章霞,徐志進(jìn),柳敏海,李偉業(yè),李凌剛,葉劍英,傅榮兵

(浙江省舟山市水產(chǎn)研究所,浙江舟山316000)

一株海洋紅酵母的鑒定及營養(yǎng)成分分析

章霞,徐志進(jìn),柳敏海,李偉業(yè),李凌剛,葉劍英,傅榮兵

(浙江省舟山市水產(chǎn)研究所,浙江舟山316000)

為探究海洋紅酵母Rhodotorula benthica作為水產(chǎn)蛋白源餌料的可能性,采用生理生化分析和分子鑒定的方法,對(duì)該酵母進(jìn)行了屬性鑒定、培養(yǎng)性能初探和一般營養(yǎng)成分測(cè)定等研究。結(jié)果表明：此菌株的菌落形態(tài)、生殖方式和生理生化特性等指標(biāo)鑒定結(jié)果均符合紅酵母屬性;利用真菌ITS基因引物對(duì)酵母菌總DNA進(jìn)行擴(kuò)增,測(cè)序獲得598 bp目的片段,經(jīng)NCBI GenBank比對(duì),此酵母菌的ITS序列與斯魯菲亞紅酵母Rhodotorula slooffiae序列一致性為99%～100%,故將該菌株鑒定為斯魯菲亞紅酵母;對(duì)此海洋紅酵母進(jìn)行液體培養(yǎng)基擴(kuò)培,獲得其生長曲線在48 h時(shí)達(dá)生長峰值,生物量為2.25×108cfu/mL,類胡蘿卜素含量為83.6 μg/g。研究表明,此株海洋紅酵母含有豐富的維生素、不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì),在水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中具有較好的應(yīng)用前景。

海洋紅酵母;營養(yǎng)成分;生理生化;類胡蘿卜素

海洋紅酵母Rhodotorula benthica屬于真菌,主要分布于不同海域和沿岸的各種基物上,具有較強(qiáng)的抗逆性和較好的耐鹽性[1]。海洋紅酵母富含氨基酸、肝糖、多肽、不飽和脂肪酸、動(dòng)物幼體生長激素和類胡蘿卜素等有益成分[2-4],且具有生物培養(yǎng)周期短、發(fā)酵條件簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高等特點(diǎn),在醫(yī)藥、食品、化工等各個(gè)領(lǐng)域均得到了廣泛的關(guān)注[5-6]。

近年來,眾多學(xué)者對(duì)紅酵母在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用進(jìn)行了廣泛研究。薛德林等[7]研究表明,海洋膠紅酵母Rhodotorula benthica對(duì)提高海參幼體的成活率和變態(tài)率有顯著成效;郝佳等[8]研究表明,海洋紅酵母微生態(tài)制劑有助于提高刺參的生長和存活率;徐琴等[9]研究表明,黏紅酵母Rhodotorula glutinis具有凈化中國對(duì)蝦育苗水環(huán)境的作用;王宇光等[10]研究表明,在適合的菌體濃度下,海洋膠紅酵母與魚蝦等養(yǎng)殖可無害共生：海洋紅酵母在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用具有巨大的潛力。據(jù)報(bào)道,水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中應(yīng)用的海洋紅酵母菌種主要是膠紅酵母、黏紅酵母、小紅酵母、深紅酵母等,其中后3種也是中國長江中紅酵母菌的優(yōu)勢(shì)種[5]。其他潛在優(yōu)勢(shì)菌種仍在探索中,例如Nagahama等[11-12]從太平洋西北部各海域分離、鑒定并獲得了紅酵母菌40株,為今后海洋紅酵母的相關(guān)研究提供了參考依據(jù);周與良等[13]對(duì)中國黃、渤海沿岸的海洋紅酵母進(jìn)行了資源研究和種類鑒定;李明等[14]從刺參的體表、腸道、呼吸樹上分離獲得了海洋紅酵母：目前在海洋紅酵母菌種的發(fā)掘鑒定方面仍需深入研究。本研究中,通過微生物生理生化分析、分子學(xué)鑒定等方法,對(duì)一株從遼寧省丹東獐島海域(黃海海域)海水樣品中分離獲得的海洋紅酵母進(jìn)行鑒定并對(duì)其基礎(chǔ)培養(yǎng)條件和營養(yǎng)性能進(jìn)行初探,旨在為其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用海洋紅酵母菌種由遼東學(xué)院提供,于YPD斜面保存。

斜面保存培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%、蛋白胨1.0%、酵母浸粉0.5%、瓊脂2.0%、海水100 mL,自然海水pH。

