杜英俠,李晶瑩,傅敏,張鑫,曲春強,李小藝,張菊林,顧穎,王選駿,付晚濤、5

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,遼寧大連116023;2.大連海洋大學(xué)海洋科技與環(huán)境學(xué)院,遼寧大連116023;3.大連市長?？h漁政管理所,遼寧大連116500;4.大連市海監(jiān)漁政局,遼寧大連116001;5.遼寧省高校近岸海洋環(huán)境科學(xué)與技術(shù)重點實驗室,遼寧大連116023)

一株海綿放線菌的分離培養(yǎng)、發(fā)酵條件優(yōu)化及其抑制弧菌效果

杜英俠1,李晶瑩2,傅敏2,張鑫2,曲春強2,李小藝2,張菊林2,顧穎3,王選駿4,付晚濤2、5

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,遼寧大連116023;2.大連海洋大學(xué)海洋科技與環(huán)境學(xué)院,遼寧大連116023;3.大連市長?？h漁政管理所,遼寧大連116500;4.大連市海監(jiān)漁政局,遼寧大連116001;5.遼寧省高校近岸海洋環(huán)境科學(xué)與技術(shù)重點實驗室,遼寧大連116023)

為研究放線菌對海水養(yǎng)殖病原弧菌(哈維弧菌Vibrio harveyi和燦爛弧菌Vibrio splendidus)的抑制效果,從繁茂膜海綿Hymeniacidon perlevis中分離篩選出了一株具有抑菌活性的放線菌(FH),并采用16S rDNA基因序列進行分析,初步鑒定為球孢鏈霉菌Streptomyces globisporus;以抑菌活性為導(dǎo)向?qū)Ψ啪€菌FH菌株的發(fā)酵條件進行優(yōu)化,并通過測量發(fā)酵沉淀菌絲體干質(zhì)量,獲得了FH菌株生長曲線,同時研究了發(fā)酵產(chǎn)物保存溫度及時間對抑菌效果的影響,以及FH發(fā)酵產(chǎn)物在滅菌海水中對弧菌的抑制作用。結(jié)果表明：對FH菌株生長曲線測定結(jié)果顯示,0～15 h為適應(yīng)期,15～72 h為指數(shù)生長期,72～120 h為穩(wěn)定期,120 h后為衰亡期;抑制弧菌效果試驗顯示,FH菌株發(fā)酵正交試驗的最優(yōu)條件為溫度25℃、pH 7.5、裝液量30 mL(250 mL三角瓶);在正交試驗最優(yōu)條件下,FH菌株發(fā)酵培養(yǎng)72 h獲得的粗提物抑制哈維弧菌和燦爛弧菌的效果最好;FH菌株發(fā)酵粗提物在4℃和-20℃下保存60 d和在室溫保存7 d,其抑菌效果無顯著性差異(P＞0.05);在100 mL滅菌海水中,FH菌株發(fā)酵產(chǎn)物2 mL可有效抑制哈維弧菌和燦爛弧菌的繁殖。研究表明,海綿放線菌及其發(fā)酵產(chǎn)物在海水養(yǎng)殖領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價值。

海綿放線菌;弧菌;發(fā)酵條件優(yōu)化

弧菌是海水養(yǎng)殖中最常見的一類條件致病菌,已成為海水養(yǎng)殖動物的主要病原菌之一[1]。哈維弧菌Vibrio harveyi能感染多數(shù)海水魚類和對蝦[2-3],如鱸的出血病,引發(fā)死亡率高達50%以上,嚴重時可達80%～100%[4-6]。燦爛弧菌Vibrio splendidus是引起刺參腐皮綜合征的主要病原菌之一,死亡率高達90%以上,也是大菱鲆、鱸等海水魚類的重要致病菌之一[7-8]。目前,控制水產(chǎn)動物疾病的主要手段仍是藥物治療,而大部分漁用藥物多是移用獸藥、農(nóng)藥,較難滿足水產(chǎn)病害防控需求,因此,開發(fā)水產(chǎn)專用藥物已迫在眉睫[9]。

放線菌是一大類有益次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)者,具有抗細菌、抗真菌等多種生物活性[10]。海洋放線菌由于所處生態(tài)環(huán)境的特異性,能夠產(chǎn)生不同于陸生微生物的結(jié)構(gòu)新穎的次級代謝產(chǎn)物[11],因此,受到人們的廣泛關(guān)注。海綿是一種簡單古老的多細胞動物,能產(chǎn)生比其他海洋生物更加豐富的生物活性產(chǎn)物,從海洋中分離出的活性化合物約40%來自海綿[12]。同時,海綿也是海洋放線菌最重要的一種共附生動物,其體內(nèi)的微生物可占海綿總生物量的50%～60%[13-14],是目前新型天然活性化合物的重要來源之一。

