褚洋，韓國憲，王堯淇，單海燕，陳溪萍，陶陸陽，張明陽

（1．蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)系，江蘇蘇州 215123；2．營口市公安局，遼寧營口 115000；3．黃河中心醫(yī)院司法鑒定中心，河南鄭州 450004；4．蘇州市立醫(yī)院北區(qū)婦產(chǎn)科，江蘇蘇州 215008）

·論著·

CBS在腦挫傷后損傷時間推斷中的作用

褚洋1，韓國憲2，王堯淇3，單海燕4，陳溪萍1，陶陸陽1，張明陽1

（1．蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)系，江蘇蘇州 215123；2．營口市公安局，遼寧營口 115000；3．黃河中心醫(yī)院司法鑒定中心，河南鄭州 450004；4．蘇州市立醫(yī)院北區(qū)婦產(chǎn)科，江蘇蘇州 215008）

目的觀察胱硫醚β合成酶（cystathionine β-synthase，CBS）在腦挫傷后皮質(zhì)中不同時段的表達變化。方法利用改良的自由落體裝置建立小鼠腦挫傷模型，通過Western印記法和免疫組織化學(xué)方法檢測不同時間點（1h、6h、12h、1d、2d、3d、7d）損傷區(qū)周圍皮質(zhì)CBS的表達變化。結(jié)果Western印跡法顯示，CBS在腦損傷后皮質(zhì)中的表達下調(diào)，在損傷3d時降到最低，于損傷7d恢復(fù)到正常水平。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，CBS在正常皮質(zhì)中有表達，損傷后表達逐漸減弱，損傷3d后陽性表達明顯減少，7d恢復(fù)到正常水平。結(jié)論CBS有望成為法醫(yī)學(xué)推斷腦挫傷后損傷經(jīng)過時間的參考指標(biāo)。

法醫(yī)病理學(xué)；腦損傷；胱硫醚β合成酶；損傷時間；小鼠

胱硫醚β合成酶（cystathionine β-synthase，CBS）是一種磷酸吡哆醛依賴酶，相對分子量63 000，由4個相同的亞基構(gòu)成同源四聚體。CBS是合成半胱氨酸和胱氨酸的限速酶，通過催化輔酶磷酸吡哆醛和S-腺苷基甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）來調(diào)節(jié)CBS活性。Northern印跡法分析顯示，CBS基因在心、腦、腎、肝等重要器官均有不同程度的表達[1]。同時，CBS也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）合成的限速酶[2]。研究證實，CBS僅在小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元中表達，參與了腦外傷后神經(jīng)元凋亡的發(fā)生發(fā)展過程[3，4]。本研究通過建立小鼠腦挫傷模型，觀察CBS在小鼠腦挫傷后皮質(zhì)中的表達變化，探討其表達在損傷時間推斷中的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

兔抗小鼠CBS抗體（sc-67154）、兔抗小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）抗體（sc-25778）購自美國Santa Cruz公司，RIPA裂解液（P0013B）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0009）、增強化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescent，ECL）試劑盒（P0018）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測試劑盒（SP-9001）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 腦挫傷模型的建立及分組

雄性CD1小鼠（體質(zhì)量25～30 g，8周齡，蘇州大學(xué)實驗動物中心提供），腹腔注射10%水合氯醛［生工生物工程（上海）股份有限公司］進行麻醉（劑量為0.1mL/10g），通過改良的自由落體打擊法建立小鼠腦挫傷模型[5]。頭部剪毛消毒，于頭皮正中切開，切口長2cm，剝離右側(cè)顱頂骨膜，固定于小鼠腦立體定位儀上，在左側(cè)頂骨處鉆一直徑4mm的骨窗［定位坐標(biāo)：前囟前后（anteroposterior，AP）1.0 mm，中線左右（lateral，LAT）1.0 mm，顱骨（硬腦膜）平面向下（dorsoventral，DEP）2.5mm］，暴露硬腦膜并使其完整。使用40g砝碼從20cm高處墜落，撞擊于硬腦膜表面上的圓柱體。撞擊硬腦膜的圓柱體直徑為3 mm，撞擊時以圓柱體下降1mm，建立腦挫傷模型，記錄打擊時間，逐層消毒以預(yù)防創(chuàng)口感染，縫合頭皮。

實驗分為正常對照組，假手術(shù)組和傷后1 h、6 h、12h、1 d、2 d、3 d、7 d組，每組6只小鼠。每組小鼠中3只用于Western印跡法，3只用于免疫組織化學(xué)染色。假手術(shù)組只做開顱手術(shù)暴露硬腦膜，正常對照組不做任何處理。