液體活化培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%、蛋白胨1.0%、酵母浸粉0.5%、海水100 mL,自然海水pH。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化與鑒定 將冰箱中保存的菌種接種在平板培養(yǎng)基上活化,溫度為30℃,時(shí)間為24 h。

(1)菌種的生理生化鑒定。參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》和《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》中對(duì)海洋紅酵母進(jìn)行糖發(fā)酵、碳源同化和氮源同化等生理生化試驗(yàn)方法。

(2)菌種的分子鑒定。從YPD固體培養(yǎng)基上無菌獲得菌體,進(jìn)行菌體DNA提取,并采用真菌ITS基因引物對(duì)酵母菌總DNA進(jìn)行擴(kuò)增,引物序列ITS1F：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA,ITS4A：CG-CCGTTACTGGGGCAATCCCTG。反應(yīng)體系(共50 μL)包含10×Buffer(含MgCl2)5.0 μL,200 mmol/μL dNTPs 1 μL,10 μmol/L雙向引物各2 μL,50 U/μL Taq酶0.1 μL,100 ng/μL DNA模板2 μL,用滅菌超純水補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃下預(yù)變性5 min;94℃下循環(huán)變性30 s, 55℃下退火復(fù)性1 min,72℃下延伸40 s,共進(jìn)行40個(gè)循環(huán);最后在72℃下再延伸10 min,于4℃下保存[15]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的初步鑒定采用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離,由生工生物工程(上海)股份有限公司完成PCR產(chǎn)物測(cè)序工作,獲得的序列與NCBI GenBank中酵母菌序列進(jìn)行同源性比對(duì),鑒定菌種。

1.2.2 海洋紅酵母搖床擴(kuò)培及生長曲線 從平板上接2環(huán)到裝液量為80 mL/500 mL的三角錐形瓶中(30℃、160 r/min),24 h形成種子培養(yǎng)基,再將種子培養(yǎng)基以6%的接種量接種到裝液量為80 mL/500 mL的錐形瓶中,其他培養(yǎng)條件不變,培養(yǎng)48 h。用血球板方法計(jì)數(shù)[16]。

采用分光光度計(jì)測(cè)定OD值,以時(shí)間為橫坐標(biāo),酵母培養(yǎng)液的OD值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.2.3 菌種收集 采用液體活化培養(yǎng)基發(fā)酵菌種48 h后以4000 r/min離心10 min。棄上清,收集菌體,用于后期干物質(zhì)、氨基酸和脂肪酸等的測(cè)定。

1.2.4 類胡蘿卜素的提取和測(cè)定 采用丙酮萃取方法。菌種培養(yǎng)48 h后,收集菌體置于恒溫烘箱(40℃)中烘干至恒重,取1 g干酵母,按比例加入一定量的鹽酸(3 mol/mL),室溫振蕩40 min,沸水浴加熱4 min后,迅速冷卻,以4000 r/min離心10 min,棄上清,將沉淀用水洗后再離心,重復(fù)以上步驟1次,得細(xì)胞碎片。隨即在細(xì)胞碎片中加入50 mL丙酮,室溫振蕩30 min,以4000 r/min離心10 min,取上清液。重復(fù)浸提2次,直到沉淀沒有顏色,此時(shí)所得上清液即為類胡蘿卜素提取液。

色素含量(μg/g干質(zhì)量)=ODmax×D×V/0.16W。其中：OD為475 nm波光處的吸光度;D為測(cè)定試樣時(shí)的稀釋倍數(shù);V為丙酮的用量(mL);W為酵母菌干質(zhì)量(g);0.16為胡蘿卜素的摩爾消光系數(shù)[17]。

1.2.5 基礎(chǔ)營養(yǎng)成分及氨基酸含量的測(cè)定 分別采用凱氏定氮法(GB/T6432—94)、索氏抽提法(GB/T6433—94)、550℃燃燒后稱量殘余物的方法(GB/T6438—92)、550℃烘干至恒重的方法測(cè)定粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、灰分和水分含量。按GB/ T18246—2000的方法,樣品經(jīng)水解后,利用A300型氨基酸全自動(dòng)分析儀進(jìn)行分析。

1.2.6 脂肪酸含量的測(cè)定

(1)提取。將樣品放入50 mL離心管中,用玻璃棒將菌絲絞碎,加入5 mL超純水?dāng)嚢枞芙?再加入40 mL混合溶劑(乙醇∶乙醚∶石油醚= 2∶1∶1),用力搖5 min,再以3500 r/min離心5 min,吸取上清液;第二次加入10 mL混合溶劑(石油醚∶乙醚=1∶1),再以3500 r/min離心5 min,吸取上清液;在45℃的水浴鍋吹氮?dú)?直至吹干。