近年來,對海洋放線菌在抑菌方面的研究[15]較多。本研究中,從繁茂膜海綿Hymeniacidon perlevis中分離篩選出了若干海綿放線菌,并將其中一株具有抑菌活性的海綿放線菌命名為FH菌株,對FH菌株進行了發(fā)酵條件優(yōu)化、生長曲線測定以及發(fā)酵產(chǎn)物對海水養(yǎng)殖病原菌的抑菌試驗,為后續(xù)研究工作奠定了基礎(chǔ),也為進一步開發(fā)海水養(yǎng)殖專用抑菌藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 海水、培養(yǎng)基 試驗用海水取自大連海洋大學(xué)沙濾罐過濾海水。沙濾海水在110℃下滅菌15 min制備成滅菌海水。所用試劑無特別標注,均為分析純試劑。

(1)放線菌分離培養(yǎng)基[16]。包含甘油6 mL、精氨酸1 g、K2HPO4·3H2O 1 g、NaCl 20 g、Mg-SO4·7H2O 0.5 g、瓊脂粉18 g、蒸餾水1000 mL, pH 7.4,再加入終濃度為15 mg/L的萘啶酮酸和50 mg/L的重鉻酸鉀。

(2)國際鏈霉菌計劃培養(yǎng)基2(International Streptomyces Project medium 2,ISP2)液體培養(yǎng)基。包含酵母浸出粉4 g、麥芽提取物10 g、葡萄糖4 g、陳海水1000 mL,pH 7.4。

(3)改良高氏一號瓊脂培養(yǎng)基[16]。包含可溶性淀粉20 g、KNO31 g、NaCl 0.5 g、K2HPO40.5 g、MgSO40.5 g、FeSO40.01 g、瓊脂18.0 g、蒸餾水1 L,pH 7.2～7.4。

(4)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。包含蛋白胨10 g、NaCl 5 g、牛肉膏粉3 g、瓊脂18 g、陳海水1000 mL,pH 7.2～7.4。

1.1.2 海綿、指示弧菌 繁茂膜海綿采自大連市黑石礁海域潮間帶,0.5 h內(nèi)帶回實驗室。指示弧菌——哈維弧菌Vibrio harveyi、燦爛弧菌Vibrio splendidus,均取自大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室。

1.2 方法

1.2.1 海綿放線菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察 采集新鮮繁茂膜海綿,用無菌海水沖洗多遍,去除表面附著物,在無菌研缽中研磨成漿,并加入10倍體積的滅菌海水浸泡[16],用無菌紗布過濾,在放線菌分離培養(yǎng)基上平板涂布,于28℃下倒置培養(yǎng)7～10 d。從放線菌分離培養(yǎng)基上挑取海綿放線菌單菌落,在改良高氏一號培養(yǎng)基上劃線純化,純化后的海綿放線菌菌株用20%甘油作為保護劑,于-80℃下冷凍保存。

將海綿放線菌在改良高氏一號培養(yǎng)基上于28℃下培養(yǎng)7 d,觀察菌落的顏色、形態(tài),有無可溶性色素等,菌株形態(tài)觀察在光學(xué)顯微鏡下進行。

1.2.2 海綿放線菌FH的16S rDNA分子鑒定

(1)將從海綿中分離篩選出的一株FH單菌落接入裝有5 mL滅菌ISP2液體培養(yǎng)基的試管中,在恒溫振蕩培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司,THZ_ 98AB)中30℃下培養(yǎng)2～3 d。

(2)用1.5 mL Tube管收集1 mL上述培養(yǎng)液,按照MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒(TaKaRa)說明書,提取此株放線菌基因組DNA。

(3)按照TaqTM試劑盒(TaKaRa)說明書,以提取的基因組DNA為模板,根據(jù)信艷娟等[17]PCR反應(yīng)條件,在PCR儀(Applied Biosystems,2720 Thermal Cycler)上擴增此株放線菌的16S rDNA片段。

(4)將16S rDNA擴增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序結(jié)果在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對。

1.2.3 FH菌株的培養(yǎng)與無菌發(fā)酵粗提物的制備

(1)菌株活化。將-80℃下保存的FH菌株接種到改良高氏一號瓊脂培養(yǎng)基上,于28℃培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司,LRH-150)中倒置培養(yǎng)5～7 d,然后挑取單菌落在改良高氏一號瓊脂培養(yǎng)基上兩次劃線接種,使菌株恢復(fù)健壯狀態(tài)用于試驗。

(2)搖瓶發(fā)酵。挑取恢復(fù)健壯狀態(tài)的FH單菌落,接種到裝有30 mL滅菌ISP2液體培養(yǎng)基的三角瓶中,在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中以120 r/min培養(yǎng)5 d。