1.3 Western印跡法

提取各組損傷灶周圍2mm腦皮質(zhì)，將取好的大腦皮質(zhì)層置于250 μL組織裂解液中，超聲細胞破碎儀低溫勻漿。4℃下，以離心半徑8.3cm，14000r/min，離心30min，取上清液，-80℃冰箱保存。取1μL蛋白液，BCA試劑盒測蛋白含量，用細胞裂解液將上樣蛋白濃度調(diào)成一致。樣品按4∶1加入5×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）上樣緩沖液，混勻后沸水變性5 min。30 μg蛋白上樣電泳（分別為5%濃縮膠和10%分離膠）2 h后用蛋白濕轉(zhuǎn)裝置將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入兔抗CBS（1∶500）和GAPDH（1∶1 000）多克隆抗體，4℃孵育過夜，洗膜后用Western二抗稀釋液稀釋過的辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗（1∶1000）孵育，37℃放置2h，ECL試劑盒進行膠片顯影。膠片掃描，CBS與GAPDH的比值作為CBS的表達程度。

1.4 免疫組織化學(xué)染色法

小鼠經(jīng)腹腔麻醉后，充分暴露心臟，左心室緩慢滴注生理鹽水50mL，然后4℃下用4%多聚甲醛50mL進行灌注固定。取各組全腦后放入4%多聚甲醛固定24h，0.01mol/L PBS漂洗后放入含有10%、20%、30%梯度蔗糖中進行脫水。進行冰凍切片，厚度為10μm，取一載玻片將其附貼上即可。制得的冰凍切片儲存于-80℃超低溫冰箱。免疫組織化學(xué)染色按照生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測試劑盒說明書進行，CBS抗體4℃孵育過夜，以抗體稀釋液作為空白對照。

1.5 圖像分析與數(shù)據(jù)分析

采用Gel-Pro Analyzer 4.0軟件對Western印跡法檢測圖像進行采集及光密度分析。每組實驗在相同條件下至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較用單因素方差分析的Tukey檢驗。

在每張免疫組織化學(xué)染色切片中，于損傷側(cè)皮層取5個視野（×400），在HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)下，計算單位面積內(nèi)陽性細胞個數(shù)，取平均值表示各切片的測定結(jié)果。用Image-Pro plus 6.0圖像分析軟件測定5個陽性細胞的光密度，取平均值表示各切片的平均光密度，采用單因素方差分析的Tukey檢驗進行分析。

所有統(tǒng)計采用SPSS 16.0軟件，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Western印跡結(jié)果

Western印跡結(jié)果表明，CBS在正常腦皮質(zhì)中有表達。隨著損傷時間的延長，CBS的表達在傷后12h開始下調(diào)，于傷后3 d降到最低，CBS的表達在傷后第7天又恢復(fù)到正常水平（圖1，表1）。

圖1 腦損傷后CBS在腦皮質(zhì)中的表達變化

表1 腦損傷后不同時間CBS表達相對表達量（n=3，±s）

表1 腦損傷后不同時間CBS表達相對表達量（n=3，±s）

注：1）與假手術(shù)組比較，P<0. 05；2）與正常對照組比較，P<0.05

組別相對表達量正常對照1.389±0.042假手術(shù)1.331±0.043傷后1h1.385±0.053傷后6h1.259±0.036傷后12h0.750±0.0451）2）傷后1d0.796±0.0631）2）傷后2d0.765±0.0511）2）傷后3d0.571±0.0481）2）傷后7d1.461±0.059

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果

CBS在正常腦皮質(zhì)中有表達，染色較強且陽性細胞較多。

圖2 腦損傷后不同時間CBS免疫組織化學(xué)染色結(jié)果×200

傷后1h和6h腦皮質(zhì)陽性細胞數(shù)與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。傷后12h，陽性細胞數(shù)量明顯減少，染色強度也明顯下降。傷后3d陽性細胞數(shù)和染色強度都降到最低，而傷后7d染色明顯增強（圖2）。陽性細胞數(shù)和平均光密度值在正常對照組和假手術(shù)組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，傷后12 h、1 d、2 d、3 d組與假手術(shù)組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，CBS的表達呈先降低后增高趨勢，與Western印跡結(jié)果顯示的趨勢一致。