(2)甲酯化。加2 mL正己烷到燒杯中,將油脂溶解,倒入5 mL帶蓋玻璃管中,加入0.5 mL KOH-甲醇溶液(4 mol/L),振蕩1 min,靜置直至上層清液清澈,吸取上清液,上機(jī)。

(3)色譜條件。安捷倫氣相色譜儀7820,色譜柱為DB-23(30 m×0.25 m×0.25 μm),檢測(cè)器為FID,進(jìn)樣口溫度為300℃,檢測(cè)器溫度為250℃,進(jìn)樣量為1 μL。初始溫度為50℃,以10.0℃/min升溫至180℃,保持5 min;再以5.0℃/min升溫至230℃,保持2 min,分流比為20∶1。脂肪酸的定量分析采用面積歸一法計(jì)算而得。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用Excel 2003軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的生化鑒定

將菌種活化、分離、純化培養(yǎng)48 h后,菌落在平板上顯粉紅色圓形,表面光滑、隆起、濕潤、不透明、邊緣整齊,易挑起,直徑為3～5 mm(圖1)。酵母細(xì)胞呈橢圓形,直徑為5 μm左右,出芽生殖(圖2)。

圖1 海洋紅酵母數(shù)碼照片F(xiàn)ig.1 Digital photo of yeast Rhodotorula benthica

圖2 海洋紅酵母顯微照片(200×)Fig.2 Micrograph of yeast Rhodotorula benthica(200×)

酵母菌生理生化特性鑒定指標(biāo)有碳源發(fā)酵測(cè)試、碳源同化、肌醇同化測(cè)試等[18]。此菌株對(duì)葡萄糖、乳糖、海藻糖、蔗糖、甘露糖、半乳糖和麥芽糖均不發(fā)酵,能同化硝酸鉀、亞硝酸鈉、麥芽糖、蔗糖、甘露糖、海藻糖、木糖,不能同化葡萄糖、鼠李糖、乳糖、淀粉、蜜二糖和肌醇,尿素分解呈陽性,脲酶試驗(yàn)呈陰性,部分結(jié)果見表1。該菌株的形態(tài)學(xué)和各項(xiàng)生理生化檢測(cè)結(jié)果符合紅酵母Rhodotorula特征,初步確定該菌株為海洋紅酵母。

表1 海洋紅酵母的生理特征Tab.1 Physiological properties of the yeast strain of Rhodotorula benthica

2.2 菌種的分子鑒定

2.2.1 菌種片段克隆鑒定 利用真菌ITS基因引物對(duì)酵母菌總DNA進(jìn)行擴(kuò)增,測(cè)序獲得598 bp目的片段,并在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行序列比對(duì),結(jié)果表明,該酵母菌的ITS序列與斯魯菲亞紅酵母Rhodotorula slooffiae序列一致性為99%～100%。據(jù)此將該菌株鑒定為斯魯菲亞紅酵母。

2.2.2 5種海洋紅酵母的核苷酸相似性 利用該斯魯菲亞紅酵母與其他4種海洋紅酵母——黏紅酵母Rhodotorula glutinis、牧草酵母Rhodotorula graminis、小紅酵母Rhodotorula minuta、膠紅酵母Rhodotorula mucilaginosa的ITS基因片段進(jìn)行核苷酸序列進(jìn)行比較,分析其相似性,并運(yùn)用Neighbor-Joining方法構(gòu)建此5種海洋紅酵母基于ITS基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。從表2和圖3可以看出,該斯魯菲亞紅酵母的ITS基因序列與小紅酵母的核苷酸相似性最高,進(jìn)化樹也與小紅酵母聚于一支,可見這兩種海洋紅酵母遺傳距離較近。

表2 斯魯菲亞紅酵母與其他4種海洋紅酵母ITS基因核苷酸相似性Tab.2 Similarity of the nucleotide sequence for ITS genes among yeasts Rhodotorula slooffiae and the other 4 species of Rhodotorula sp.%

圖3 基于ITS核苷酸序列構(gòu)建的5個(gè)物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phyogenetic tree of 5 species in Rhodotorula sp. based on ITS nucleotide sequence

