丁程程，李文芳，陳 萌，程 靜，榮 爽

(武漢科技大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，營養(yǎng)與食品衛(wèi)生系，武漢 430065)

油脂營養(yǎng)

植物甾醇酯對高脂膳食大鼠脂代謝影響及其機(jī)制研究

丁程程，李文芳，陳 萌，程 靜，榮 爽

(武漢科技大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，營養(yǎng)與食品衛(wèi)生系，武漢 430065)

為了研究植物甾醇酯(PSE)對高脂膳食大鼠肝臟脂代謝的作用及其機(jī)制，將42只雌性SD大鼠隨機(jī)均分為對照組、模型組和干預(yù)組，分別給予基礎(chǔ)飼料、高脂飼料和高脂加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% PSE飼料24周。監(jiān)測大鼠的體重；檢測血清脂蛋白的水平和肝臟脂質(zhì)水平；檢測血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)活性并對肝臟結(jié)構(gòu)進(jìn)行病理學(xué)觀察；分別用Real-time PCR和Western Blot的方法評估肝臟LXRα、CYP7A1、ABCA1、HMGCoA、FXR、SREBP-1c、 PPARγ、SIRT1 mRNA的表達(dá)水平以及PPARγ和SIRT1蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果表明，PSE降低了血清TC和LDL-C以及肝臟TC的水平，增加了血清HDL-C的水平(P<0.05)，改善了由高脂膳食導(dǎo)致的肝臟組織病理學(xué)改變，降低了血清ALT和AST的水平(P<0.05)。PSE增加了肝臟SIRT1 mRNA的表達(dá)，減少了CYP7A1 mRNA和PPARγmRNA以及PPARγ蛋白的表達(dá)(P<0.05)，對LXRα、ABCA1、HMGCoA、FXR和SREBP-1c mRNA的表達(dá)以及SIRT1蛋白的表達(dá)沒有顯著作用。

植物甾醇酯；高脂膳食大鼠；降脂；CYP7A1；PPARγ；SIRT1

高脂血癥是一種以血漿脂質(zhì)升高、高膽固醇和高甘油三酯為特征的多相異質(zhì)性疾病[1]，是心血管疾病的主要致病因素，促進(jìn)動脈粥樣硬化的形成，增加中風(fēng)和其他心臟和血管疾病的風(fēng)險[2]。盡管有一系列降脂藥用于管理高脂血癥，但并不能使低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)維持在正常水平[3]，且有許多副作用，如他汀類藥物[4]。因此，探索調(diào)節(jié)高脂膳食所帶來的脂代謝紊亂的非藥物策略極具意義。

植物甾醇(PS)是一類存在于植物油及其脫臭餾出物中的天然化合物。植物甾醇酯(PSE)由PS和脂肪酸結(jié)合而成，酯化之后的吸收率和生物功能顯著提高[5]。植物甾醇/植物甾烷醇對血脂作用的系統(tǒng)性評價顯示[6]，攝入植物甾醇/植物甾烷醇(1.5～3.0 g/d)能夠顯著降低人體總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和LDL-C的水平，而對高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的水平無影響。Demonty等[7]對84個隨機(jī)對照實驗進(jìn)行Meta分析，發(fā)現(xiàn)平均每天攝入2.15 g的PSE，能使LDL-C減少0.34 mmol/L或8.8%，基礎(chǔ)LDL-C濃度較高者，PSE對LDL-C的降低作用更明顯。關(guān)于PS/PSE降脂機(jī)制的研究較多，主要涉及抑制膽固醇合成、促進(jìn)脂肪酸的合成、促進(jìn)膽固醇外流以及促進(jìn)膽汁酸排泄幾個方面，但是并未得出一致的結(jié)論，故本文對高脂膳食大鼠進(jìn)行PSE干預(yù)，探索其降脂機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

清潔級12月齡雌性SD大鼠80只，體重300～400 g，由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供。