(3)無菌發(fā)酵粗提物制備。從搖瓶中取FH菌株發(fā)酵液30 mL,在低速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司,L535-1)中,以4000 r/min離心10 min,離心后的上清液用0.22 μm濾膜過濾除菌,然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠,RE-52CS)中濃縮至原液體積的1/10,制成FH菌株的無菌發(fā)酵粗提物(簡稱發(fā)酵粗提物),于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 FH菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件的正交試驗 參考放線菌發(fā)酵條件優(yōu)化研究結(jié)果[18-22],設(shè)計FH菌株發(fā)酵條件的正交試驗L9(34),試驗因素水平見表1。在恒溫培養(yǎng)箱中,每個250 mL錐形瓶中裝有一定量的菌液,在轉(zhuǎn)速120 r/min條件下培養(yǎng)5 d,制成無菌發(fā)酵粗提物。然后,采用瓊脂打孔法[23],使用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板進行抑菌試驗,分別以哈維弧菌、燦爛弧菌作為指示菌,使用慶大霉素(0.25 mg/L)作為陽性對照,觀察在30℃下培養(yǎng)24 h時的抑菌結(jié)果。以抑菌圈直徑為指標,判斷發(fā)酵粗提物抑菌活性的大小,考察發(fā)酵培養(yǎng)條件對FH菌株發(fā)酵粗提物抑菌效果的影響。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)條件的正交試驗因素及水平Tab.1 Factors and levels of fermentation culture conditions in an orthogonal test

1.2.5 發(fā)酵時間對FH菌株發(fā)酵粗提物抑菌效果的影響 在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中放置裝有FH菌液的27個250 mL三角瓶,在正交試驗最優(yōu)條件下培養(yǎng),分別在15、24、48、72、120、168、216、264、312 h時取出3個三角瓶做平行試驗,以4000 r/min離心10 min。取菌絲體沉淀烘干至恒重并稱量,以時間為橫坐標,菌絲體干質(zhì)量為縱坐標,繪制FH菌株在該條件下的生長曲線。同時,取上清液制備發(fā)酵粗提物并進行抑菌試驗。同樣采用瓊脂打孔法、使用慶大霉素(0.25 mg/L)作為陽性對照,以上述2株弧菌為指示菌,根據(jù)抑菌圈直徑判斷活性大小,考察發(fā)酵時間對FH菌株發(fā)酵粗提物抑菌效果的影響。

1.2.6 FH菌株發(fā)酵粗提物的存放溫度和時間對抑菌效果的影響 在最優(yōu)正交試驗和發(fā)酵時間條件(稱為最佳發(fā)酵條件)下,制得FH菌株發(fā)酵粗提物并分成3份,分別于室溫、4℃、-20℃下保存,分別考察發(fā)酵粗提物的存放溫度及存放時間(0、7、30、60 d)對指示弧菌抑菌效果的影響。

1.2.7 滅菌海水中FH菌株發(fā)酵產(chǎn)物抑制弧菌的效果 在最佳發(fā)酵條件下培養(yǎng)FH菌株,發(fā)酵液以4000 r/min離心10 min,取上清液通過0.22 μm濾膜過濾除菌,獲得FH發(fā)酵產(chǎn)物。將哈維弧菌制成菌懸液,接入裝有9個100 mL滅菌海水的三角瓶中,監(jiān)測指示弧菌初始濃度。其中3個三角瓶分別加入2 mL滅菌海水,作為空白對照組;另外3個三角瓶中分別加入1 mL滅菌海水和1 mL發(fā)酵產(chǎn)物,作為試驗組1;剩余3個三角瓶中分別加入2 mL發(fā)酵產(chǎn)物,作為試驗組2。將上述9個三角瓶放入恒溫培養(yǎng)箱中30℃下培養(yǎng),分別在0、6、12、24、48 h各取海水1 mL,用滅菌海水10倍體積稀釋后,用TCBS瓊脂平板涂布,在培養(yǎng)箱中30℃下培養(yǎng)48 h,用菌落計數(shù)海水中弧菌密度。對燦爛弧菌的抑菌試驗,除了指示弧菌不同之外,其他條件及過程與抑制哈維弧菌試驗均相同。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20軟件進行方差分析,用t檢驗進行組間多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 FH菌株的形態(tài)特征

FH菌株在改良高氏一號培養(yǎng)基上生長良好,氣生菌絲發(fā)達,菌落呈米色,產(chǎn)生淺咖啡色可溶性色素。在光學(xué)顯微鏡下觀察,其孢子絲呈直線、彎曲狀、分支多且長(圖1)。

圖1 FH菌株在顯微鏡下的形態(tài)(400×)Fig.1 Morphology of the sponge-associated actinobacterium FH under a microscope(400×)

