)接到新鮮的海水（含有松花粉、0.075%鏈霉素和0.05%氨芐西林）平板中進(jìn)行數(shù)字標(biāo)記培養(yǎng)。培養(yǎng)1周后，取適量培養(yǎng)液涂布到含有鏈霉素和氨芐西林的固體培養(yǎng)基中，室溫培養(yǎng)1周后，取單克隆涂布到新鮮的固體培養(yǎng)基中，重復(fù)純化 2～3 次。

1.2.2 菌株鑒定 采用PCR法擴(kuò)增18S rDNA序列的方法進(jìn)行菌種鑒定?？偦蚪M的提取采用酵母基因組DNA 提取試劑盒（Solarbio，北京）。18S rDNA基因的 PCR （Polymerase chain reaction）擴(kuò)增使用的特異性引物為：18SF，5-AACCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3；18SR，5-CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT -3。PCR反應(yīng)用20 μL 反應(yīng)體系，其中菌液加2 μL，引物含量分別為1 μL，2*Mix 10 μL，ddH2O 6 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 4 min； 94 ℃45 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳后，切膠分離純化。挑取陽(yáng)性克隆送到百邁克生物科技有限公司（北京）進(jìn)行測(cè)序。

將測(cè)序得到的18S rDNA序列在GenBank中進(jìn)行比對(duì)，確定該酵母菌的分子學(xué)分類(lèi)。

1.2.3 富油酵母菌的形態(tài)及生活史觀察 觀察富油酵母菌的生活形態(tài)時(shí)，直接取30 μL富油酵母菌培養(yǎng)液，用95%乙醇稀釋的美藍(lán)溶液79 μL染色5 min。染色完成后，取一滴滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，風(fēng)干后在 Olympus顯微鏡下觀察，目鏡10×，物鏡 40×。觀察時(shí)可先找到單個(gè)的酵母菌。油鏡（100×）下可清晰觀察到菌體形態(tài)。

定期取不同培養(yǎng)時(shí)期（6，12，24，36，48，60，

72，84，96 h）的酵母菌培養(yǎng)液在顯微鏡下觀察酵母菌生長(zhǎng)變化及其生活史的一般過(guò)程。

1.2.4 尼羅紅（Nile Red）熒光染色 尼羅紅是一類(lèi)苯吩啞嗪酮類(lèi)化合物，能夠與脂類(lèi)物質(zhì)結(jié)合并在≤570 nm 波長(zhǎng)的激發(fā)光下發(fā)出熒光，快速地將類(lèi)脂類(lèi)物質(zhì)與其它儲(chǔ)藏物分離開(kāi)來(lái)。尼羅紅是一類(lèi)脂溶性染料，難溶于水，需要借助丙酮、乙醇等有機(jī)溶劑，故尼羅紅染色液配制成 0.01% （質(zhì)量體積比）丙酮溶液。

取100 μL不同生長(zhǎng)時(shí)間的酵母菌培養(yǎng)液于96孔板中，加入10 μL尼羅紅染色液于暗處染色20 min，然后用藍(lán)光激發(fā)，在暗場(chǎng)下觀察，以發(fā)出紅色熒光為陽(yáng)性。

1.2.5 細(xì)胞油脂的提取與脂肪酸甲酯的制備 收集200 mL處于平臺(tái)期的菌體培養(yǎng)液，6 000 r·min-1離心10 min收集菌體，冷凍干燥后用于油脂提取。菌體油脂的提取與轉(zhuǎn)酯化采用一步法[6]：稱(chēng)取200 mg冷凍干燥后的菌體，加入2 mL 4%硫酸甲醇溶液，振蕩混勻20 s，在80 ℃水浴1 h。待溶液冷卻至室溫后，加入水和正己烷各1 mL，混勻后離心，脂肪酸甲酯即溶于上層正己烷中。取上層有機(jī)相用于氣相色譜分析。

