于書欣，曾發(fā)明，金巖章，萬洪靜，翟滇，邢豫明，程寶文

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)，云南昆明 650500；2.云南中醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650500；3.云南省公安廳，云南昆明 650228；4.隴川縣公安局，云南隴川 678700；5.麗江市公安局，云南麗江 674100）

SNaPshot技術(shù)應(yīng)用于云南省部分人群ABO血型基因分型

于書欣1，2，曾發(fā)明1，3，金巖章4，萬洪靜5，翟滇3，邢豫明1，3，程寶文1，3

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)，云南昆明 650500；2.云南中醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650500；3.云南省公安廳，云南昆明 650228；4.隴川縣公安局，云南隴川 678700；5.麗江市公安局，云南麗江 674100）

目的應(yīng)用SNaPshot技術(shù)對(duì)ABO血型進(jìn)行基因型檢測(cè)。方法采集107份已知血型（由血清學(xué)獲得）的云南無關(guān)個(gè)體靜脈血提取DNA，運(yùn)用SNaPshot Multiplex試劑盒對(duì)ABO血型基因的第261、297、681、703、802和803核苷酸位置的6個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)，計(jì)算相關(guān)遺傳學(xué)參數(shù)。結(jié)果107份血樣中A、B、OA、OG4個(gè)等位基因的頻率分別為0.3551、0.1682、0.2300、0.2476，其中AG和順式AB未檢出，ABO基因分型結(jié)果與血清學(xué)檢驗(yàn)的結(jié)果一致。結(jié)論SNaPshot技術(shù)適用于ABO血型基因的分型。

法醫(yī)遺傳學(xué)；ABO血型系統(tǒng)；基因檢測(cè)；SNaPshot技術(shù)

ABO等位基因核苷酸序列的成功克隆[1]，為ABO血型在DNA水平上的檢測(cè)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。ABO血型是法庭科學(xué)檢測(cè)最早的遺傳標(biāo)記之一，不僅存在于血液中，還存在于唾液、毛發(fā)、指甲等其他生物檢材中，傳統(tǒng)的血清學(xué)方法抗原抗體反應(yīng)僅能檢測(cè)血液中的ABO血型，而SNaPshot技術(shù)則可檢測(cè)除血液之外的如唾液斑、毛發(fā)、指甲等各種生物檢材的ABO基因型。目前ABO基因分型方法有直接測(cè)序聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（polymerase chain reactionsingle strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）[2]、序列特異引物（sequence specific primer，SSP）引導(dǎo)的PCR反應(yīng)（PCR-SSP）[3]以及使用通用報(bào)告引物進(jìn)行分型等，本研究應(yīng)用SNaPshot技術(shù)對(duì)107例外周血進(jìn)行檢測(cè)，現(xiàn)將ABO的基因型結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及DNA提取

云南107名無關(guān)個(gè)體的外周血樣本由昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，EDTA-Na2抗凝。

所有血樣均采用傳統(tǒng)血清學(xué)方法[4]獲知ABO血型，其結(jié)果用作DNA檢測(cè)方法的對(duì)照。用經(jīng)典的飽和酚-氯仿法提取所有樣本的DNA。

1.2 ABO血型SNP位點(diǎn)選擇及引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Doi等[5]的研究，控制ABO血型的相關(guān)基因位于第9號(hào)染色體上，ABO基因包含長度范圍為28～688bp的7個(gè)外顯子和長度約為19514bp的6個(gè)內(nèi)含子，本研究選取第6外顯子261、297和第7外顯子681、703、802、和803共6個(gè)SNP位點(diǎn)，其堿基分布特征見表1。根據(jù)文獻(xiàn)[3]中給出的6個(gè)位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR檢測(cè)及微測(cè)序。