2.2 FH菌株的16S rDNA分子鑒定

結(jié)合FH菌株形態(tài)特征,通過PCR反應(yīng)和測序,獲得FH菌株16S rDNA部分序列1325 bp,并在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行序列比對,發(fā)現(xiàn)該序列同鏈霉菌屬的球孢鏈霉菌相似性達到99.6%,初步鑒定FH菌株為球孢鏈霉菌Streptomyces globisporus。

2.3 FH菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件的正交試驗

采用ISP2液體培養(yǎng)基,用空列(D)的極差R值作為誤差界限,按照正交設(shè)計安排發(fā)酵培養(yǎng)FH菌株制備獲得的發(fā)酵粗提物的抑制效果見表2。根據(jù)極差R值的大小,采用直觀分析法,判斷發(fā)酵培養(yǎng)條件對FH菌株發(fā)酵粗提物抑菌效果的影響強弱均為溫度＞pH＞裝液量(表2)。上述3個因素的R值均大于空列R值,因此,各因素的效應(yīng)可靠[24]。由表2極差分析可得,以對哈維弧菌和燦爛弧菌產(chǎn)生的抑菌圈為考察指標,FH菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件的最優(yōu)組合均為A2B1C3,即溫度為25℃、pH為7.5、裝液量為30 mL。

表2 正交試驗設(shè)計及試驗結(jié)果Tab.2 Design and results in the orthogonal test

2.4 發(fā)酵時間對FH菌株發(fā)酵粗提物抑菌效果的影響

2.4.1 FH菌株生長曲線 由圖2可見：在正交試驗最優(yōu)條件下(溫度25℃、pH 7.5、裝液量30 mL),接種到ISP2培養(yǎng)液后,FH菌株呈典型指數(shù)生長特征,并且適應(yīng)期很短,指數(shù)生長階段從15 h持續(xù)至72 h,對應(yīng)的FH菌株的菌絲干質(zhì)量從(0.018±0.002)g增加至(0.104±0.005)g,此階段的比生長速率為0.085/h;72 h～120 h時,FH菌株進入穩(wěn)定期,120 h之后FH菌株進入衰亡期。2.4.2 發(fā)酵時間對FH菌株發(fā)酵粗提物抑菌效果的影響 由圖3可見：在正交試驗最優(yōu)條件下(溫度25℃、pH 7.5、裝液量30 mL),72～168 h,時FH發(fā)酵粗提物對哈維弧菌顯現(xiàn)出較好的抑菌效果,此時間段試驗組平均抑菌圈直徑為(24.56±0.51)mm,比陽性對照組大8.23 mm;72 h時,FH發(fā)酵粗提物抑制哈維弧菌效果最好,其最大抑菌圈直徑為25.00 mm。

圖2 FH菌株的生長曲線Fig.2 Growth curve of sponge-associated actinobacterium FH

圖3 無菌發(fā)酵粗提物對哈維弧菌的抑菌效果Fig.3 Antibacterial effect of sterile crude extracts from fermented liquid on Vibrio harveyi

由圖4可見：FH菌株發(fā)酵粗提物在15～72 h時,對燦爛弧菌呈現(xiàn)一定的抑菌效果;在72 h時,FH發(fā)酵粗提物對燦爛弧菌的抑制效果最好,其抑菌圈直徑最大,為(24.67±1.53)mm,比此時陽性對照組大5.67 mm。盡管FH菌株無菌發(fā)酵粗提物對2株指示弧菌均產(chǎn)生了抑菌作用,但其對每種指示弧菌的抑菌效果差異較大,并且FH菌株發(fā)酵時間不同,其發(fā)酵粗提物對2株指示弧菌的抑菌效果也相差較大。

2.5 保存溫度和時間對FH菌株發(fā)酵粗提物抑菌效果的影響

由表3可見：與0 d抑菌效果比較,保存在4℃和-20℃下的FH菌株發(fā)酵粗提物在60 d內(nèi)對2株指示弧菌抑菌效果均無顯著性差異(P＞0.05);在室溫條件下,保存7 d的FH菌株發(fā)酵粗提物對2株指示弧菌抑菌效果無顯著性差異(P＞0.05),保存30 d的發(fā)酵粗提物盡管還有抑菌效果,但其抑菌圈直徑僅略高于陽性對照組,保存60 d的FH發(fā)酵粗提物對2株指示弧菌抑菌效果均顯著降低(P＜0.05),且明顯低于陽性對照組。

圖4 無菌發(fā)酵粗提物對燦爛弧菌的抑菌效果Fig.4 An antibacterial effect of sterile crude extracts from fermented liquid on Vibrio splendidus

