苗書(shū)魁，米曉云，陸桂麗，夏俊，魏玉榮，魏婕，王延，馬文戈，汪萍*，黃炯*

（1.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所（新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心），新疆 烏魯木齊 830011；2.天康生物股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830030）

獸醫(yī)科學(xué)

模擬應(yīng)用條件檢測(cè)小反芻獸疫活疫苗的病毒含量

苗書(shū)魁1，米曉云1，陸桂麗1，夏俊1，魏玉榮1，魏婕1，王延1，馬文戈1，汪萍1*，黃炯1*

（1.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所（新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心），新疆 烏魯木齊 830011；2.天康生物股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830030）

10.16863/j.cnki.1003-6377.2017.04.011

為確保小反芻獸疫活疫苗在免疫接種時(shí)的效果。本試驗(yàn)?zāi)M野外操作環(huán)境，在不同稀釋液、不同溫度和不同放置時(shí)間條件下，檢測(cè)并比較小反芻獸疫活疫苗病毒含量。結(jié)果表明，以PBS、含1%冷水魚(yú)明膠的生理鹽水、生理鹽水分別稀釋疫苗，1%冷水魚(yú)明膠的生理鹽水更適合作為小反芻獸疫活疫苗的稀釋液。疫苗以三種不同的稀釋液稀釋后，在4 h內(nèi)，25℃或37℃條件下，不會(huì)影響其效價(jià)。

模擬應(yīng)用條件；檢測(cè)；小反芻獸疫活疫苗；病毒含量

小反芻獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的一種嚴(yán)重的烈性、接觸性傳染病，特征為發(fā)熱、口腔及舌黏膜糜爛、流淚、流鼻涕、腹瀉和肺炎[1]。PPRV感染可導(dǎo)致綿羊和山羊高達(dá)100%的發(fā)病率和顯著的死亡率[2]，嚴(yán)重威脅著畜牧業(yè)的發(fā)展。自1942年P(guān)PR首次暴發(fā)于科特迪瓦以來(lái)，主要在東非、西非、中非、阿拉伯半島和南亞等地流行[3-5]。2007年7月，我國(guó)西藏阿里地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)自印度傳入的PPR，至2014年9月，全國(guó)共有22個(gè)省(自治區(qū))256個(gè)縣先后發(fā)生PPR疫情[6-10]，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。全球計(jì)劃到2030年消滅小反芻獸疫[1，11]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布了《全國(guó)小反芻獸疫消滅計(jì)劃(2016-2020年)》，計(jì)劃到2020年，力爭(zhēng)全國(guó)達(dá)到小反芻獸疫非免疫無(wú)疫區(qū)標(biāo)準(zhǔn)。

PPR是我國(guó)強(qiáng)制免疫的動(dòng)物疫病，目前仍然靠疫苗免疫來(lái)預(yù)防。PPRV對(duì)溫度比較敏感，37℃時(shí)，感染力的半衰期為1～3 h。目前小反芻獸疫活疫苗的規(guī)格有50頭份和100頭份?；鶎訂挝辉谑褂眠^(guò)程中對(duì)疫苗稀釋后一段時(shí)間內(nèi)病毒含量能否達(dá)到說(shuō)明書(shū)中合格的效價(jià)（大于103.0 TCID50）存在疑問(wèn)，本試驗(yàn)通過(guò)模擬使用環(huán)境中溫度和時(shí)間，對(duì)PPR活疫苗病毒含量進(jìn)行了檢測(cè)，以期為小反芻獸疫活疫苗的免疫預(yù)防工作提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試疫苗及細(xì)胞

PPR活疫苗2015001、2015002批，均由天康生物股份有限公司生產(chǎn)。Vero細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

MEM/EBSS培養(yǎng)液、特級(jí)胎牛血清購(gòu)自HyClone公司，冷水魚(yú)明膠購(gòu)自北京梅科萬(wàn)德生物科技有限公司。PBS（0.01 M，pH7.2）、生理鹽水由本實(shí)驗(yàn)室自配。

1.3 方法

1.3.1 不同稀釋液、不同溫度、不同放置時(shí)間對(duì)病毒含量的影響

將2批疫苗用PBS（0.01 M，pH 7.2）、1%冷水魚(yú)明膠的生理鹽水、生理鹽水三種稀釋液按疫苗規(guī)定頭份將疫苗稀釋，在不同溫度（25℃、37℃）、不同放置時(shí)間（0 h、1 h、2 h、3 h、4 h）的條件下測(cè)定病毒含量（TCID50）。

1.3.2 TCID50測(cè)定

用無(wú)血清MEM將小反芻獸疫活疫苗按瓶簽注明頭份稀釋成1mL/頭份，再進(jìn)行10倍系列稀釋，取10-1、10-2、10-3、10-44個(gè)稀釋度，接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度接種8孔，每孔0.1 mL，每孔再加入濃度為2～3×105個(gè)/mL的Vero細(xì)胞懸液0.1 mL。同時(shí)設(shè)立正常細(xì)胞對(duì)照，置37℃、5%CO2中培養(yǎng)6 d，根據(jù)出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）的孔數(shù)，按Karber法計(jì)算TCID50。

2 結(jié)果與分析

2.1 PBS稀釋疫苗后對(duì)病毒含量的變化

用PBS稀釋疫苗，TCID50測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 PBS稀釋疫苗后病毒含量（TCID50/0.1 mL）

