潘玲玲+王秀峰+李強+楊鳳娟+魏珉+史慶華

摘 要：為進一步研究CsNR的作用機制，從黃瓜幼葉中克隆獲得硝酸還原酶基因編碼區(qū)序列（CDS）全長和片段（CsNR； EC 1.6.6.1），并運用生物學軟件對該基因進行序列分析。其中CDS全長2 748 bp，編碼915個氨基酸；CDS片段360 bp。CDS全長和pROKⅡ經(jīng)KpnI單酶切和連接，構(gòu)建了CsNR正義表達載體；CDS片段和pROKⅡ經(jīng)KpnI和SacI雙酶切，構(gòu)建了CsNR反義表達載體。通過與其他高等植物NR蛋白進行同源性比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CsNR基因的氨基酸序列與甜瓜、煙草、擬南芥、油菜NR基因編碼的氨基酸序列高度同源，其中與甜瓜NR蛋白之間同源性最高，為98.25%。

關(guān)鍵詞：黃瓜；硝酸還原酶；生物信息學；正義表達載體；反義表達載體

中圖分類號：S642.2 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.07.001

Sequence Analysis and Construction of Sense and Antisense Expressing Vector of Cucumber Nitrate Reductase（CsNR）

PAN Lingling1， WANG Xiufeng1，2， LI Qiang1， YANG Fengjuan1，2，WEI Min1，3， SHI Qinghua1，2

（1.College of Horticulture Science and Engineering， Shandong Agricultural University， Tai'an， Shandong 271018， China； 2.State Key Laboratory of Crop Science， Tai'an， Shandong 271018， China；3. Scientific Observing and Experimental Station of Environment Controlled Agricultural Engineering in Huang-Huai-Hai Region， Ministry of Agriculture， Tai'an， Shandong 271018， China）

Abstract： To further study the mechanism of CsNR， a fragment and full length CDS of cucumber nitrate reductase （CsNR； EC 1.6.6.1） was isolated from cucumber （Cucumis sativus L.） young leaves， respectively. Meanwhile， the gene sequence was analyzed by the biology software. The fragment and full-length CDS was 2 952 and 360 bp， respectively. The full-length CDS and pROKII were digested to construct sense expressing vector. The fragment CDS and pROKII were digested to construct sense expressing vector. The homology alignment analysis indicated that the protein encoded by CsNR was in high similarity with NR-encoding protein in Cucumis melo， Nicotiana tabacum， Arabidopsis thaliana and Brassica campestris. The homology with amino acid sequences of CsNR compared with Cucumis melo was the highest by 98.25%.

Key words： Cucumis satinus L.； nitrate reduatase； bioinformatics； sense expressing vector； antisense expression vector

植物硝酸還原酶（Nitrate reductase，NR）是氮同化代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，它以還原型輔酶（NAD（P）H）為電子供體催化硝酸鹽的還原，生成亞硝酸鹽。硝酸鹽通過谷氨酸合成循環(huán)轉(zhuǎn)變?yōu)殇@，分別由胞質(zhì)中的NR以及葉片葉綠體中的亞硝酸還原酶催化[1]。NR催化硝酸鹽還原成亞硝酸鹽是植物整個硝酸鹽同化過程中的限速和關(guān)鍵作用步驟[2-4]，故NR被認為是硝酸鹽同化過程中的限速酶和誘導酶[5-8]，那么植物中的硝酸還原酶活性和NO3- 含量之間就應該存在著密切聯(lián)系[9]。對高等植物而言，研究發(fā)現(xiàn)硝酸鹽是調(diào)節(jié)硝酸還原酶活性[5]以及NR表達[6]的主要因子?，F(xiàn)已從大麥[10]、筍瓜[11]、煙草[12-13]、擬南芥[14-15]、番茄[16]、玉米[17]、蘿卜[18]、生菜[19]和大白菜[20]等多種植物種類中克隆出了多種NR基因。目前，人們在植物的鹽脅迫信號轉(zhuǎn)導機制方面研究已取得了大量成就[21]，但均以NaCl作為鹽脅迫處理手段。