表3 不同的保存溫度和時間對無菌發(fā)酵粗提物抑菌活性的影響Tab.3 Impacts of different storage temperature and time on the antibacterial effect of sterile crude extracts from fermented liquid

2.6 滅菌海水中FH菌株發(fā)酵產(chǎn)物抑制指示弧菌的效果

在最佳發(fā)酵條件下獲得的FH菌株發(fā)酵產(chǎn)物分別抑制2株指示弧菌的試驗結(jié)果見圖5、圖6。

在100 mL滅菌海水中,接種哈維弧菌初始密度為(1.4±0.1)×103CFU/mL。未添加發(fā)酵產(chǎn)物的對照組中,哈維弧菌也呈指數(shù)生長特征,在12 h時進入指數(shù)生長階段,此時哈維弧菌密度為(40.0±1.4)×103CFU/mL,在24和48 h時仍然處于指數(shù)生長階段,對應(yīng)哈維弧菌密度分別為(705.0± 106.1)×103、(2610.0±200.7)×103CFU/mL。在添加1 mL發(fā)酵產(chǎn)物的試驗組1中,哈維弧菌在12 h時進入指數(shù)生長階段,此時弧菌密度為(110.2± 53.4)×103CFU/mL,在24 h時進入平臺期,弧菌密度為(1400.0±42.4)×103CFU/mL,高于對照組24 h弧菌密度98.6%,這可能是發(fā)酵產(chǎn)物中的營養(yǎng)物質(zhì)促進了哈維弧菌生長所致。在添加2 mL發(fā)酵產(chǎn)物的試驗組2中,24 h時哈維弧菌密度為(41.0±24.0)×103CFU/mL,盡管高于初始弧菌密度,但比此時對照組弧菌密度降低94.2%。由此可見,1 mL發(fā)酵產(chǎn)物未能抑制哈維弧菌生長,并且其中營養(yǎng)物質(zhì)會促進弧菌生長;而2 mL發(fā)酵產(chǎn)物能有效抑制海水中哈維弧菌生長,并一直保持至試驗結(jié)束(圖5)。

同樣,100 mL滅菌海水中,接種燦爛弧菌的初始菌密度為(3.0±0.2)×103CFU/mL。對照組燦爛弧菌呈指數(shù)生長,在6 h時進入指數(shù)生長階段,此時燦爛弧菌密度為(11.4±0.8)×103CFU/mL;在24 h時,燦爛弧菌密度達到最大,為(155.0±7.1)×103CFU/mL。兩個試驗組燦爛弧菌密度盡管也繁殖生長,但速度顯著低于對照組,12 h時進入指數(shù)生長階段;在24 h時進入平臺期,試驗組1和試驗組2中燦爛弧菌密度分別為(50.8±1.1)×103、(25.0±7.1)×103CFU/mL,比同時間對照組弧菌密度分別降低67.3%和83.9%。由此可見,1 mL和2 mL發(fā)酵產(chǎn)物均能抑制海水中燦爛弧菌的繁殖生長,且試驗組2效果更好。

圖5 無菌發(fā)酵產(chǎn)物在海水中對哈維弧菌的抑制效果Fig.5 Antibacterial effect of sterile fermentation products on Vibrio harveyi in seawater

圖6 無菌發(fā)酵產(chǎn)物在海水中對燦爛弧菌的抑制效果Fig.6 Antibacterial effect of sterile fermentation products on Vibrio splendidus in seawater

3 討論

弧菌可導(dǎo)致諸多海水養(yǎng)殖生物的病害發(fā)生,給海水養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的損失[25]。從1965年至今,海綿及其共附生放線菌是海洋天然活性產(chǎn)物的最主要來源之一,約占已發(fā)現(xiàn)海洋天然活性產(chǎn)物數(shù)量的35%[26]。因此,篩選具有抑制弧菌作用的海綿共生放線菌,并研究其抑制弧菌效果,對于防治海水養(yǎng)殖病害具有重要價值。

3.1 FH菌株的抑菌活性

本研究中,從繁茂膜海綿中分離篩選出的FH菌株,初步鑒定為球孢鏈霉菌Streptomyces globisporus,對海水養(yǎng)殖主要病原細菌如哈維弧菌Vibrio harveyi、燦爛弧菌Vibrio splendidus具有較強的抑制作用。王勇[27]從海泥中分離篩選出一株弗氏鏈霉菌Streptomyces fradiae DL-4,其代謝產(chǎn)物對大腸桿菌E.coli、鰻弧菌Vibrio anguillarum、哈維弧菌Vibrio harvey、殺鮭氣單胞菌Aeromonas salmonida、金黃葡萄球菌Staphlococcus aureus等革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌顯示出較強的抑菌作用。王高學(xué)等[28]從泥樣中分離篩選出6株鏈霉菌屬Streptomyces放線菌,其代謝產(chǎn)物對鰻弧菌Vibrio anguillarum、腸型點狀氣單胞菌Aeromonaspunctata f.instestinalis、金黃葡萄球菌Staphlococcus aureus等顯示出較強的殺菌作用。同為鏈霉菌屬放線菌,其代謝產(chǎn)物均對多種弧菌具有抑制作用。鏈霉菌屬是產(chǎn)生抗生素種類和數(shù)量最多的一大類放線菌,目前,約2/3臨床應(yīng)用的抗生素來源于鏈霉菌屬[29]。FH菌株對革蘭氏陽性菌的抑菌活性需進一步檢測。