2.3 生長曲線及類胡蘿卜素含量

將活化的菌種接種到液體培養(yǎng)基中,以160 r/min在30℃下恒溫培養(yǎng),每3 h搖勻菌懸液,用分光光度計(jì)于600 nm波長處測(cè)定OD值,用蒸餾水做空白對(duì)照,記錄數(shù)值。海洋紅酵母在液體培養(yǎng)基中的生長曲線見圖4。在13 h內(nèi),菌體處于生長潛伏期,13～48 h為指數(shù)增生期,48 h之后為生長停滯期(圖4)。48 h為菌體的生長峰值,此時(shí)的菌體密度為2.25×108cfu/mL,類胡蘿卜素含量為83.6 μg/g。

圖4 斯魯菲亞紅酵母的生長曲線Fig.4 Growth curve of yeast Rhodotorula slooffiae

2.4 海洋紅酵母的一般營養(yǎng)成分

菌體擴(kuò)培48 h后,收集菌體,此株海洋紅酵母菌體的粗蛋白質(zhì)含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)為干質(zhì)量的48.70%,粗脂肪含量為23.35%,粗灰分含量為15.27%。

2.5 斯魯菲亞紅酵母的氨基酸組成

從表3可知,該株紅酵母含有常見的16種氨基酸,其中10種為必需氨基酸。氨基酸含量總計(jì)為261.9 mg/g(干質(zhì)量),其中非必需氨基酸為148.1 mg/g(干質(zhì)量),占總氨基酸含量的56.55%,必需氨基酸為113.8 mg/g(干質(zhì)量),占總氨基酸含量的43.45%。非必需氨基酸中以谷氨酸含量最高(41.2 mg/g),占總氨基酸含量的15.73%;必需氨基酸中蛋氨酸含量最低(3.8 mg/g)。

2.6 斯魯菲亞紅酵母的脂肪酸組成

從該株斯魯菲亞紅酵母中共檢出17種脂肪酸,脂肪酸含量為200.9 mg/g(干質(zhì)量),脂肪酸各組分所占的比例見表4。該紅酵母中飽和脂肪酸(SFA)總量占脂肪酸總量的31.92%,其中以棕櫚酸含量最高(19.77%)。不飽和脂肪酸(UFA)總量占脂肪酸總量的68.08%,其中5種單不飽和酸(MUFA)總量占脂肪酸總量的37.76%,其中以順式油酸含量最高(34.71%);4種多不飽和脂肪酸(PUFA)總量占脂肪酸總量的30.32%,其中以順式亞油酸含量最高(25.24%)。

表3 斯魯菲亞紅酵母的氨基酸組成及含量Tab.3 Amino acid composition and content of the yeast Rhodotorula slooffiaemg/g

表4 斯魯菲亞紅酵母的脂肪酸組成及其比例Tab.4 Fatty acid composition and percent in the yeast Rhodotorula slooffiae%

3 討論

目前,有關(guān)海洋紅酵母的營養(yǎng)性能研究報(bào)道較多,楊世平等[19]對(duì)海洋紅酵母的基礎(chǔ)營養(yǎng)成分、脂肪酸和氨基酸進(jìn)行了研究和分析,發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)、總糖、必需氨基酸含量較高,具備了作為水產(chǎn)餌料生物的重要條件。李娟等[20]對(duì)于黃海近海獲得的1株酵母菌進(jìn)行了營養(yǎng)成分分析,結(jié)果與楊世平等[19]的研究結(jié)果相似。Yang等[21]研究表明,海洋紅酵母具有增強(qiáng)凡納濱對(duì)蝦抗氧化能力及促進(jìn)對(duì)蝦生長等作用。研究表明,海洋紅酵母有望成為水產(chǎn)養(yǎng)殖的新型餌料和微生態(tài)制劑。

本試驗(yàn)中,也對(duì)獲得的斯魯菲亞紅酵母進(jìn)行了營養(yǎng)性能測(cè)定,表明其粗蛋白質(zhì)占干質(zhì)量的48.70%,說明此株紅酵母中蛋白質(zhì)含量較高,可滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物餌料蛋白質(zhì)含量30%～56%的需求,粗灰分占干質(zhì)量的15.27%,說明其礦物質(zhì)含量較高。而對(duì)此株紅酵母脂肪酸的測(cè)定結(jié)果顯示,其富含脂肪酸最多的是順式油酸(C18：1),其次是順式亞油酸(C18：2)、棕櫚酸(C16：0),缺少多不飽和脂肪酸中的二十碳五烯酸(C22：5,EPA)、二十二碳六烯酸(C22：6,DHA)、α-亞麻酸(C18：3),這與高玲美[22]、蔡詩慶等[23]、楊世平等[19]、李娟等[20]的研究結(jié)果類似,均缺乏不飽和脂肪酸DHA和EPA[24],因此,在其作為水產(chǎn)餌料的使用中,需添加富含這兩種多不飽和脂肪酸的藻類、魚油或者其他物質(zhì),以彌補(bǔ)此缺陷[15]。