1.1.2 實驗試劑

植物甾醇酯(巴斯夫公司)；總膽固醇測試盒、甘油三酯測試盒、高密度脂蛋白膽固醇測試盒(中生北控生物科技股份有限公司)；考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)定量測試盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶測試盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶測試盒(南京建成生物工程研究所)；無酶水(日本TaKaRa公司);組織裂解液、cDNA合成試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)；所有引物(武漢天一輝遠(yuǎn))；BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；聚乙二烯二氟化物膜(美國Millipore公司)；抗PPAR-γ單克隆抗體、抗β-actin單克隆抗體、二抗抗體(美國Santa Cruz公司)，抗SIRT1單克隆抗體(英國Abcam公司)；Super Signal West Durao發(fā)光液、Super Signal West Pico發(fā)光液(英國GE公司)。

1.1.3 實驗儀器

Epoch酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；Bio-Rad CFX Manager Real-time PCR、凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Lab公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組

將80只大鼠在溫度(24±1)℃，相對濕度(55±10)%，晝夜交替(08:00～20:00)的環(huán)境下，每籠5只，自由進(jìn)食進(jìn)水，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。篩選實驗動物，剔除血脂水平異常及患有慢性呼吸性疾病和腫瘤的動物。將剩余的42只大鼠隨機(jī)均分為3組，分別為對照組、模型組和干預(yù)組，分別給予普通飼料，高脂飼料(5%蛋黃粉、10%豬油、2%膽固醇、0.3%膽鹽、0.2%丙基硫氧嘧啶、82.5%基礎(chǔ)飼料)和含2%PSE的高脂飼料喂養(yǎng)24周，期間每周稱重。實驗結(jié)束后，禁食12 h，采血并離心取血清，-80℃冷凍保存。每組隨機(jī)選取4只大鼠用4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注，分離肝臟，浸泡于4%多聚甲醛溶液中。剩余大鼠快速分離肝臟，稱重并-80℃冷凍保存。肝臟系數(shù)= 肝臟濕重/體重×100%。

1.2.2 血清及肝臟脂質(zhì)水平的檢測

嚴(yán)格按照試劑盒的說明書檢測血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C的水平。制備肝臟組織勻漿，離心取上清，用試劑盒檢測其TC、TG含量。

1.2.3 肝臟組織病理學(xué)的檢測

將浸泡在4%多聚甲醛溶液中的肝臟組織進(jìn)行石蠟包埋，切片并進(jìn)行蘇木-伊紅(H&E)染色，通過顯微鏡觀察肝臟的組織病理學(xué)變化。

1.2.4 肝功能的檢測

按照說明書的方法檢測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活性。

1.2.5 Real-time PCR分析

檢測肝臟LXRα、CYP7A1、ABCA1、HMGCoA、FXR、SREBP-1c、PPARγ和SIRT1 mRNA的表達(dá)水平，目的基因用β-actin。肝臟組織用Tizol Reagent提取和分離總mRNA，再用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)化為互補(bǔ)的DNA(cDNA)。加入引物(序列見表1)和Taq聚合酶，放入Bio-Rad CFX Manager Real-time PCR儀進(jìn)行定量分析。

表1 用于Real-time PCR的引物序列

1.2.6 Western Blot分析

稱取約100 mg組織(按組織與裂解液質(zhì)量體積比為1∶4)加入400 μL裂解液，充分勻漿，直到看不到明顯的組織塊，冰浴25 min。收集裂解液，4℃下14 000 r/min離心10 min，取上清，測定總蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)在12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離，且用半干轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚乙二烯二氟化物膜中。將膜放入有Tween-20的5%脫脂牛奶(TTBS)中封閉1 h，然后放入包含一抗抗體的TTBS 中孵1 h，再放入稀釋的二抗中孵1 h。取膜，加入Super Signal West Durao和Super Signal West Pico(體積比1∶1)混合發(fā)光液，反應(yīng)30 s后，用凝膠成像分析系統(tǒng)對條帶進(jìn)行成像和分析。

1.2.7 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。各組均值用SPSS17.0 軟件ANOVA法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。P<0.05 時認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 體重及肝臟系數(shù)

各組大鼠的體重及肝臟系數(shù)的變化分別見表2、表3。由表2可知，在實驗中各組大鼠的體重變化均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。由表3可知，與對照組相比，模型組大鼠的肝臟系數(shù)明顯增加(P<0.05)，干預(yù)組大鼠與模型組的肝臟系數(shù)相比，顯著減小(P<0.05)，但與對照組相比，差異無顯著性(P>0.05)。這表明PSE膳食干預(yù)改善了高脂膳食誘導(dǎo)的大鼠肝臟系數(shù)的增加，且改善至接近對照組大鼠的水平。