表2 腦損傷后不同時間CBS陽性細胞數(shù)和平均光密度（n=3，±s）

表2 腦損傷后不同時間CBS陽性細胞數(shù)和平均光密度（n=3，±s）

注：1）與正常對照組比較，P<0. 05；2）與假手術(shù)組比較，P<0.05

組別陽性細胞數(shù)平均光密度正常對照62.8±1.385.2±13.1假手術(shù)63.6±1.284.7±11.7傷后1h60.2±2.082.8±10.6傷后6h58.3±1.883.4±12.7傷后12h32.3±1.41）2）46.1±14.21）2）傷后1d25.4±2.11）2）32.8±13.81）2）傷后2d24.6±1.11）2）35.4±10.21）2）傷后3d15.7±1.61）2）25.4±13.41）2）傷后7d55.9±1.578.4±15.8

3 討論

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）在暴力性死亡中占有重要位置，具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率等特點[6，7]。而腦挫傷是一種最常見的原發(fā)性腦損傷，是指腦實質(zhì)受力后出血壞死的狀況。腦實質(zhì)包括皮質(zhì)、白質(zhì)，但腦挫傷一般以皮質(zhì)為主[8]。腦挫傷后損傷時間的推斷，一直是法醫(yī)學(xué)界研究的重點和難點。運用腦損傷后形態(tài)學(xué)改變來推斷腦損傷時間是比較常見的檢測方法。張延波等[9]應(yīng)用免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)溶酶體酶Cathepsin-B和D的高表達有助于腦損傷后期的診斷和形成時間推斷。但是，腦損傷后形態(tài)學(xué)的改變需要一定時間才能判斷，往往出現(xiàn)得相對較晚，而且各種形態(tài)學(xué)變化沒有明確的時間界限，很難直接進行損傷時間的認定。而尋找一種或者幾種特異性蛋白用于腦損傷時間推斷或者成傷機制分析，一直是國內(nèi)外法醫(yī)病理學(xué)者追尋的目標(biāo)。Chen等[10]發(fā)現(xiàn)，人腦挫傷后星形膠質(zhì)細胞中腦紅蛋白的表達可以持續(xù)12個月之久。潘泓等[5]發(fā)現(xiàn)鈣依賴性蛋白激酶Ⅱδ的動態(tài)變化，為推斷腦外傷后損傷經(jīng)過時間提供了新的參考指標(biāo)。王濤等[11]發(fā)現(xiàn)血腦屏障相關(guān)蛋白閉鎖小帶蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）在腦外傷后也呈動態(tài)變化。這些指標(biāo)都參與了繼發(fā)性損傷的病理生理過程，如鈣超載會進一步激活鈣依賴性蛋白激酶Ⅱδ，缺氧會上調(diào)腦紅蛋白的表達，ZO-1在維持血腦屏障和誘發(fā)腦水腫中起著重要的作用。這些指標(biāo)的改變可能需經(jīng)很長時間才能作出判斷，而且變化無明確的時間分界并相互重疊。因此，腦損傷時間的推斷單靠一個指標(biāo)是不夠的，需要尋求多種與損傷時間相關(guān)性較好的指標(biāo)進行綜合分析判斷。

CBS是體內(nèi)同型半胱氨酸轉(zhuǎn)硫途徑代謝的關(guān)鍵酶，也是內(nèi)源性H2S重要的合成酶。H2S被稱為第三個氣體信號分子，作為神經(jīng)遞質(zhì)在人體多個系統(tǒng)的病理生理過程中發(fā)揮重要作用[12]。CBS基因缺陷可導(dǎo)致轉(zhuǎn)硫途徑發(fā)生障礙，從而引起半胱氨酸血癥，進而導(dǎo)致多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如阿爾茨海默病、血管性癡呆、中風(fēng)等[13-15]。這提示CBS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮了重要的病理生理作用。之前的研究[3]證實，CBS在小鼠腦外傷后腦皮質(zhì)神經(jīng)元中有表達，參與了腦外傷后神經(jīng)元凋亡的發(fā)生發(fā)展過程，這提示CBS參與了腦損傷后神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和修復(fù)過程。為了確定CBS是否能夠用于傷后損傷時間的推斷，本研究通過建立小鼠TBI模型檢測了不同損傷時間后CBS的表達變化。Western印跡結(jié)果顯示，損傷后CBS的表達下調(diào)，并于傷后3d達到最低值，在傷后7d又恢復(fù)到正常水平。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，CBS陽性細胞呈圓形或者錐形，與之前報道[3]的免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果一致，進一步證實CBS在神經(jīng)元中表達。而且，在正常腦皮質(zhì)中CBS呈高強度表達，損傷后表達減弱，并于傷后3d表達明顯減弱，7d恢復(fù)到正常水平。引起CBS的表達在短時間恢復(fù)到正常水平的一個原因很可能是其轉(zhuǎn)錄水平受到調(diào)控。CBS是一個血紅素蛋白，屬于磷酸吡哆醛依賴酶中的β族，含有保守的鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白的共有序列[16]。鈣調(diào)蛋白抑制劑trifluoroperazine和W-13可以抑制H2S產(chǎn)生，這表明CBS的表達可能由鈣和（或）鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)[17]。研究[5，18]證實，腦外傷可以誘導(dǎo)鈣依賴性蛋白激酶Ⅱδ的表達，而鈣依賴性蛋白激酶Ⅱδ的高表達通過CBS基因的共有序列可以調(diào)控其轉(zhuǎn)錄水平進而上調(diào)CBS的蛋白表達。另外引起CBS損傷3 d后有上調(diào)趨勢的一個原因可能是氧化應(yīng)激水平的不斷提高。文獻[19，20]報道氧化還原應(yīng)激可以引起CBS mRNA的表達上調(diào)。