表1 ABO血型6個(gè)SNP位點(diǎn)的序列特征

1.3 復(fù)合擴(kuò)增體系建立

采用10μL PCR擴(kuò)增體系：5U/μL FastStart Taq DNA聚合酶（德國Roche公司）0.3μL，10×FastStart Taq緩沖液（德國Roche公司）1 μL，25 mmol/μL MgCl21μL，2.5mmol/μL dNTP 1μL，多重PCR引物混合液1 μL，去離子水5.7 μL，模板DNA 1 μL。在9700型PCR擴(kuò)增儀（美國AB公司）上進(jìn)行擴(kuò)增，程序如下：95℃10min；94℃1min，65℃1min，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃7min。接著，取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入1 U/μL蝦堿性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP，德國Roche公司）1μL、10U/μL核酸外切酶（德國Roche公司）0.1 μL和0.5 μL去離子水，在9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，程序如下：37℃30 min，80℃10min，72℃7min。

1.4 SNaPshot檢測(cè)

采用SNaPshot Multiplex試劑盒（美國AB公司）進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，5 μL體系：SNaPshot復(fù)合反應(yīng)混合液0.3μL，BigDye 5×測(cè)序緩沖液1μL，延伸引物混合物1.5μL，多重PCR產(chǎn)物1μL，去離子水1.2μL。在9700型PCR擴(kuò)增儀上運(yùn)行如下程序：95℃1min；95℃10s，52℃0.05s，60℃30s，25個(gè)循環(huán)。獲得單堿基延伸產(chǎn)物，在此產(chǎn)物中直接加入1U/μL SAP 1μL和去離子水0.5μL混勻，在9700型PCR擴(kuò)增儀上運(yùn)行如下程序：37℃30min，80℃10min，72℃7min。

以GeneScan-120 Liz（美國AB公司）為內(nèi)標(biāo)，取1 μL產(chǎn)物加至10 μL甲酰胺-內(nèi)標(biāo)混合液［V（甲酰胺）∶V（內(nèi)標(biāo)）=200∶1］中，95℃變性3 min，冰浴3 min后上樣。

采用3100型遺傳分析儀（美國AB公司）進(jìn)行電泳，使用GeneMapper?ID v3.2軟件分析數(shù)據(jù)，使用Arlequin 3.5軟件統(tǒng)計(jì)基因型頻率，并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 SNP分型

經(jīng)SNaPshot技術(shù)，檢出的107名云南無關(guān)個(gè)體ABO血型各等位基因組成的基因型（圖1）與應(yīng)用傳統(tǒng)血清學(xué)獲得的分型一致，等位基因A、B、OA、OG頻率分別為0.355 1、0.168 2、0.230 0、0.247 6，AG未檢出，順式AB型未檢出。

圖1 云南人群ABO血型10種基因型的毛細(xì)管電泳圖譜

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

107名無關(guān)個(gè)體ABO血型的6個(gè)SNP位點(diǎn)共組成AA、AB、AOA、AOG、BB、BOA、BOG、OAOA、OAOG、OGOG10種基因型，各基因型頻率見表2，經(jīng)Arlequin 3.5軟件統(tǒng)計(jì)，P值均大于0.05，顯示群體基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。

表2 107個(gè)無關(guān)個(gè)體的ABO基因型頻率分布（n=107）

3 討論

3.1 SNaPshot技術(shù)檢測(cè)ABO血型的頻率分布

A和B等位基因的主要變異位點(diǎn)有261、297、681、703、802和803，其中703和803的變異決定了相應(yīng)的編碼氨基酸的變異，從而產(chǎn)生血型轉(zhuǎn)移酶A、B[6]。O等位基因261位點(diǎn)G堿基的缺失導(dǎo)致移碼突變而編碼無活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其中OA亞型在297位置上有A突變，OG亞型在681位置上有T突變。

ABO血型的基因頻率分布與民族、地區(qū)有關(guān)，我國幅員遼闊，民族眾多，血型差異甚大，利用基因分型方法研究ABO血型分布及其基因頻率分布，不僅為臨床醫(yī)學(xué)提供科學(xué)依據(jù)，也可為法醫(yī)日常檢案提供群體遺傳學(xué)基礎(chǔ)[7]。本研究采用SNaPshot技術(shù)對(duì)云南107份血樣進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)基因型AA、OAOG在該人群中頻率最高，AOA、BOA兩個(gè)基因型頻率較低。A、B、OA、OG的頻率分別為0.355 1、0.168 2、0.230 0、0.247 6，其中A型在云南人群中所占比例最大，5個(gè)等位基因的頻率分布與Doi等[5]研究的日本無親緣關(guān)系的人群頻率分布相一致，O2在中國漢族人群中未發(fā)現(xiàn)[8，9]。Itou等[8]研究了世界ABO血型及亞型的分類與分布，發(fā)現(xiàn)單倍群A是由等位基因B和O重組形成。

