劉大麗，馬龍彪，紀(jì)巖，張革艷，劉麗萍，魯振強(qiáng)*（.黑龍江省高等學(xué)校生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱50080；.黑龍江省高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱50080）

甜菜褐斑病抗性基因的克隆

劉大麗2，馬龍彪2，紀(jì)巖1，張革艷1，劉麗萍1，魯振強(qiáng)1*
（1.黑龍江省高等學(xué)校生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150080；2.黑龍江省高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080）

為了獲得抗病的甜菜遺傳材料，通過(guò)RT-PCR技術(shù)，分別對(duì)兩類真菌抗性基因AtChitinase1（GenBank No.NM_100117）和AtGlucanase2（GenBank No.NM_115586）的功能域進(jìn)行了克?。粚⑺玫钠芜B接到載體pMD 18-T并鑒定。結(jié)果表明，AtChitinate1基因的核苷酸長(zhǎng)度為819 bp，編碼272個(gè)氨基酸，AtGlucanase2基因的核苷酸長(zhǎng)度為1020 bp，編碼339個(gè)氨基酸，確認(rèn)獲得兩個(gè)抗病基因功能片段。

甜菜；褐斑??；幾丁質(zhì)酶；葡聚糖酶；基因克隆

甜菜（Beta vulgaris L.）是我國(guó)的主要糖料作物，在我國(guó)東北、西北和華北等地大面積種植。甜菜褐斑病是Cercospora beticola Sacc.引起的真菌類病害，病癥初期表現(xiàn)為葉片局部褐色斑塊，繼發(fā)則導(dǎo)致葉片全部壞死，干擾了甜菜正常的生長(zhǎng)發(fā)育，破壞了植物正常的生理生化反應(yīng)，對(duì)甜菜的產(chǎn)量品質(zhì)影響極大。使用殺菌劑抗病，在生產(chǎn)中不僅需要多種殺菌劑聯(lián)合輪換使用，而且在病害重發(fā)區(qū)域需要多次噴施殺菌劑處理，大量長(zhǎng)期的使用勢(shì)必污染環(huán)境[1-2]。從遺傳上入手，通過(guò)導(dǎo)入真菌病害抗性基因，培育抗褐斑病甜菜品種，具有重要的意義與價(jià)值。幾丁質(zhì)酶（Chitinase）是植物內(nèi)的一類水解酶，而幾丁質(zhì)正是真菌病原菌細(xì)胞壁的主要成分，通過(guò)破壞真菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而抑制了病原菌的生長(zhǎng)。當(dāng)病原菌侵染植物細(xì)胞，植物幾丁質(zhì)酶受到誘導(dǎo)進(jìn)而表達(dá)，這時(shí)病菌菌絲體的細(xì)胞壁被幾丁質(zhì)酶水解破壞而變薄，引發(fā)球狀突起，進(jìn)而質(zhì)膜破裂，菌絲的生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)受到抑制，從而達(dá)到抑制病原菌生長(zhǎng)的效果。葡聚糖酶（Glucanase）是一類植物抗病蛋白，一方面它的催化產(chǎn)物可以誘發(fā)植物抗病反應(yīng)，寡糖是葡聚糖酶的酶解產(chǎn)物，寡糖是一種誘發(fā)植物抗病防御反應(yīng)的信號(hào)分子，可以誘導(dǎo)植物建立復(fù)雜的抗病防御系統(tǒng)，間接增強(qiáng)植物的抗病能力。另一方面，葡聚糖酶可以直接降解真菌細(xì)胞，使得病菌細(xì)胞內(nèi)含物外溢，抑制病原菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)。Chitinase基因和Glucanase基因是目前發(fā)現(xiàn)的兩種廣譜性抗真菌病害基因，并且這兩個(gè)基因具有協(xié)同增效的作用[3]。

基于這個(gè)背景與需求，本研究以提高甜菜對(duì)褐斑病的遺傳抗性為目標(biāo)，采用RT-PCR技術(shù)對(duì)抗性基因AtChitinase1和AtGlucanase2的功能域分別進(jìn)行了克隆，為后期對(duì)甜菜褐斑病的遺傳研究及獲得抗病甜菜品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑

選用Ecotype Colombia型Arabidopsis thaliana為靶基因克隆的植物材料。BIOZOL（BioFlux）、pMD18-T載體、膠回收試劑盒（TaKaRa）；大腸桿菌DH5α（本實(shí)驗(yàn)室）；RNA電泳所用試劑均為進(jìn)口分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取與檢測(cè)稱取1 g植物幼嫩葉片組織，加入5mL BIOZOL試劑中，室溫15min；離心；將上層清液中加入1/5體積的氯仿，冰浴15min；再次離心，將上層清液中加入等體積異丙醇，于-20℃放置30min；離心后，將沉淀于1mL 70%乙醇中洗滌兩次，晾干后，溶于DEPC水中，儲(chǔ)存于-70℃?zhèn)溆?。利用紫外分光光度?jì)，分別在OD260和OD280條件下測(cè)定RNA的含量和純度，并將樣品的濃度稀釋成1μg/μL備用。取2μg總RNA，加入15.8μL變性液，電泳緩沖液為1×MOPs，經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳，進(jìn)一步確定RNA質(zhì)量。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)根據(jù)AtChitinase1（GenBank No.NM_100117）基因和AtGlucanase2（GenBank No. NM_115586）基因的序列信息，利用Primer premier 5.0分別設(shè)計(jì)了兩個(gè)基因的克隆引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增AtChitinase1基因的CDS功能域長(zhǎng)度為819 bp，擴(kuò)增AtGlucanase2基因的CDS功能域長(zhǎng)度為1020 bp。擴(kuò)增引物由上海生工合成。

1.2.3 RT-PCR實(shí)驗(yàn)在12μL的反應(yīng)體系中加入3μg RNA、10μM Oligo dT以及RNase free H2O于65℃反應(yīng)5min，并立即置于冰上；向第一步變性反應(yīng)液中加入5×RTBuffer，20mM dNTPs，10 U RNase Inhibiter以及20U的Rever Tra Ace（ToYoBo），總體積為20μL。反應(yīng)條件為42℃60min；99℃5min；4℃5min。所得的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20℃?zhèn)溆谩CR擴(kuò)增：50μL的反應(yīng)體系中，分別加入2μL cDNA模板，5μL 10×Taq Buffer、4μL 10mM dNTPs、1μL 20μM上游引物和下游引物，0.5μL rTaq（TaKaRa）。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃（30s），52℃（45s），72℃（3min），30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，并利用GeneSnap 6.08（f）進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 酶切驗(yàn)證及序列測(cè)定將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，回收；將pMD18-T載體和目的基因回收片段按照摩爾比1∶5進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)Amp抗性及藍(lán)白斑篩選出待測(cè)陽(yáng)性克隆。待測(cè)陽(yáng)性克隆經(jīng)過(guò)提質(zhì)粒，酶切鑒定，最終進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

圖1 AtChitinase1基因和AtGlucanase2基因CDS功能域的RT-PCR擴(kuò)增A：總RNA；B、C：RT-PCR擴(kuò)增；1：AtChitinase1基因CDS；2：AtGlucanase2基因CDS；M（Maker）：1 kb DNA Ladder（NEB）

圖2 pMD 18-T-AtChitinase1和pMD 18-T-AtGlucanase2載體的構(gòu)建A.pMD 18-T-AtChitinase1載體質(zhì)粒酶切鑒定；B.pMD 18-T-AtGlucanase2載體質(zhì)粒酶切鑒定；1：SalI和XbaI；2：HincII；M（Maker）：1 kb DNA Ladder（NEB）

2 結(jié)果與分析

2.1 AtChitinase1和AtGlucanase2基因的克隆

實(shí)驗(yàn)以Ecotype Colombia型Arabidopsis thaliana為靶基因克隆的植物材料，利用BIOZOL試劑提取了總RNA（圖1A）。電泳后28S rRNA和18S rRNA在紫外燈下清晰可見(jiàn)，并且，28S rRNA的亮度是18S rRNA的2倍左右，這說(shuō)明RNA基本上沒(méi)有被降解，且無(wú)彌散。同時(shí)，加樣孔附近沒(méi)有雜帶，說(shuō)明產(chǎn)物中沒(méi)有DNA存在；在18S rRNA下方存在一些較為模糊的條帶，這可能是由tRNA、5.8SRNA和5S rRNA組成的遷移較快的條帶。這些結(jié)果都說(shuō)明了實(shí)驗(yàn)獲得了較高純度和得率的總RNA。

以總RNA為模板，利用AMV獲得了cDNAs，再通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增，顯示在820 bp的位置獲得了片段（圖1B），這與AtChitinase1（GenBank No. NM_100117）基因序列功能域的大小—819 bp相一致；在1020 bp的位置獲得的片段（圖1C），與AtGlucanase2（GenBank No.NM_115586）基因序列的功能域1020 bp相符。