黃瓜作為主要的設(shè)施蔬菜作物之一，在栽培中人們?yōu)榱双@高產(chǎn)，盲目施用大量氮肥；加之設(shè)施環(huán)境地溫高、蒸發(fā)量大、無雨水淋洗以及連作等不合理的栽培方式，導致土壤發(fā)生次生鹽漬化[22]。溫室土壤次生鹽漬化的鹽分組成中，其陰離子主要是NO3-，且占陰離子總量的67%～76%[23]。但在過量NO3-脅迫下，設(shè)施黃瓜NR表達水平以及NR活性的變化尚未見報道。本試驗通過克隆黃瓜硝酸還原酶基因全長和片段，構(gòu)建其正義和反義表達載體，可為硝酸還原酶功能研究以及在黃瓜抗性育種中的應用提供一定的理論依據(jù)和實踐途徑。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以‘津優(yōu)35號黃瓜品種為試材。

大腸桿菌E.coli DH5α、表達載體pROKⅡ由本實驗室保存。pMD18-T 載體、KpnⅠ、SacⅠ等購自大連寶生物公司。Tap DNA聚合酶、快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒等購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 模板cDNA的制備 當黃瓜幼苗長至三葉一心時，用50 mmol·L-1 KNO3于光下誘導4 h，選取健壯植株幼苗葉片進行試驗?？俁NA的提取參照Salzman等[24]的方法進行，第一鏈cDNA的合成參照康為世紀公司說明書。

1.2.2 引物設(shè)計與合成 用DNAman軟件設(shè)計并由北京六合華大基因科技股份有限公司合成引物。正義上游引物P1：5′-CACAACAAAGGTGGTGGAGGGCAAAA-3′；下游引物P2：5′- ACAAAACGAATCCAACGTCCTTTTC-3′。反義上游引物P3：5′-GAGCTCGTGGAGGTGACAATGG-3′；下游引物P4：5′-GGTACCGGTGGATATTTCTAGATG-3′。

1.2.3 PCR擴增 PCR反應體系為：模板cDNA 2 μL，10× Buffer 10 μL，10 mmol·L-1 dNPT 8 μL，上下游引物各4 μL，Tap DNA聚合酶1 μL，加雙蒸餾水至100 μL，平均到兩個PCR管。擴增程序為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，進行22個循環(huán)，最后于72 ℃延伸10 min。PCR擴增后，取PCR產(chǎn)物在l%瓊脂糖凝膠進行電泳，觀察結(jié)果。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定 用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，并將其與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞。在Amp抗性LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)10～12 h，挑取白色單菌落進行菌落PCR并搖菌提取質(zhì)粒酶切驗證。分別將正反義陽性克隆質(zhì)粒命名為pMD18-CsNR（+）與pMD18-CsNR（-）。

1.2.5 核苷酸序列的測定和分析 將含陽性克隆質(zhì)粒的菌液送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.6 生物信息學分析 通過NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLASTx對CsNR的cDNA序列和開放閱讀框編碼的氨基酸進行同源性搜素和比對；通過DNAMAN比較分析黃瓜NR蛋白與其他作物中NR蛋白的進化關(guān)系；通過Expasy數(shù)據(jù)庫預測CsNR蛋白質(zhì)PI和其相對分子質(zhì)量。

1.2.7 植物表達載體的構(gòu)建和鑒定 用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ分別對pMD18-CsNR（+）載體和pROKⅡ載體進行單酶切，同時用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和SacⅠ分別對pMD18-CsNR（-）載體和pROKⅡ載體進行雙酶切，回收目的片段。

用T4 DNA連接酶分別將對應的兩個回收片段進行連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，在含有卡那霉素100 mg·L-1的LB平板上篩選陽性菌落，堿法提取質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定后送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。構(gòu)建好的植物表達載體分別命名為pROKⅡ-CsNR（+）與pROKⅡ-CsNR（-）。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsNR基因的克隆與鑒定