1.2.6 油脂成分分析 取0.5 mL過(guò)濾后的脂肪酸甲酯，置于氣相色譜樣品管中，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)合分析儀（氣相色譜儀為T(mén)race1300，質(zhì)譜儀為T(mén)race ISQ，Thermo Fisher，USA）進(jìn)行分析。色譜柱為DB-5 ms毛細(xì)管柱（35 m× 250 μm×0.25 μm），掃描荷質(zhì)比范圍為40～500。載氣為He，流速1 mL·min-1，進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣口溫度280 ℃，檢測(cè)器溫度 290 ℃，升溫程序：70 ℃保持2 min，接著以10 ℃·min-1升溫至 220 ℃，再以3 ℃·min-1升溫至 260 ℃，然后以10 ℃·min-1升溫到280 ℃，保持5 min。以37 種混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品（NU-CHEKPREP，INC.， USA）為參照。通過(guò)對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)樣品并計(jì)算峰面積來(lái)確定各組分的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 富油酵母菌的形態(tài)特征及分子生物學(xué)鑒定

顯微鏡下可清晰地觀察到單個(gè)酵母菌，菌體的大小一般在2～10 μm 之間，菌體形態(tài)多呈橢圓形（圖1）。年輕的菌體其長(zhǎng)軸一般在5 μm 左右，成熟的菌體長(zhǎng)軸可達(dá)10 μm，且菌體形態(tài)被拉長(zhǎng)，細(xì)胞核被擠向細(xì)胞邊緣，可清晰地看到成熟的大液泡。在固體培養(yǎng)基上，單克隆為乳白色圓球，直徑約為1～5 mm，邊緣清晰，表面光滑濕潤(rùn)。

該酵母菌主要以出芽的形式繁殖，成熟細(xì)胞表面生出一個(gè)小芽孢，然后逐漸變大，至與母體大小相近時(shí)，兩細(xì)胞壁分離，成為完整的兩個(gè)細(xì)胞，此為第一種方式。也可能在母體細(xì)胞核內(nèi)部先進(jìn)行有絲分裂，隨著染色體被拉向細(xì)胞兩極，細(xì)胞膜、細(xì)胞壁發(fā)生縊縮，后分裂為兩個(gè)子細(xì)胞，此為第二種二分裂的方式。這兩種方式都是酵母菌比較常見(jiàn)的繁殖方式。在營(yíng)養(yǎng)條件較豐富的培養(yǎng)基中，酵母菌主要以出芽生殖為主，而在后期產(chǎn)物積累的過(guò)程中，會(huì)出現(xiàn)部分二分裂生殖。二分裂生殖中，細(xì)胞壁縊縮發(fā)生在一瞬間，顯微鏡下很難捕捉到。在此次觀察中，還觀察到了少許呈兩端出芽生殖的細(xì)胞。

對(duì)18S rDNA序列測(cè)序后比對(duì)，該序列跟Cyberlindnerasaturnusstrain SBPN 27（GenBank No.：KY419100.1）的序列具有99%的相似度，根據(jù)微生物分類(lèi)方法，將其歸類(lèi)為Cyberlindnerasaturnus sp.，命名為SXAU-D12。

2.2 尼羅紅染色法檢測(cè)破囊壺菌生長(zhǎng)過(guò)程中的油脂積累情況

使用尼羅紅熒光染色的方法對(duì)酵母菌生長(zhǎng)過(guò)程中油脂積累情況進(jìn)行定性檢測(cè)，所得結(jié)果見(jiàn)圖2。接種后12 h，酵母菌仍處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞以分裂生長(zhǎng)為主，油脂的積累量較少。尼羅紅染色顯示熒光較弱，細(xì)胞內(nèi)的油脂粒呈現(xiàn)微弱的黃色熒光，數(shù)量較少，細(xì)胞壁呈現(xiàn)紅色熒光，邊緣較厚且清晰可見(jiàn)。24 h后，細(xì)胞開(kāi)始逐漸進(jìn)入平臺(tái)期，細(xì)胞開(kāi)始積累油脂，尼羅紅染色可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)油脂粒的數(shù)量明顯增多，細(xì)胞內(nèi)黃色熒光強(qiáng)度增加，細(xì)胞壁的紅色熒光減弱。第2天細(xì)胞中油脂粒的熒光強(qiáng)度繼續(xù)增強(qiáng)，至第3天，細(xì)胞中的油脂積累量達(dá)到最大，整個(gè)細(xì)胞都呈現(xiàn)亮黃色，細(xì)胞內(nèi)不可見(jiàn)單個(gè)的脂肪粒，不可見(jiàn)明顯的細(xì)胞壁。