表2 各組大鼠體重變化 g

續(xù)表2

g

注：第2周和第24周為采血周，為了排除禁食對大鼠體重的影響，體重不作記錄。

表3 各組大鼠肝臟系數(shù)

注：a表示與對照組相比差異有顯著性(P<0.05)；b表示與模型組相比差異有顯著性(P<0.05)。下同。

2.2 PSE改善脂代謝紊亂

2.2.1血清脂質(zhì)水平

實驗前后各組大鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的水平變化見表4。由表4可知，0周時，各組大鼠的血脂水平均無顯著性差異(P>0.05)；24周時，模型組大鼠血清TC和LDL-C的水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，PSE干預(yù)能夠顯著降低血清TC和LDL-C的水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；此外，與對照組相比，模型組血清HDL-C水平顯著降低(P<0.05)，而給予PSE干預(yù)后血清HDL-C的水平與模型組相比顯著升高(P<0.05)，且升高至與對照組的HDL-C水平相近的水平(P>0.05)。

表4 實驗前后各組大鼠血清TC、TG、LDL-C和 HDL-C的水平變化 mmol/L

2.2.2 肝臟TC、TG的水平

各組大鼠肝臟TC、TG的水平見表5。由表5可見，與對照組相比，模型組大鼠肝臟的TC含量明顯增加，且差異有顯著性(P<0.05)；干預(yù)組大鼠肝臟TC的水平與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)。TG的水平各組之間無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果表明，膳食添加PSE可以有效減少高脂膳食導(dǎo)致的肝臟的脂肪積累，使TC水平恢復(fù)至接近對照組水平，而對TG水平未產(chǎn)生顯著影響。

表5 各組大鼠肝臟TC、TG的水平 mmol/L

2.3 PSE對肝臟病理損傷的保護(hù)作用

2.3.1 PSE緩解肝臟組織病理學(xué)變化(見圖1)

由圖1可見，對照組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，邊界清晰，呈多邊形，且無空泡，以中央靜脈為軸心呈放射狀排列的肝索清晰可見；模型組大鼠肝臟細(xì)胞堆積大量的脂滴，可見大量近似圓形的空泡，且中央靜脈出現(xiàn)明顯的脂肪變性，肝索結(jié)構(gòu)消失；而干預(yù)組脂滴小而分散，中央靜脈沒有明顯的病變，且可見放射狀肝索。這表示PSE的干預(yù)減少了脂肪在肝臟的積累，緩解了中央靜脈的脂肪變性并使肝索結(jié)構(gòu)恢復(fù)，減少肝臟損傷。

圖1 各組大鼠肝臟的病理切片(H&E 400×)

2.3.2 PSE降低血清轉(zhuǎn)氨酶的活性

各組大鼠血清ALT和AST的活性見表6。

表6 各組大鼠血清ALT和AST的活力 U/L

由表6可知，模型組大鼠血清的ALT、AST活性顯著高于對照組，而干預(yù)組組二者活性均有所下降，與模型組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與對照組相比差異無顯著性(P>0.05)，由此可認(rèn)為PSE的干預(yù)緩解了高脂膳食引起的肝功能損傷。