目前,水產(chǎn)飼料用魚粉、魚油等動(dòng)物性原料昂貴,大部分采用了植物蛋白替代,而植物蛋白中缺乏蛋氨酸和賴氨酸等,造成大多商品飼料中缺乏魚類限制性氨基酸——賴氨酸、蛋氨酸、精氨酸和苯丙氨酸等。而海洋紅酵母富含此類氨基酸,大有可能作為單細(xì)胞動(dòng)物蛋白源提供魚類所需的限制性氨基酸。已有研究表明,對(duì)魚類具有誘食活性的主要是L-型氨基酸,包括甘氨酸、L-丙氨酸、精氨酸、賴氨酸和由氨基酸合成的谷胱甘肽(GSH)等,而紅酵母中精氨酸、丙氨酸、甘氨酸等含量豐富,拌飼投喂可能具有誘食魚類的作用。

另有研究表明,在斑馬魚的腸道中分離獲得了斯魯菲亞紅酵母[25],可見此種酵母可能對(duì)魚類的生長無害。在餌料中添加類胡蘿卜素具有抗氧化、防癌、增色,以及增強(qiáng)免疫力和抗應(yīng)激的功能[26-30],而此紅酵母經(jīng)YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后,達(dá)到生長峰值為2.25×108cfu/mL,類胡蘿卜素含量為83.6 μg/g,可見其生長速度較快,類胡蘿卜素含量較高,這為其作為水生動(dòng)物餌料添加劑提供了必備條件。但相較于其他研究中海洋紅酵母所產(chǎn)的類胡蘿卜素,含量還有待提升,目前也有眾多的方法可達(dá)到此目的,例如通過調(diào)節(jié)碳源濃度、氮源濃度,添加無機(jī)鹽(MgCl2、KH2PO4)和花生油、番茄汁、維生素B1等外源性物質(zhì),以及獲得變異菌種和調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件(分批補(bǔ)料、溫度、pH)等,皆可增加海洋紅酵母的生長量和類胡蘿卜素產(chǎn)量[31-38]。由此可知,此紅酵母能否成為魚類良好的餌料添加劑或者微生態(tài)制劑需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述,海洋紅酵母是海洋環(huán)境中的腐生菌,營養(yǎng)需求粗放,生長周期短且能產(chǎn)生類胡蘿卜素。菌體本身含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類、維生素等,除能提取色素外,還可以將全細(xì)胞作為色素單細(xì)胞蛋白,用于餌料、飼料添加劑和微生態(tài)活菌制劑,具有巨大的商業(yè)應(yīng)用潛力。

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Identification and nutrient analysis of a species yeast Rhodotorula benthica

ZHANG Xia,XU Zhi-jin,LIU Min-hai,LI Wei-ye,LI Ling-gang,YE Jian-ying,FU Rong-bing
(Zhoushan Fisheries Research Institute of Zhejiang Province,Zhoushan 316000,China)

Identification,culture performance and nutrient analysis were conducted in a yeast Rhodotorula benthica by physiological and biochemical and molecular methods to explore the possibility of a yeast Rhodotorula benthica as dietary protein resource in aquaculture.It was found that the strain was similar to another Rhodotorula benthica in colony,cell morphology and physiological biochemical characteristics.Amplification and partially sequencing of ITS gene revealed that there was a 598 bp fragment in the total DNA sequence of the yeast,with 99%homology of nucleotide sequence with that in the reported Rhodotorula slooffiae ITS gene by NCBI GenBank,indicating that the yeast strain is Rhodotorula slooffiae.The peak value of 2.25×108cfu/mL and the maxiaml carotenoid concentration of 83.6 μg/g were observed in the liquid medium culture of the yeast strain.The findings indicate that Rhodotorula slooffiae is rich in nutrients including vitamins,unsaturated fatty acids and proteins,playing an important role in aquaculture in the future.

Rhodotorula benthica;nutritional property;physiological and biochemical analysis;carotenoid

S963

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.04.010

2095-1388(2017)04-0434-06

2016-08-18

海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項(xiàng)目(浙海漁計(jì)〔2015〕29號(hào));舟山市公益類科技項(xiàng)目(2013C31047,2015C31009);浙江省公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項(xiàng)目(2015C32111)

章霞(1989—),女,工程師。E-mail：yufan414515@163.com

傅榮兵(1971—),男,高級(jí)工程師。E-mail：853966748@qq.com