以黃瓜幼苗葉片cDNA為模板，利用基因特異引物P1/P2和P3/P4分別進行PCR擴增，獲得CsNR基因CDS全長和片段，將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，目的條帶大小為2 952 bp（圖1A）和360 bp（圖1B）。測序結(jié)果表明， CDS全長2 952 bp，CsNR基因cDNA開放閱讀框（ORF） 為2 748 bp，編碼 915 個氨基酸，Gen Bank 登錄號為NM_001280767。分別將圖1中的目的條帶回收，與克隆載體pMD18-T連接，經(jīng)篩選獲得陽性克隆質(zhì)粒pMD18-CsNR（+）與pMD18-CsNR（-）。

2.2 CsNR基因生物信息學分析

利用DNAMAN 6.0軟件將CsNR基因推導的氨基酸序列與NCBI中已登陸的其他高等植物NR蛋白進行同源性比對分析（圖2） ，結(jié)果表明該序列與甜瓜、煙草、擬南芥、油菜NR基因編碼的氨基酸序列高度同源，其中與甜瓜NR蛋白之間同源性最高，為98.25%。

Expasy數(shù)據(jù)庫預測表明，CsNR蛋白理論等電點（ pI） 為7.00，相對分子質(zhì)量為103.227 1×103 Da。

2.3植物表達載體的構(gòu)建及鑒定

用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ分別酶切pMD18-CsNR（+）和pROKⅡ載體，回收目的片段并用T4連接酶連接，構(gòu)建正義表達載體pROKⅡ-CsNR（+）。用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和SacⅠ分別酶切pMD18-CsNR（-）和pROKⅡ載體并用T4連接酶連接，構(gòu)建反義表達載體pROKⅡ-CsNR（-）。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞。挑取單克隆進行菌落PCR驗證。同時，搖菌提質(zhì)粒進行酶切驗證。從圖3的A、B中可以看出，目的片段已經(jīng)插入pROKⅡ載體中，經(jīng)測序證明植物表達載體構(gòu)建正確。載體構(gòu)建過程如圖4（正義）和圖5（反義）。

3結(jié)論與討論

早在1981年Harper在測定大豆葉片硝酸還原酶活性時，就首次發(fā)現(xiàn)了不依賴于氧氣的NOx（NO+NO2）酶促產(chǎn)生現(xiàn)象，進一步的突變體試驗初步證實與組成型硝酸還原酶（constitutive NR，cNR，EC1.6.6.2）中的C1NR類型有關(guān)。以后，Dean和Harper [25]報道了豆科菜豆屬植物cNR的鉬-蝶呤中心也可能具有催化亞硝酸鹽生成NO的功能，并認為這種依賴于硝酸還原酶的NOx合成能力僅局限于高等植物中的豆科植物。而Wildt等[26]則發(fā)現(xiàn)在光照條件下高濃度的硝酸鹽培養(yǎng)液也可以誘發(fā)向日葵、煙草、甘蔗、玉米、葡萄、云杉和菠菜等植物大量產(chǎn)生NO，暗示NO可能是所有植物氮代謝的副產(chǎn)物。由此可見，硝酸還原酶也是植物體內(nèi)的NO合成酶，NO3-脅迫下體內(nèi)NR活性以及NO3-、NO2-和NO含量的改變與植物抗鹽性關(guān)系密切。這說明NO3-鹽脅迫下，體內(nèi)NO變化對黃瓜幼苗生理生化特性及信號轉(zhuǎn)導相關(guān)基因表達的影響具有重要意義。

本研究根據(jù)GeneBank中已發(fā)表的黃瓜硝酸還原酶基因序列設(shè)計引物進行RT-PCR，將PCR產(chǎn)物回收連接到pMD18-T載體上，得到長度為2 748 bp的CDS全長與360 bp的反義片段，進而分別構(gòu)建了CsNR正義和反義表達載體。這為研究CsNR對黃瓜內(nèi)源NO的分子調(diào)控機理及對NO級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的影響，闡明內(nèi)源NO對NO3-脅迫的響應機制，改良根際環(huán)境、減輕鹽漬化危害奠定了基礎(chǔ)。同時，CsNR基因的氨基酸序列與甜瓜、煙草、擬南芥、油菜NR基因編碼的氨基酸序列高度同源，其中與甜瓜NR蛋白之間同源性最高，為98.25%。

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