2.4 PSE對脂代謝相關(guān)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

2.4.1 Real-time PCR 分析

分析肝臟LXRα、CYP7A1、ABCA1、HMGCoA、FXR、SREBP-1c、PPARγ和SIRT1 mRNA的表達(dá)，結(jié)果見圖2。由圖2可知，模型組大鼠肝臟的CYP7A1和PPARγmRNA的表達(dá)水平與對照組相比顯著升高(圖2B和圖2G)，干預(yù)組與模型組相比其表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，干預(yù)組與對照組相比無顯著性差異，表明PSE的干預(yù)能夠有效下調(diào)高脂膳食誘導(dǎo)的肝臟CYP7A1和PPARγmRNA表達(dá)，且下調(diào)至接近對照組的水平；另外，高脂膳食(模型組)抑制了大鼠肝臟SIRT1的表達(dá)(圖2H)，與對照組相比差異顯著(P<0.05)，干預(yù)組大鼠肝臟SIRT1 mRNA的表達(dá)水平顯著高于模型組大鼠的(P<0.05)，與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明高脂膳食抑制了大鼠肝臟SIRT1 mRNA的表達(dá)，而PSE能夠逆轉(zhuǎn)這一變化；高脂膳食對LXRα、ABCA1、HMGCoA、FXR、SREBP-1c mRNA的表達(dá)沒有明顯影響(圖2A、圖2C、圖2D、圖2E、圖2F)，PSE的干預(yù)對其表達(dá)水平也未見顯著影響(P>0.05)。

2.4.2 Western Blot分析

采用免疫印跡的方法對大鼠肝臟PPARγ和SIRT1蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行評估，結(jié)果見圖3。模型組與對照組相比，PPARγ的表達(dá)增加(見圖3A)，干預(yù)組與模型組相比水平降低，差異均有顯著性(P<0.05)，干預(yù)組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明攝入PSE能夠下調(diào)PPARγ蛋白的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)高脂膳食引起的變化，與基因表達(dá)結(jié)果一致。在肝臟SIRT1蛋白的表達(dá)水平上，各組之間均沒有顯著的差異，但其表達(dá)趨勢與基因表達(dá)一致(見圖3B)。

圖3 肝臟PPARγ和SIRT1蛋白表達(dá)水平

3 討 論

相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)結(jié)果表明，膳食補(bǔ)充PSE逆轉(zhuǎn)了高脂膳食誘導(dǎo)的CYP7A1 mRNA表達(dá)水平的增加，這與Batta等[8]對豆甾醇的研究結(jié)果一致，并使其恢復(fù)至對照組水平。CYP7A1是膽汁酸經(jīng)典合成途徑中第一步，即膽固醇轉(zhuǎn)化為羥基膽固醇(7α-hydroxycholesterol, 7α-HOC)的催化劑，是膽汁酸合成的限速酶[9]。大鼠肝臟CYP7A1 mRNA的表達(dá)下降，可能是PSE干預(yù)后體內(nèi)膽固醇水平下降所致。高脂膳食大鼠肝臟PPARγmRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平增加，PSE膳食干預(yù)改善了這一變化。PPARγ參與調(diào)控脂代謝的多個環(huán)節(jié)，研究表明PPARγ經(jīng)配體活化后，能激活促進(jìn)脂肪酸儲存相關(guān)基因的表達(dá)，如脂肪酸轉(zhuǎn)移蛋白、脂肪酸結(jié)合蛋白和脂蛋白脂酶；與此同時，還能抑制促進(jìn)脂肪酸釋放相關(guān)基因的表達(dá)，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)[10]。故PSE改善脂質(zhì)水平紊亂的機(jī)制可能是調(diào)節(jié)PPARγ的表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸合成，減少膽固醇堆積。另外，攝入PSE改善了高脂膳食引起的大鼠肝臟SIRT1 mRNA表達(dá)的減少，在其蛋白質(zhì)的表達(dá)上未見影響。已證實，SIRT1對PPARγ有抑制作用，并因此能夠增加脂質(zhì)分解，減少脂質(zhì)的生成[11]。表明PSE可能是通過上調(diào)SIRT1間接抑制PPARγ的表達(dá)來發(fā)揮降脂作用的。實驗結(jié)果可見，高脂膳食和PSE膳食補(bǔ)充均未對LXRα、ABCA1、HMGCoA、FXR和SREBP-1c mRNA的表達(dá)產(chǎn)生顯著的影響。這與已有的一些研究結(jié)果不完全一致，但在基因的表達(dá)趨勢上結(jié)果一致。如麥角甾醇被證實是LXR的激活劑[12]，LXRs調(diào)節(jié)SREBP-1c的表達(dá)，SREBP-1c是一種調(diào)節(jié)脂肪酸生物合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄因子[13]；膳食補(bǔ)充PSE有上調(diào)ABCA1的表達(dá)趨勢[14]，促進(jìn)膽固醇外流；豆甾醇喂食大鼠時，抑制了肝臟HMGCR的表達(dá)[8]，減少膽固醇合成；FXR具有調(diào)節(jié)膽汁酸和脂質(zhì)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用[15]，研究表明，豆甾醇是FXR的強(qiáng)拮抗劑[16]。不一致可能是因為干預(yù)物、干預(yù)劑量、動物種類和干預(yù)時長等不一樣造成的。