3.2 FH菌株的最佳發(fā)酵條件

以抑制弧菌為指示效果,FH菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件正交試驗優(yōu)化結(jié)果為溫度25℃、pH 7.5、裝液量30 mL。在此基礎(chǔ)上進行時間優(yōu)化,結(jié)果表明,在72～168 h時,發(fā)酵粗提物對哈維弧菌的抑菌效果較好,在15～72 h時發(fā)酵粗提物對燦爛弧菌的抑菌效果較好。綜合考慮對2株指示菌的抑制效果和生產(chǎn)時間成本等問題,選擇72 h為適宜發(fā)酵時間。從今后生產(chǎn)角度考慮,發(fā)酵時間可延長到96 h,為進一步擴大生產(chǎn)提供了參考依據(jù)。原居林等[30]從福建瑯琦島海泥中分離得到一株對多種水產(chǎn)病原菌具有較強抑制作用的鏈霉菌屬Streptomyces菌株FA-F-5,以嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila為指示菌,優(yōu)化得出最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為pH 8、溫度25℃、裝液量100 mL(1000 mL瓶)、發(fā)酵時間168 h。同為海洋鏈霉菌屬,FA-F-5與FH菌株優(yōu)化結(jié)果相近。苑孟等[31]以枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis為指示菌,對擬諾卡氏菌屬Nocardiopsis放線菌Y18的發(fā)酵條件進行優(yōu)化,得出最佳優(yōu)化條件為溫度28℃、pH 8、裝液量200 mL (1000 mL瓶),培養(yǎng)時間6 d。雖然Y18與FH菌株不同屬,但優(yōu)化結(jié)果差異不大。顧忠旗[32]以嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila為指示菌,對海洋放線菌DL2-F-5 Streptomyces fradiae發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果為溫度33℃、pH 6.0、發(fā)酵時間96 h。雖然DL2-F-5與FH菌株同屬,但優(yōu)化結(jié)果差異較大。放線菌產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的適宜條件與其所屬種屬相關(guān)性不大,不同的放線菌其發(fā)酵條件需根據(jù)實際條件進行優(yōu)化。

3.3 FH菌株抑菌產(chǎn)物的穩(wěn)定性

王高學(xué)等[20]對弗氏鏈霉菌Streptomyces fradiaeDL2-F-5貯藏時間對發(fā)酵液抑菌活性的影響進行試驗,其抑菌成分可在室溫條件下穩(wěn)定保存150 d。邵光燦等[33]對鏈霉菌屬Streptomyces海洋放線菌F1次級代謝產(chǎn)物進行儲藏穩(wěn)定性檢測,發(fā)現(xiàn)抑菌物質(zhì)可在室溫條件下保存30 d。而本研究中鏈霉菌屬FH菌株發(fā)酵粗提物抑菌活性的穩(wěn)定性試驗顯示,發(fā)酵粗提物在4℃、-20℃條件下,保存60 d其抑菌活性較為穩(wěn)定,但在室溫條件下保存其抑菌活性不穩(wěn)定,在室溫貯存方面具有劣勢。這些試驗結(jié)果均為海綿放線菌FH的生產(chǎn)開發(fā)研究提供了理論依據(jù)。

3.4 FH菌株的生長曲線

本研究中,對海綿放線菌FH菌株在正交試驗最優(yōu)條件下的生長曲線進行了測定,FH菌株在ISP2液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng),0～15 h為適應(yīng)期, 15～72 h為指數(shù)生長期,72～120 h為穩(wěn)定期, 120 h以后為衰亡期。張紅丹等[34]對不吸水鏈霉菌公主嶺新變種Streptomyces ahygroscopicus n.var. gongzhulingensis Ruan et Zhang在YEME培養(yǎng)基中搖床振蕩培養(yǎng)時的生長曲線進行測定,結(jié)果顯示, 0～36 h為生長延遲期,36～84 h為對數(shù)生長期, 84～108 h為穩(wěn)定期,108 h以后為衰亡期。由生長曲線可見,FH菌株適應(yīng)期短,穩(wěn)定期長。

