張曉偉 王加華 李培睿

(許昌學院食品與生物工程學院，許昌 461000)

紅曲米中桔霉素、淀粉、水分含量的快速測定

張曉偉 王加華 李培睿

(許昌學院食品與生物工程學院，許昌 461000)

采用近紅外光譜技術(shù)構(gòu)建紅曲米中桔霉素、淀粉、水分含量的快速測定預測模型。分別采用偏最小二乘回歸(PLS)、主成分回歸(PCR)、多元線性回歸(SMLR)構(gòu)建所測組分的數(shù)學模型，以相關(guān)系數(shù)(R)、預測相對分析偏差(RPD)、預測均方根誤差(RMSEP)、校正均方根誤差(RMSEC)值來評價模型的綜合性能。結(jié)果表明，MSC、SNV方法可以消除樣品顆粒不均對光譜的散射影響；導數(shù)處理能夠消除基線漂移問題；對于水分含量，只有PLS和PCR模型可用于較準確定量測定(RPD = 2.45和2.81)；對于淀粉，只有SMLR模型可用于較準確定量測定(RPD=2.58)；對于桔霉素，3種模型的RPD值均小于2，雖然不能用于準確定量測定，但能滿足定性分析或分級。為紅曲米生產(chǎn)過程中桔霉素、淀粉、水分含量的快速檢測提供新的方法，為紅曲米質(zhì)量的智能化控制提供新的途徑。

近紅外光譜 桔霉素 淀粉 水分含量 預測模型

紅曲色素作為一種具有多種生理功能(抗氧化、抗腫瘤、抗菌、降血壓、降血脂等多種功效)[1-3]的天然食用色素，在中國乃至全世界的食品產(chǎn)業(yè)中被廣泛使用[4-5]。隨著1995年，法國科學家Blanc課題小組[6-7]通過對具有抗菌活性的Monascidin A的分子結(jié)構(gòu)的鑒定證實，Monascidin A就是對人等哺乳動物腎臟和肝臟有毒害作用的桔霉素。隨著對桔霉素研究的深入，發(fā)現(xiàn)桔霉素還具有生殖毒性、免疫毒性、致癌性等毒性[8-10]。在我國和日本，為了避免桔霉素的危害，都對紅曲色素中桔霉素的含量制定了限量標準。桔霉素的存在嚴重制約了我國紅曲產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。除桔霉素外紅曲米中的淀粉及水分含量也決定著紅曲米品質(zhì)的高低。目前，有關(guān)紅曲米中這些指標的定性和定量測定，主要采用化學分析測定法或高效液相色譜法。這些方法往往需要對樣品進行有機溶劑提取等前處理，需要耗費大量化學試劑，且每種方法只能測定一個指標，不能同時對紅曲米中桔霉素、淀粉及水分含量的綜合指標進行測定，這嚴重限制了對紅曲米品質(zhì)的在線檢測，也無法對市場上的紅曲米進行準確分級。如何克服目前檢測方法的不足，探尋紅曲米中桔霉素等指標的快速無損檢測成為我國紅曲產(chǎn)業(yè)質(zhì)量控制的重要任務之一。

近紅外光譜檢測技術(shù)由于其具有綠色、快速、環(huán)保、無損及適用范圍廣等優(yōu)點，在農(nóng)業(yè)[11-12]、醫(yī)藥[13]、尤其是食品生產(chǎn)[14-17]等領(lǐng)域被廣泛應用。近紅外光譜檢測技術(shù)主要利用被檢測有機物質(zhì)中的官能團吸收光能后，從基態(tài)向高能級躍遷，并記錄分子中單個化學鍵[含氫基團X-H(X，C、N、O)]基頻振動的倍頻和合頻信息，通過測量近紅外光譜范圍內(nèi)含氫基團X-H振動的倍頻和合頻吸收信息來對樣品中的目標成分進行快速無損檢測。紅曲米中桔霉素、淀粉及水分的分子結(jié)構(gòu)多由這些基團構(gòu)成，這些成分的含量多少可通過基團的吸收頻譜表征。本試驗主要探究了近紅外光譜技術(shù)在紅曲米中桔霉素、淀粉及水分含量快速測定中的應用。對紅曲米中這些主要成分含量的快速無損近紅外光譜檢測模型的建立，將在紅曲米品質(zhì)的快速測定、紅曲米的分級銷售等方面發(fā)揮重要作用。

