盧慧惠， 彭 林， 段作營， 蔡燕飛， 金 堅(jiān)， 李華鐘*

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

人血清白蛋白-白介素-2融合蛋白在CHO細(xì)胞中的表達(dá)

盧慧惠1， 彭 林1， 段作營1， 蔡燕飛2， 金 堅(jiān)2， 李華鐘*1

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

白細(xì)胞介素-2在人體免疫應(yīng)答中具有重要作用，常用于治療腫瘤、肝炎和免疫缺陷性疾病等多種疾病，但因其體內(nèi)半衰期短而限制了其臨床應(yīng)用。文中構(gòu)建了含有融合蛋白基因HSA-IL-2的pMH3質(zhì)粒，并通過電轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)入中國倉鼠卵巢細(xì)胞 （Chinese hamster ovary cell，CHO細(xì)胞）中，利用pMH3質(zhì)粒所攜帶的neo基因進(jìn)行篩選，經(jīng)96孔板培養(yǎng)并篩選得到穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白質(zhì)的重組細(xì)胞，融合蛋白HSA-IL-2表達(dá)量達(dá)到2.26mg/L。利用反轉(zhuǎn)錄PCR和Western blot對重組細(xì)胞鑒定后發(fā)現(xiàn)，融合蛋白編碼基因整合入重組CHO細(xì)胞基因組中，而且融合蛋白同時(shí)具有HSA和IL-2雙重免疫原性。利用對IL-2具有依賴性的CTLL-2細(xì)胞進(jìn)行活性分析后發(fā)現(xiàn)，篩選得到的表達(dá)細(xì)胞分泌得到的融合蛋白具有較高的生物活性，表明成功構(gòu)建具有表達(dá)IL-2生物活性能力的CHO細(xì)胞。

人白介素-2；人血清白蛋白；融合蛋白；中國倉鼠卵巢細(xì)胞

白細(xì)胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）又稱T細(xì)胞生長因子，是Morgan[1]等人用絲裂原、刀豆蛋白刺激T淋巴細(xì)胞時(shí)產(chǎn)生的一種因子。IL-2在機(jī)體免疫應(yīng)答中具有重要的作用，在臨床上用于腫瘤、肝炎、免疫缺陷性疾病的治療。但I(xiàn)L-2相對分子質(zhì)量小，體內(nèi)半衰期僅為6.9 min[2]，多次高劑量注射可能造成不良副作用[3]，給患者帶來很大的困擾，限制了其在臨床上的應(yīng)用[4]。人們通過白蛋白融合技術(shù)增加藥物相對分子質(zhì)量的方法來延長藥物半衰期[5]。關(guān)波等人通過HSA融合技術(shù)在畢赤酵母中成功表達(dá)了具有生物活性的融合蛋白IL-2-HSA，該融合蛋白在體內(nèi)半衰期的延長至13.24 h。但在畢赤酵母中表達(dá)融合蛋白時(shí)，產(chǎn)物存在不均一、過度糖基化和降解等問題，在生產(chǎn)應(yīng)用中受到很大限制[6]。目前中國倉鼠卵巢細(xì)胞 （Chinese hamster ovary cell，CHO細(xì)胞）已經(jīng)成為表達(dá)重組蛋白藥物最為理想的宿主之一[7]，CHO細(xì)胞表達(dá)的糖基化藥物最接近天然蛋白質(zhì)，而且很少分泌自身內(nèi)源蛋白，產(chǎn)物胞外分泌，利于純化。本研究中利用CHO表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢，在CHO表達(dá)系統(tǒng)中對IL-2和HSA融合蛋白進(jìn)行表達(dá)，將IL-2連接到HSA的C端，期望獲得高效表達(dá)融合蛋白HSA-IL-2的CHO細(xì)胞系，為HSA融合蛋白藥物提供新的表達(dá)思路。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pPIC9K/IL-2-HSA，由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存；CTLL-2細(xì)胞和IL-2標(biāo)準(zhǔn)品，江蘇金斯利藥業(yè)有限公司饋贈(zèng)；CHO-S細(xì)胞和 pMH3質(zhì)粒，AmProtein公司饋贈(zèng)；大腸桿菌DH5α，T4連接酶，限制性內(nèi)切酶Eco RI，Not I、DNA聚合酶等，購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒，膠回收試劑盒，PCR產(chǎn)物回收試劑盒等，購自上海生工生物公司；DMEM-F12培養(yǎng)基和胎牛血清 （FBS），購自Gibco公司；G418，MTT，購自Sigma公司；兔抗人IL-2抗體，鼠抗人HSA（HRP）抗體，鼠抗人HSA抗體，購自abcam公司；山羊抗兔二抗和山羊抗小鼠二抗，購自碧云天公司；ELISA試劑盒，購自聯(lián)科生物公司；其余均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純試劑。