2.2 重組質(zhì)粒pMD 18-T-AtChitinase1和pMD 18-T-AtGlucanase2的構(gòu)建

將PCR獲得的AtChitinase1和AtGlucanase2基因片段分別進(jìn)行回收，與pMD 18-T連接，并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有Amp、IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基上。挑取白斑陽(yáng)性克隆，并對(duì)應(yīng)提取質(zhì)粒DNA。通過(guò)對(duì)AtChitinase1和AtGlucanase2基因CDS序列限制性內(nèi)切酶圖譜的分析，得出AtChitinase1基因內(nèi)部無(wú)常規(guī)酶切位點(diǎn)，而在AtGlucanase2基因CDS區(qū)域850 bp位置有一個(gè)HincII限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。因此，選取pMD 18-T載體上的SalI和XbaI，對(duì)pMD 18-T-AtChitinase1重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定；對(duì)于pMD 18-T-AtGlucanase2重組質(zhì)粒來(lái)說(shuō)，選取同時(shí)存在于載體上游及基因內(nèi)部HincII來(lái)進(jìn)行鑒定（圖2）。

如圖2A所示，經(jīng)過(guò)SalI和XbaI酶切重組質(zhì)粒，獲得了兩條位于2.7 kb和820 bp左右位置的條帶，這與T載體（2690 bp）和AtChitinase1全長(zhǎng)（819 bp）長(zhǎng)度基本一致。

由圖2B可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)SacI酶切重組質(zhì)粒，分別于2.9 kb和870 bp左右的位置獲得了兩條酶切條帶。由于AtGlucanase2基因內(nèi)部的HincII酶切位點(diǎn)位于其起始密碼子端的850 bp的位置，因此，870 bp的片段長(zhǎng)度意味著在重組質(zhì)粒中，AtGlucanase2基因逆向插入到pMD 18-T載體上。

3 討論

迄今為止，雖然美國(guó)、歐洲等抗真菌、細(xì)菌、病毒等病甜菜品種已研制成功，但其申請(qǐng)了專利保護(hù)，輸入并控制了包括中國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家甜菜抗病商用品種的價(jià)格，已形成了全球的壟斷趨勢(shì)[4]。本研究對(duì)甜菜抗褐斑病基因—幾丁質(zhì)酶AtChitinase1和葡聚糖酶AtGlucanase2基因的克隆，不僅可以打破國(guó)外的壟斷，培育自主產(chǎn)權(quán)的抗病甜菜品種，而且對(duì)于提高甜菜產(chǎn)量、增加農(nóng)民收入，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要的科學(xué)意義。

[1]羅成飛，孔凡江.談甜菜抗褐斑病育種[J].中國(guó)甜菜糖業(yè)，2000（4）：28-30

[2]喬志文，李彥麗，柏章才.3種殺菌劑防治甜菜褐斑病間隔期及效果[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)2015，31（29）：72-76

[3]Mebeaselassie Andargie，Jianxiong Li.Arabidopsis thaliana:A Model Host Plant to Study Plant–Pathogen Interaction Using Rice False Smut Isolates of Ustilaginoidea virens[J].Frontiers in plant Sci，2016，7:1-10

[4]James C.Global status of commercialized biotech/GM Crops:2008[R].NY:ISAAA,2008.

M olecular Cloning of Resistant Genes Related to Sugarbeet Cercospora beticola

LIU Da-li2,MA Long-biao2,JIYan1,ZHANG Ge-yan1,LIU Li-ping1,LU Zhen-qiang1*
(1.Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology/College of Life Sciences,Heilongjiang University,Harbin 150080,China; 2.Key Laboratory of SugarbeetGenetics and Breeding/Academy of Crop Sciences,Heilongjiang University,Harbin 150080,China)

To improve the resistance of sugarbeet to Cercospora beticola Sacc.,target genes AtChitinase1 (GenBank No.NM_100117)and AtGlucanase2(GenBank No.NM_115586)were selected,and the CDS of two geneswere cloned respectively by RT-PCR.Two CDSwere constructed into pMD 18-T Vector respectively,and identified with enzymes digested and sequenced.AtChitinase1 and AtGlucanase2 were 819 bp and 1020 bp, deduced to encode 272 and 339 amino acids respectively,and identified as predicted.

sugar beet(Beta vulgaris);cercospora beticola Sacc.;chitinase;glucanase;gene cloning

S566.3；Q 78

A

1007－2624（2017）04－0005－02

10.13570/j.cnki.scc.2017.04.002

2017-03-30

黑龍江省教育廳資助項(xiàng)目（12541608）。

劉大麗（1981-），女，博士，主要從事植物分子生物學(xué)研究。Tel：0451-86609494；E-mail：daliliu2007@sina.com

魯振強(qiáng)，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事植物研究。E-mail：zhenqianglu@163.com