2.3 脂肪酸含量與成分分析

本試驗(yàn)篩選得到的酵母菌脂肪酸含量占細(xì)胞干質(zhì)量的55%以上。GC-MS結(jié)果顯示（圖3），脂肪酸成分主要包括C15∶0（棕櫚酸）、C16∶0（硬脂酸）和C17∶0，三者占到總油脂含量的90.5%。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)從紅樹(shù)林根際土壤和海水中篩選得到的富油酵母菌，具有生長(zhǎng)繁殖快，易于研究的特性。在低氮培養(yǎng)基中培養(yǎng)96 h左右，其脂肪酸堆積量大，可達(dá)干菌體質(zhì)量的55%。脂肪酸主要為15碳、16碳和17碳的飽和脂肪酸，非常適合于生產(chǎn)生物柴油。在后續(xù)試驗(yàn)中，擬通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件，并對(duì)該菌株進(jìn)行遺傳改造，以進(jìn)一步提高脂肪酸產(chǎn)量，實(shí)現(xiàn)脂肪酸的大量生產(chǎn)，為其在工業(yè)上大規(guī)模應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]SOYDEMIR G，KERIS-SEN U D， SEN U，et al. Biodiesel production potential of mixed microalgal culture grown in domestic wastewater[J]. Bioprocess and biosystems engineering， 2016，39（1）： 45-51.

[2]薛智權(quán)， 呂蕊， 李宏， 等. 一株富油微藻的鑒定及其脂肪酸成分分析[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2016，22 （8）： 1-5.

[3]SALVI B L， PANWAR N L. Biodiesel resources and production technologies ：a review[J].Renewable and sustainable energy reviews，2012，16（6）： 3680-3689.

[4]孟昊， 薛智權(quán)， 唐杰， 等. 深圳福田紅樹(shù)林土壤可培養(yǎng)微生物和土壤酶活性研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013（1）： 53-56.

[5]LI C H， WONG Y S， TANG N F. Anaerobic biodegradation ofpolycyclic aromatic hydrocarbons with amendment of iron（Ⅲ） inmangrove sediment slurry[J].Bioresource technology， 2010， 101（21）：8083-8092.

[6]MIAO S， CHEN G， DELAUNE R D， et al. Partitioning and removalof Cd and Mn using a simulated mangrove wastewater treatment system[J].J environ sci health atox hazard subst environ eng，2007，42（4）：405-411.

[7]張柳紅， 王嘉健， 洪葵，等. 紅樹(shù)林內(nèi)生真菌Aspergillus sp. 085035次級(jí)代謝產(chǎn)物研究[J]. 中藥材， 2017， 40（2）： 342-346.

[8]李晶晶， 劉瑛， 馬炯. 破囊壺菌生產(chǎn)DHA的應(yīng)用前景[J]. 食品工業(yè)科技， 2013， 34（16）： 367-371.

[9]梁園梅， 劉瑛， 李晶晶， 等. 高產(chǎn)DHA 破囊壺菌Aurantiochytrium sp. PKU#SW7誘變株的篩選[J]. 微生物學(xué)通報(bào)， 2016， 43（2）： 457-464.

[10]姜?jiǎng)︿h，趙麗芹，陳濤，等.DHA的來(lái)源及寇氏隱甲藻生產(chǎn)DHA的研究[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2011（3）：109-112.