3.2 ABO血型SNP分型的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

本研究運(yùn)用SNaPshot技術(shù)對(duì)107份無關(guān)個(gè)體血樣進(jìn)行檢測(cè)，均獲得與血清學(xué)檢驗(yàn)相一致的ABO血型判定結(jié)果，表明本研究建立的檢測(cè)方法準(zhǔn)確、可靠。不過，在使用該體系時(shí)，由于引物濃度和模板純度的影響，導(dǎo)致各位點(diǎn)間均衡性較差，有待對(duì)引物濃度進(jìn)行調(diào)整進(jìn)一步完善該體系。

目前，雖然有多種方法可檢測(cè)SNP位點(diǎn)，如TaqMan[10，11]、基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）[12]和DNA微陣列[13]等技術(shù)，但這些技術(shù)設(shè)備昂貴，普遍適用性不強(qiáng)，而SNaPshot技術(shù)所需的毛細(xì)管電泳儀在各法醫(yī)DNA實(shí)驗(yàn)室內(nèi)均有配備，使ABO血型基因型的檢測(cè)在法醫(yī)案件中的普及應(yīng)用成為可能。

3.3 法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值

SNaPshot技術(shù)拓展了ABO血型的應(yīng)用范圍，在個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定的案件中，ABO血型檢測(cè)不再僅局限于血液的檢驗(yàn)，一些非血液檢材如毛囊、組織塊、羊水、精斑等均可檢測(cè)出ABO血型的基因型，增加了案件中可用物證檢材的種類，大大提高了對(duì)犯罪嫌疑人排查的概率；另外，在一些由血液疾病引起的血型抗原表達(dá)異常的血型診斷、B（A）等特殊血型診斷[14-16]的案件中，憑借ABO血型基因型的亞型，可為偵查提供方向。

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Genotyping of ABO Blood Group in Partial Population of Yunnan Province by SNaPshot Technology

YU Shu-xin1,2,ZENG Fa-ming1,3,JIN Yan-zhang4,WAN Hong-jing5,ZHAI Dian3,XING Yu-ming1,3, CHENG Bao-wen1,3
（1.Kunming Medical University,Kunming 650500,China;2.Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming 650500,China;3.Yunnan Provincial Public Security Department,Kunming 650228, China;4.Longchuan Public Security Bureau,Longchuan 678700,China;5.Lijiang Public Security Bureau, Lijiang 674100,China）

ObjectiveTo detect the genotype of ABO blood group by SNaPshot technology.MethodsDNA were extracted from the peripheral blood samples with known blood groups（obtained by serology）of 107 unrelated individuals in Yunnan.Six SNP loci of the 261th,297th,681th,703th,802th,and 803th nucleotide positions were detected by SNaPshot Multiplex kit,and relevant genetics parameters were calculated.ResultsIn 107 blood samples,the allele frequencies of types A,B,OA,and OGwere 0.355 1, 0.1682,0.2300 and 0.2476,respectively,while that of types AGand cis AB were not detected.The genotyping results of ABO blood group were consistent with that of serologic testing.ConclusionSNaPshot technology can be adapted for genotyping of ABO blood group.

forensic genetics;ABO blood group system;genetic testing;SNaPshot technology

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.03.013

1004-5619（2017）03-0277-04

2015-10-20）

（本文編輯：李莉）

云南省社會(huì)發(fā)展科技計(jì)劃項(xiàng)目（2008GACA012-7）

于書欣（1987—），女，碩士，主要從事法醫(yī)物證學(xué)研究；E-mail：490103194@qq.com

程寶文，男，博士，主任法醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)物證學(xué)、群體遺傳學(xué)研究；E-mail：ggcbw@vip.sina.com