1.2 PCR擴(kuò)增引物

表1中H1和I2的波浪線分別為Eco RⅠ和NotⅠ的酶切位點(diǎn)。H1中Eco RⅠ后CACC為Kozac序列，下劃線部分為Igk信號肽序列，引物H2和I1有20個(gè)堿基完全互補(bǔ)，以上引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 HSA-IL-2融合蛋白PCR引物Table 1 Primers of HSA-IL-2 fusion protein

1.3 表達(dá)載體pMH3/HSA-IL-2的構(gòu)建

分別以表1中H1、H2和I1、I2為引物，質(zhì)粒pPIC9K/IL-2-HSA為模板，擴(kuò)增出HSA和IL-2基因片段。純化兩PCR產(chǎn)物并按照摩爾比1∶1混合進(jìn)行拼接，再以拼接產(chǎn)物為模板，H1和I2為引物擴(kuò)增HSA-IL-2融合基因全長HSA-IL-2。用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收目的片段，經(jīng)EcoRⅠ與NotⅠ酶切、回收，并連接至pMH3載體的EcoRⅠ與NotⅠ酶切位點(diǎn)之間，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB固體培養(yǎng)平皿上 （含100μg/mL的Amp），37℃培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行PCR及雙酶切電泳圖譜鑒定，并測序驗(yàn)證。

1.4 CHO-S細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

CHO-S細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長至匯合度80%左右時(shí)，用胰酶消化，離心收集細(xì)胞，PBS重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×107cells/mL。取200μL細(xì)胞懸液，10μg質(zhì)粒進(jìn)行電轉(zhuǎn)染。電轉(zhuǎn)條件為：500 V，500μs電擊4次，每兩次電擊間隔冰浴1min。電擊后將電極杯中的細(xì)胞懸液均分至兩個(gè)10 cm培養(yǎng)皿（DMEM/F12，含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清）中培養(yǎng)24 h后，加入終質(zhì)量濃度為1.5mg/LG418進(jìn)行篩選，期間觀察細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞出現(xiàn)大量死亡時(shí)（一般2～3 d）更換到含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞克隆長出。

1.5 穩(wěn)定表達(dá)HSA-IL-2細(xì)胞株的篩選

待細(xì)胞克隆長至合適大小后將所有單克隆挑至96孔板中。在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)7～8 d后，PBS清洗細(xì)胞，每孔加入100μL無血清培養(yǎng)基，48 h后，取上清液用鼠抗人HSA（HRP）抗體進(jìn)行Dot-blot檢測，進(jìn)行快速篩選。得到的HSA-IL-2高表達(dá)克隆轉(zhuǎn)入24孔板中，培養(yǎng)2～3 d后用PBS清洗，每孔加入200μL無血清培養(yǎng)基，48 h后，取上清液進(jìn)行Dotblot檢測，并用HSA標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，進(jìn)一步篩選高表達(dá)細(xì)胞株。同時(shí)ELISA法檢測細(xì)胞株的表達(dá)水平，并挑選表達(dá)量最高的細(xì)胞株，命為CHO-HI。

Dot-blot檢測的具體步驟如下：培養(yǎng)上清液按照順序點(diǎn)到NC膜上，5 g/dL脫脂奶粉37℃封閉2 h，鼠抗人HSA （HRP）抗體37℃孵育1 h，TBST（TBS含體積分?jǐn)?shù)0.5%Twen-20）漂洗3次，ECL顯色成像。

1.6 穩(wěn)定表達(dá)HSA-IL-2細(xì)胞株的鑒定

1.6.1 RT-PCR法 用Trizol法分別提取細(xì)胞株CHO-HI和CHO-S細(xì)胞的總RNA，分別取1μL RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。再以cDNA為模板，擴(kuò)增目的基因片段。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定。

1.6.2 Western blot檢測 取細(xì)胞株CHO-HI，48 h表達(dá)上清液后進(jìn)行SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)至NC膜上，5 g/dL脫脂奶粉37℃封閉2 h，兔抗人IL-2或鼠抗人HSA抗體37℃孵育2 h，TBST（TBS含體積分?jǐn)?shù)0.5%Twen-20）漂洗3次，山羊抗兔二抗或山羊抗小鼠二抗37℃孵育1 h，TBST（TBS含體積分?jǐn)?shù)0.5%Twen-20）漂洗3次，ECL顯色成像。