腦損傷后形態(tài)學(xué)的變化相對滯后，如果能用Western印跡法檢測各種酶、炎癥因子、細胞因子及神經(jīng)遞質(zhì)等蛋白指標(biāo)的動態(tài)變化，對于推斷早期腦損傷時間有很大的幫助。CBS的表達呈時序性變化，提示CBS參與了腦損傷后的病理過程。結(jié)合形態(tài)學(xué)的變化，CBS表達的動態(tài)變化規(guī)律有望成為法醫(yī)學(xué)實際檢案中損傷時間推斷的指標(biāo)。同時，腦損傷后CBS的表達差異，對于闡明損傷后發(fā)生的分子機制和臨床治療都有一定的幫助。但是CBS的表達并未在人體標(biāo)本進行驗證，實際案例中CBS表達是否也呈時序性變化有待進一步確定。而且，腦損傷程度的輕重對CBS的表達是否有影響也需要進一步通過實驗驗證。總的來說，單一指標(biāo)推斷腦損傷時間存在一定的局限性，需要結(jié)合多種指標(biāo)和檢測手段如形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)的方法綜合評定。

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The Role of CBS in Injury Time Estimation after Brain Contusion

CHU Yang1,HAN Guo-xian2,WANG Yao-qi3,SHAN Hai-yan4,CHEN Xi-ping1,TAO Lu-yang1,ZHANG Ming-yang1
（1.Department of Forensic Medicine,Medical College of Soochow University,Suzhou 215123,China;2.Yingkou Public Security Bureau,Yingkou 115000,China;3.Forensic Identification Center of Yellow River Hospital,Zhengzhou 450004,China;4.Department of Obstetrics and Gynecology,North District of Suzhou Municipal Hospital,Suzhou 215008,China）

ObjectiveTo observe the changes of cystathionine β-synthase（CBS）expression in the cerebral cortex after brain contusion at different times.MethodsAn experimental model of traumatic brain injury（TBI）in mice was established by an improved weight-drop device.Then Western blotting and immunohistochemical examination were used to detect the CBS expression in cerebral cortex around injury at different time points（1 h,6 h,12 h,1 d,2 d,3 d,7 d）.ResultsThe results of Western blotting revealed that the expression level of CBS was down-regulated and reached its lowest level at the 3rd days after injury,and then restored to normal level after 7 days.The results of immunohistochemistry showed that CBS was present in the normal brain cortex.CBS expression gradually decreased at the 3rd days after injury,and then restored to normal level after 7 days.ConclusionCBS has the potential to be a reference index for time estimation after brain contusion in forensic practice.

forensic pathology;brain injuries;cystathionine beta-synthase;injury time;mice

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.03.001

1004-5619（2017）03-0221-04

2015-11-27）

（本文編輯：鄒冬華）

國家自然科學(xué)基金資助項目（81601306，81301039）；中國博士后科學(xué)基金資助項目（2015M570476）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目（PAPD）；上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室開放課題資助項目（KF1502）；蘇州市科技發(fā)展計劃資助項目（SYSD2015119）

褚洋（1983—），男，碩士研究生，主要從事顱腦損傷研究；E-mail：44500937@qq.com

張明陽，男，博士，講師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)和法醫(yī)臨床學(xué)科研與教學(xué)；E-mail：ghost8469@163.com

通信作者：陶陸陽，男，博士,博士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)和法醫(yī)臨床學(xué)科研與教學(xué)；E-mail：taoluyang@suda.edu.cn