4 結(jié) 論

本研究探索了攝入植物甾醇酯(PSE)對高脂膳食誘導(dǎo)的脂質(zhì)水平紊亂的改善作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制。實驗過程中各組大鼠的體重變化均沒有顯著差異，PSE在肝臟系數(shù)方面表現(xiàn)出顯著的改善作用。與模型組相比，攝入PSE的干預(yù)組大鼠血清TC和LDL-C的水平以及肝臟TC的含量顯著降低，血清HDL-C水平顯著增加。飲食加入PSE減少了肝臟細(xì)胞中脂肪的堆積，緩解了中央靜脈的脂肪變性并使肝索結(jié)構(gòu)恢復(fù)。干預(yù)組大鼠血清的ALT和AST活性明顯低于模型組大鼠，接近對照組大鼠的水平。膳食補(bǔ)充PSE逆轉(zhuǎn)了高脂膳食誘導(dǎo)的CYP7A1 mRNA表達(dá)水平的增加，并使其恢復(fù)至對照組水平。高脂膳食大鼠肝臟PPARγmRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平增加，PSE膳食干預(yù)改善了這一變化。另外，攝入PSE改善了高脂膳食引起的大鼠肝臟SIRT1 mRNA表達(dá)的減少，在其蛋白質(zhì)的表達(dá)上未見影響。實驗結(jié)果可見，高脂膳食和PSE膳食補(bǔ)充均未對LXRα、ABCA1、HMGCoA、FXR、SREBP-1c mRNA的表達(dá)產(chǎn)生顯著的影響。

綜上所述，PSE的降脂效果顯著，可能是通過下調(diào)PPARγ的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)脂肪酸合成，減少膽固醇堆積，同時上調(diào)SIRT1的表達(dá)，間接抑制PPARγ的表達(dá)而起作用的。

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Effect of phytosterol ester on lipid metabolism of rats fed a high fat diet and its mechanism

DING Chengcheng, LI Wenfang, CHEN Meng,CHENG Jing, RONG Shuang

(Department of Nutrition and Food Hygiene, School of Public health, Wuhan University of Science and Technology, Wuhan 430065, China)

The effect of phytosterol ester(PSE) on lipid metabolism of rats fed a high fat diet and its mechanism were investigated. 42 female SD rats were randomly divided into a control group, a model group and an intervening group, fed with basic feed, high fat diet (HFD) and HFD with 2% PSE respectively for 24 weeks. The changes of weight were monitored, the levels of lipoprotein in serum and liver were measured, the activities of ALT and AST in serum were determined and the pathological changes of the liver were observed. The mRNA expressions of LXRα, CYP7A1, ABCA1, HMGCoA, FXR, SREBP-1c, PPARγand SIRT1 were measured by Real-time PCR and Western Blot. The results showed that PSE significantly lowered serum TC, LDL-C and liver TC level，increased serum HDL-C level (P<0.05), attenuated HFD-induced histopathological changes of liver and reduced the serum ALT and AST activity (P<0.05). PSE had no effect on the mRNA level of LXRα, ABCA1, HMGCoA, FXR and SREBP-1c and protein level of SIRT1, but PSE increased SIRT1 mRNA in liver and decreased CYP7A1 mRNA. Most importantly, PSE decreased not only the protein expression of PPARγbut also expression of PPARγmRNA.

phytosterol ester; high fat diet rat; lipid-lowering; CYP7A1; PPARγ; SIRT1

2016-10-11；

2017-01-23

2013年BASF國際健康研究基金項目(亞洲)

丁程程(1992)，女，碩士研究生，研究方向為營養(yǎng)與健康、食品安全評價(E-mail)811255158@qq.com。

榮 爽，副教授，博士(E-mail)moment-88@163.com。

TQ645.9; Q591.5

A

1003-7969(2017)06-0071-07