3.5 滅菌海水中FH菌株發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌試驗

海綿放線菌FH菌株的發(fā)酵產(chǎn)物在滅菌海水中對弧菌的抑制試驗結(jié)果表明,其發(fā)酵產(chǎn)物能夠有效地抑制海水中弧菌的增長,有望降低弧菌病的發(fā)病率。對放線菌F1-F-12進行鯽防治試驗[28],投喂添加放線菌發(fā)酵液飼料的鯽體內(nèi)氣單胞菌數(shù)量與對照組相比明顯減少。因此,將具有抑菌活性的放線菌開發(fā)成生物漁藥并應(yīng)用于海水養(yǎng)殖業(yè),具有一定的實際應(yīng)用價值,值得進一步深入研究。

[1] 閆茂倉,陳少波,單樂州,等.海水養(yǎng)殖動物致病弧菌的研究進展[J].水產(chǎn)科學(xué),2009,28(8)：475-481.

[2] 向赟,吳宇學(xué),王剛,等.不同溫度下哈維氏弧菌和白斑綜合癥病毒對凡納濱對蝦的致病性[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報,2015,30 (1)：56-61.

[3] 陶然,劉瑞,王晴,等.哈維氏弧菌硫氧還蛋白還原酶在大腸桿菌中的表達及對大菱鲆的免疫保護作用[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報,2012,27(2)：137-142.

[4] 吳后波,潘金培.弧菌屬細菌及其所致海水養(yǎng)殖動物疾病[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2001,8(1)：89-93.

[5] 張曉華,鐘英斌,陳吉祥.哈維氏弧菌的生物學(xué)特性、流行病學(xué)及檢測技術(shù)[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報,2007,37(5)：740-748.

[6] 楊先樂.我國的海水養(yǎng)殖及其病害控制[J].水產(chǎn)科技情報, 2001,28(1)：7-10,14.

[7] 王印庚,方波,張春云,等.養(yǎng)殖刺參保苗期重大疾病“腐皮綜合征”病原及其感染源分析[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2006,13(4)：610-616.

[8] 陳四清,李杰,韓茵,等.仿刺參養(yǎng)殖區(qū)泥樣中燦爛弧菌拮抗菌的快速篩選及其保護作用[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報,2014,44 (11)：30-36.

[9] 原居林.一株抗菌海洋放線菌的分離鑒定及其活性成分的初步研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué),2008.

[10] Manivasagan P,Venkatesan J,Sivakumar K,et al.Pharmaceutically active secondary metabolites of marine actinobacteria[J]. Microbiological Research,2014,169(4)：262-278.

[11] 吳梧桐,王友同,吳文俊.海洋活性物質(zhì)研究若干進展[J].藥物生物技術(shù),2000,7(3)：179-183.

[12] Faulkner D J.Marine natural products[J].Natural Product Reports,2000,17：7-55.

[13] Bergmann W,Burke D C.Contributions to the study of marine products.XXXIX.The nucleosides of sponges：III.spongothymidine and spongouridine[J].The Journal of Organic Chemistry, 1995,20(11)：1501-1507.

[14] Wang Guangyi.Diversity and biotechnological potential of the sponge-associated microbial consortia[J].Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology,2006,33(7)：545-551.

[15] 李俠,程璐.4株海洋放線菌對半滑舌鰨病原弧菌的拮抗作用[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2011(1)：268-270.

[16] 張海濤.海綿放線菌的分離和多樣性研究[D].大連：中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所,2006.

[17] 信艷娟,艾江寧,劉亞男,等.一株海洋放線菌的分離鑒定及活性研究[J].生物技術(shù)進展,2012,2(5)：354-358.

[18] 惠嬌.放線菌NB-8發(fā)酵條件優(yōu)化及抑菌機理的研究[D].保定：河北大學(xué),2011.

[19] 黃苛,劉祝祥,肖懷東,等.放線菌JSM20.1發(fā)酵條件優(yōu)化及活性物質(zhì)特性初步研究[J].微生物學(xué)雜志,2008,28(6)：70-74.

[20] 王高學(xué),段星,原居林,等.一株抗多種水產(chǎn)病原菌放線菌的鑒定、發(fā)酵優(yōu)化及其應(yīng)用[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報,2008,17 (5)：591-597.

[21] 谷俊,林親雄,邢瑩瑩,等.海洋放線菌M324抗菌物質(zhì)的發(fā)酵優(yōu)化與性質(zhì)的初步研究[J].藥物生物技術(shù),2006,13(5)：347-350.

[22] Sujatha P,Raju K V V S N B,Ramana T.Studies on a new marine streptomycete BT-408 producing polyketide antibiotic SBR-22 effective against methicillin resistant Staphylococcus aureus [J].Microbiological Research,2005,160(2)：119-126.