由表1可知，2批疫苗在25℃或37℃條件下，0～4 h內(nèi)，病毒含量范圍為103.375～103.625，病毒含量相差不大。2批疫苗在25℃或37℃下，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，病毒含量變化不大。2批疫苗在相同時(shí)間、25℃或37℃條件下，病毒含量接近。結(jié)果表明，2批疫苗病毒含量穩(wěn)定，符合說(shuō)明書(shū)中規(guī)定的效價(jià)。

2.2 1%冷水魚(yú)明膠的生理鹽水稀釋疫苗后對(duì)病毒含量的變化

用1%冷水魚(yú)明膠的生理鹽水稀釋疫苗，TCID50測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 1%冷水魚(yú)明膠的生理鹽水稀釋疫苗后病毒含量（TCID50/0.1 mL）

由表2可知，2批疫苗在25℃或37℃、0～4 h內(nèi)病毒含量范圍為103.5～103.625。表明2批疫苗病毒含量幾乎沒(méi)有變化。2批疫苗在25℃或37℃下，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，病毒含量幾乎沒(méi)有變化。2批疫苗在相同時(shí)間、25℃或37℃條件下，病毒含量接近。

2.3 生理鹽水稀釋疫苗后病毒含量的變化

用生理鹽水稀釋疫苗，TCID50測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 生理鹽水稀釋疫苗后的病毒含量（TCID50/0.1 mL）

由表3可知，2批疫苗在25℃或37℃、0～4 h內(nèi)病毒含量范圍為103.25～103.625。2批疫苗在25℃或37℃下，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，病毒含量逐漸降低，從0 h的103.625降到4 h的103.25。2批疫苗在相同時(shí)間、25℃或37℃條件下，病毒含量接近。

3 討論

經(jīng)對(duì)天康生物股份有限公司生產(chǎn)的2批次的PPR活疫苗以三種稀釋液分別稀釋，檢測(cè)其在不同條件下的TCID50并進(jìn)行比較。結(jié)果表明：疫苗稀釋后在25℃或37℃、0～4 h內(nèi)病毒含量差別不大；PBS稀釋疫苗后病毒含量范圍為103.375～103.625；1%冷水魚(yú)明膠的生理鹽水稀釋疫苗后病毒含量范圍為103.5～103.625；生理鹽水稀釋疫苗后病毒含量范圍為103.25～103.625。三種稀釋液分別稀釋疫苗后在25℃或37℃條件下放置0～4 h，病毒含量有所變化，但均符合說(shuō)明書(shū)中規(guī)定的效價(jià)。因此，為了防止疫苗病毒含量降低，應(yīng)優(yōu)先選用1%冷水魚(yú)明膠的生理鹽水作為稀釋液，如果免疫時(shí)沒(méi)有該稀釋液或配置不方便，可用PBS或生理鹽水代替，也可取得理想的結(jié)果。綜上所述，根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，基層單位在免疫時(shí)，應(yīng)優(yōu)先選用1%冷水魚(yú)明膠的生理鹽水作為稀釋液，疫苗稀釋后，在25℃或37℃條件下，應(yīng)于4 h內(nèi)完成免疫接種為宜。

PPR活疫苗病毒含量受多種因素（如保存時(shí)間、保存溫度、保護(hù)劑、稀釋液種類和pH值等）影響會(huì)降低。免疫接種時(shí)，為了保證疫苗質(zhì)量的有效性和穩(wěn)定性，疫苗稀釋后應(yīng)盡快使用。此外，也可采用其它保護(hù)措施，如全程冷鏈運(yùn)輸、疫苗凍干過(guò)程中加入耐熱保護(hù)劑、選用合適的稀釋液、接種時(shí)避免環(huán)境溫度過(guò)高等。

本文通過(guò)一系列試驗(yàn)，在不同稀釋液、不同溫度和不同放置時(shí)間的條件下，檢測(cè)并比較了2批PPR活疫苗的病毒含量，為免疫接種時(shí)疫苗的使用提供指導(dǎo)。

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Detection of Virus Content in Peste des Petits Ruminants Live Vaccine with Simulated Application Conditions

MIAO Shu-kui1,MI Xiao-yun1,LU Gui-li1,XIA Jun1,WEI Yu-rong1,WEI Jie1,WANG Yan2, MA Wen-ge1,WANG Ping1*,HUANG Jiong1*
（1.Institute of Veterinary Medicine（Research Center of Animal Clinical）, Xinjiang Acadamy of Animal Science,Urumqi 830011，China; 2.Tecon Biology Co.Ltd,Urumqi 830030,China）

To ensure the efficacy of PPR(Peste des petits ruminants,PPR)live vaccine in immunization,the virus content was detected and compared in PPR live vaccine at different dilution,temperature and time under the condition of practical application.The results showed that the normal saline contains 1%gelatin from cold water fish is more suitable for dilution of PPR vaccine after the dilution of the vaccine with PBS, normal saline contains 1%gelatin from cold water fish and normal saline.The immune effect of PPR live vaccine did not affected significantly by different dilution and temperature 25℃or 37℃within 4 h.

Simulated application condition;Detection;Peste-des-petits ruminants live vaccine;Virus content

S852.23

A

1003-6377（2017）04-0056-04

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD12B04）

苗書(shū)魁（1983-），男，助理研究員，理學(xué)碩士，從事動(dòng)物病毒分子生物學(xué)研究。E-mail：miaoshukui123@sina.com

汪萍（1979-），女，助理研究員，從事動(dòng)物疫病防控研究。E-mail：56307246@qq.com黃炯（1963-），男，研究員，從事重大動(dòng)物疫病研究及生物制品開(kāi)發(fā)。E-mail：jh124@163.com

2017-05-13，

2017-05-15