1.7 重組HSA-IL-2生物活性的測定

參照中國藥典中的CTLL-2/MTT法[8]，測定CHOHI細(xì)胞培養(yǎng)液中的重組HSA-IL-2的生物活性。樣品IL-2效價(jià)按下式（1）計(jì)算待測樣品生物學(xué)活性

式中，Pr為標(biāo)準(zhǔn)品生物學(xué)活性，IU/mL；Ds為待測樣品預(yù)稀釋倍數(shù)；Dr為標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)稀釋倍數(shù)；Es為待測樣品相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品半效的稀釋倍數(shù)；Er為標(biāo)準(zhǔn)品半效稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 表達(dá)載體pMH 3/HSA-IL-2的構(gòu)建

在平板上隨機(jī)挑選5個(gè)克隆，經(jīng)菌落PCR鑒定，其中2、3、4、5號克隆在2 200 bp處有陽性條帶（圖1）。

圖1 pMH3-HSA-IL-2菌液PCR鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasm id pMH 3-HSA-IL-2 by PCR

提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果在2 200 bp處均出現(xiàn)特異性條帶（圖2）。測序結(jié)果與設(shè)計(jì)的基因序列比對結(jié)果一致，證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 pMH3-HSA-IL-2質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasm id pMH 3-HSA-IL-2 by enzyme digestion

2.2 細(xì)胞株的篩選

將挑取的232株克隆在96孔板中分別進(jìn)行培養(yǎng)，表達(dá)并取上清液進(jìn)行Dot-blot檢測，圖3顯示了部分結(jié)果。將其中表達(dá)量較高的48株細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)到24孔板中進(jìn)一步篩選。選取其中表達(dá)量較高7株用ELISA檢測其表達(dá)量，結(jié)果如表2所示。其中1D3、2B4和2C1這3株的表達(dá)量均高于1mg/L，將其置于液氮中進(jìn)行超低溫冷凍保藏，并將表達(dá)量最高的2B4命名為CHO-HI。

圖3 96孔板克隆篩選結(jié)果Fig.3 Screening results in the 96-well plate by Dot-blot

表2 不同HSA-IL-2克隆表達(dá)量Elisa檢測結(jié)果Table 2 Expression level of HSA-IL-2 in different clone detected by Elisa

2.3 細(xì)胞株的鑒定

RT-PCR結(jié)果（圖4）表明，篩選得到的CHO-HI細(xì)胞中有HSA-IL-2融合蛋白mRNA表達(dá)，而在未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的CHO-S對照組中并未見mRNA表達(dá)。證實(shí)HSA-IL-2基因已成功整合至CHO-S細(xì)胞基因組中。Western blot檢測結(jié)果（圖5）顯示：篩選得到的細(xì)胞株CHO-HI培養(yǎng)上清液無論采用HSA抗體，還是采用IL-2抗體，均在82×103左右出現(xiàn)單一的陽性條帶，與目標(biāo)融合蛋白理論相對分子質(zhì)量相符。這表明目標(biāo)蛋白質(zhì)具有HSA和IL-2的雙重免疫原性，篩選得到的細(xì)胞株CHO-HI能夠成功表達(dá)HSA-IL-2融合蛋白。

圖4 RT-PCR鑒定CHO-HI陽性細(xì)胞株Fig.4 Identification of CHO-HI positive transformants by RT-PCR

圖5 HSA-IL-2融合蛋白W estern blot鑒定Fig.5 Characterization of the recombinant HSA-IL-2 by W estern blot

2.4 融合蛋白HSA-IL-2活性測定

采用IL-2依賴型細(xì)胞株CTLL-2，以標(biāo)準(zhǔn)品IL-2（925 IU/mL）為陽性對照，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的CHO-S培養(yǎng)上清液（預(yù)稀釋2.7倍）為陰性對照，對CHO-HI表達(dá)上清液（預(yù)稀釋2.7倍）的生物學(xué)活性進(jìn)行了測定見圖6。結(jié)果顯示，上清液中的融合蛋白HSA-IL-2可以有效刺激CTLL-2細(xì)胞的增殖，其生物學(xué)活性約為4.5×104IU/mL。