[23] 穆蘭,廖輝偉,尹贇,等.一種篩選常用中草藥用作抑菌劑的新方法[J].中國食品添加劑,2008(6)：112-117,122.

[24] Austin B,Austin D A.Bacterial Fish Pathogens：Diseases in Farmed and wild Fish[M].2nd ed.Chichester,UK：Ellis Horwood Ltd,1993：265-314.

[25] 潘曉藝,沈錦玉,尹文林,等.水生動物的弧菌病及其致病機理[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報,2006,21(3)：272-277.

[26] Blunt J W,Copp B R,Munro M H G,et al.Marine natural products[J].Natural Product Reports,2010,27(2)：165-237.

[27] 王勇.抗水產(chǎn)病原菌海洋放線菌菌株DL-4的鑒定、發(fā)酵優(yōu)化及其生物學(xué)特性研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué),2011.

[28] 王高學(xué),顧忠旗,原居林,等.殺滅水產(chǎn)病原菌的放線菌篩選及防治試驗研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(9)：2613-2614,2673.

[29] Procópio R E,Silva I R,Martins M K,et al.Antibiotics produced by Streptomyces[J].The Brazilian Journal of Infectious Diseases, 2012,16(5)：466-471.

[30] 原居林,王高學(xué),王建福,等.海洋放線菌FA-F-5對水產(chǎn)病原菌的抑制作用[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版, 2008,36(1)：79-85.

[31] 苑孟,俞勇,李會榮,等.海洋放線菌Y18的分子鑒定、生物活性及其抗菌物質(zhì)發(fā)酵條件優(yōu)化[J].極地研究,2014,26(3)：292-299.

[32] 顧忠旗.一株抗菌海洋放線菌的分離鑒定及其活性成分的初步研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué),2007.

[33] 邵光燦,錢冬萌,宋旭霞,等.海洋放線菌F1發(fā)酵條件優(yōu)化及抑菌物質(zhì)性質(zhì)的初步研究[J].中國海洋藥物,2014,33(3)：43-48.

[34] 張紅丹,杜茜,張正坤,等.放線菌769抑菌譜及液體培養(yǎng)生長曲線的測定[J].中國植保導(dǎo)刊,2010,30(7)：5-9.

Isolation,optimization of fermentation conditions and inhibition of Vibrio in a sponge-associated actinobacterium FH

DU Ying-xia1,LI Jing-ying2,FU Min2,ZHANG Xin2,QU Chun-qiang2,LI Xiao-yi2, ZHANG Ju-lin2,GU Ying3,WANG Xuan-jun4,FU Wan-tao2,5
(1.College of Fisheries and Life Science,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2.College of Marine Science and Environment,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;3.Fisheries Administrative Management Station of Changhai,Dalian 116500,China;4.Marine Surveillance and Fishery Administration Bureau of Dalian,Dalian 116001,China;5.Key Laboratory of Offshore Marine Environmental Science and Technology of Liaoning Province's University,Dalian 116023,China)

A sponge-associated actinobacterium FH with strong bioactivity was isolated from marine sponge Hymeniacidon perlevis,and identified by 16S rDNA gene sequence analysis as Streptomyces globisporus.The inhibition of Vibrio harveyi and Vibrio splendidus by FH strain was studied and the fermentation condition of FH strain was optimized,including influence of preservation temperature and time on the antibacterial effect of fermented product. The dry weight of mycelium revealed that the growth curve of FH strain showed a lag phase in 0-15 h,log phase in 15-72 h,stationary phase in 72-120 h and decline phase after 120 h.The optimal fermentation of FH strain was observed under conditions of temperature 25℃,pH 7.5 and loading volume 30 mL in the orthogonal experiment, with the best antibacterial effect on Vibrio harveyi and Vibrio splendidus by the crude extracts of FH strain fermented in 72 h under this condition.However,there was no significant difference in the antibacterial effects in the crude extracts of FH strain stored at 4℃and-20℃for 60 days and stored 7 days at room temperature(P＞0.05).Addition of 2 mL fermentation product of FH strain in 100 mL sterilized seawater led to effectively inhibit the growth of Vibrio harveyi and Vibrio splendidus.The findings indicated that the sponge-associated actinobacterium FH and its fermentation product had potential application in the field of mariculture.

sponge-associated actinobacterium;Vibrio;optimization of fermentation condition

Q93

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.04.014

2095-1388(2017)04-0457-08

2016-09-29

國家“十二五”科技支撐計劃項目(2015BAD13B05);海洋行業(yè)標準制修訂計劃項目(201502007-T)

杜英俠(1991—),女,碩士研究生。Email：Duyingxiayiyi@163.com

付晚濤(1969—),男,博士,教授。Email：fuwantao@dlou.edu.cn