3 結(jié)語

研究中將HSA與IL-2基因融合并克隆至pMH3質(zhì)粒，成功構(gòu)建了融合蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒pMH3/HSA-IL-2，并成功在CHO細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)。經(jīng)過篩選得到一株陽性克隆CHO-HI，ELISA試劑盒測定融合蛋白表達(dá)量為2.26 mg/L。經(jīng)mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測，表明HSA-IL-2基因已經(jīng)整合入CHO細(xì)胞基因組，表達(dá)產(chǎn)物相對分子質(zhì)量為8 200與HSA-IL-2融合蛋白理論相對分子質(zhì)量相符，而且具有HSA和IL-2雙重免疫原性，得到了穩(wěn)定表達(dá)HSA-IL-2融合蛋白的細(xì)胞株CHO-HI，而且Western blot檢測沒有觀察到降解現(xiàn)象。所表達(dá)的融合蛋白HSA-IL-2可以有效促進(jìn)CTLL-2細(xì)胞的增殖，表現(xiàn)出較高的生物活性。

圖6 HSA-IL-2生物活性測定Fig.6 Bioactivity assay of HSA-IL-2

作者所在研究室已經(jīng)在畢赤酵母中成功表達(dá)了多種白蛋白融合藥物，以延長小分子蛋白質(zhì)藥物的半衰期。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各種白蛋白融合藥物的分泌表達(dá)量都有一定的差異。即使是同一種多肽類藥物，其表達(dá)量和活性也會因其與HSA的連接方式（即接入HSA的C端或N端）、培養(yǎng)條件等因素的不同而有較大差異?？赡苁且?yàn)椴煌庠吹鞍踪|(zhì)分子構(gòu)象復(fù)雜程度有差異，而且畢赤酵母糖基化水平、對蛋白質(zhì)的折疊修飾功能與哺乳動(dòng)物細(xì)胞有所不同，分泌表達(dá)具有天然構(gòu)象的活性分子需要在細(xì)胞水平進(jìn)行更多的改造[9]。CHO表達(dá)系統(tǒng)與其他表達(dá)系統(tǒng)相比更適于重組蛋白表達(dá)[10]：具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達(dá)的糖基化藥物蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然蛋白質(zhì)分子；適應(yīng)懸浮培養(yǎng)；重組基因高效擴(kuò)增表達(dá)；產(chǎn)物胞外分泌。目前已篩選出可高效表達(dá)具有生物活性的HSA-IL-2融合蛋白的CHO-HI細(xì)胞株，經(jīng)過懸浮馴化后，可以達(dá)到高密度培養(yǎng)，提高融合蛋白表達(dá)量，實(shí)現(xiàn)融合蛋白的高效表達(dá)，為以后融合蛋白的研究提供新的思路。

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Expression of Human Serum Album in-Interleukin-2 Fusion Protein in Chinese Ham ster Ovary Cells

LU Huihui1， PENG Lin1， DUAN Zuoying1， CAIYanfei2， JIN Jian2， LIHuazhong*1
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，M inistry of Education，Jiangnan University，Wuxi214122，China；2.School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Interleukin-2（IL-2）plays an important role in immune response and isw ildly used as therapeutic protein to treat diseases，such as cancer，hepatitis and immunodeficiency.In this study，the pMH3 plasm id containing fusion protein of human serum album in and IL-2 was constructed and then transfected to Chinese hamster ovary （CHO）cells by electroporation.CHO cells stably expressing the targetproteinwere selected by neo gene in pMH3 plasm id and determ ined by Dot-blot during 96-plate culture.The titer of HSA-IL-2 was 2.26 mg/L in the 24-plate culture.Reverse transcription PCR and western blot showed that the gene encoding HSA-IL-2 was integrated to genome of recombinant CHO cells and the secreted fusion protein was detected by antibody to beHSA and IL-2.The biological activity of fusion protein was analyzed by IL-2 dependent CTLL-2 cells，and the resultshowed that the recombinantprotein possessed a high activity.In conclusion，the recombinantCHO cellsproducing biological fusion protein of HSA-IL-2were successfulestablished.

human interleukin-2，human serum album in，fusion protein，Chinese hamsterovary cells

Q 786

A

1673—1689（2017）05—0456—05

2015-03-12

國家863計(jì)劃項(xiàng)目（2014AA021003）；中科院先導(dǎo)計(jì)劃項(xiàng)目（XDA01040202）；江蘇省優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目。

*通信作者：李華鐘（1958—），男，山東龍口人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事微生物制藥研究。E-mail：hzhli@jiangnan.edu.cn

盧慧惠，彭林，段作營，等.人血清白蛋白-白介素-2融合蛋白在CHO細(xì)胞中的表達(dá)[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（05）：456-460.