1 材料與方法

1.1 樣品與儀器

所用80 個紅曲米樣品，部分由實驗室自制，部分購自市場(武漢佳成生物制品有限公司、杭州禾田生物技術(shù)有限公司、杭州博大生物技術(shù)有限公司等)，樣品經(jīng)粉碎機粉碎后過60目篩子，收集樣品供光譜采集及桔霉素、淀粉、水分含量的測定。

ANTARISⅡ型傅里葉變換近紅外光譜儀：美國Thermo Nudet公司。

1.2 基礎數(shù)據(jù)采集

1.2.1 桔霉素測定

參照GB/T 5009.222—2008，紅曲類產(chǎn)品中桔青霉素的測定。參照固態(tài)紅曲制品的方法，并做適當修改。

準確稱取粉碎混合均勻的樣品2.000 g，加100 mL體積分數(shù)為70%的乙醇，60 ℃保溫浸提60 min，每隔10 min振蕩1次，冷卻至室溫后定容至100 mL，經(jīng)真空抽濾后，收集濾液。濾液經(jīng)0.45 μm有機濾膜過濾后進行HPLC分析。樣品中桔霉素的含量按式(1)計算：

(1)

式中：S為試樣中桔霉素含量/mg/kg；c為HPLC檢測的濃度/mg/L；n為試樣的稀釋倍數(shù)。

1.2.2 水分測定

參照GB 5009.3—2010食品中水分的測定：直接干燥法。

1.2.3 淀粉測定

參照GB/T 5009.9—2008食品中淀粉的測定：酸水解法。

采用以上方法所測得的紅曲米中桔霉素、淀粉及水分的含量，統(tǒng)計如表1所示。

表1 紅曲米中所測成分含量統(tǒng)計表

1.2.4 光譜測定

利用傅里葉變換近紅外光譜儀對所測紅曲米樣品進行近紅外光譜圖譜采集，采用儀器自帶的TQ Analyst 8.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和數(shù)學模型構(gòu)建。

經(jīng)試驗分析確定紅曲樣品光譜采集的最優(yōu)參數(shù)分別為：樣品杯直徑大小約50 mm，偏心距10 mm，光譜范圍12 000～3 800 cm-1，分辨率8 cm-1，光譜采集累積16 次平均輸出。紅曲米樣品的漫反射光譜圖譜如圖1所示。

圖1 紅曲米樣品原始近紅外光譜圖譜

由圖1可知，所有樣品的近紅外光譜圖趨勢一致，在8 318、6 764、5 786、5 154、4 733、4 325、4 015 cm-1附近有顯著吸收峰，主要表征了C-H、N-H、O-H等基團的倍頻和合頻吸收。但光譜散射現(xiàn)象明顯，主要是紅曲米粉顆粒引起散射，在后續(xù)光譜處理中要進行預處理。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

1.3.1 異常樣本剔除

建模前，采用Chauvenet檢驗在95%的置信度下來識別異常光譜。計算所有樣品光譜的馬氏距離(Mahalanobis distance，MD)，并從小到大排列。依據(jù)TQ 8.0分析軟件(Thermo Nicolet Co., 美國)的推薦，當置信度在95%時，MD閾值為1.652，根據(jù)MD閾值對所有樣品的光譜圖進行異常檢驗，結(jié)果如圖2所示，其中有2條光譜MD值超過閾值(灰色線右側(cè))，被判定為異常光譜圖。

圖2 光譜異常檢驗

樣品化學值異常的判別是通過樣品杠桿值與學生殘差進行判斷分析。樣品杠桿值的大小表明了樣品對模型的影響程度，通常位于被測組分濃度和性質(zhì)兩端(高端和低端)的樣品具有較大的杠桿值，位于被測組分和性質(zhì)均值附近的樣品杠桿值較小。學生殘差說明了與樣品杠桿值對應的樣品濃度預測能力好壞，樣品只有同時具備高的杠桿值和學生殘差，該樣品才被判別為異常樣本化學值。

以杠桿值3 倍和學生殘差值3 作為異常判定閾值。如圖3所示，當樣本淀粉的杠桿值和學生殘差值大于閾值(0.109 3)，即被判為異常。通過杠桿值和學生殘差計算分析，有8 個樣品具有較高的杠桿值和學生殘差被剔除。同理，經(jīng)計算分析桔霉素和水分分別有4和6 個樣品異常，異常樣品剔除后進行建模。

圖3 紅曲米中淀粉杠桿值和學生殘差散點圖

1.3.2 樣本分集

采用上述方法進行淀粉及水分含量成分異常樣本的識別。余下的樣品以其含量從低到高進行排序，按照3∶1比例將正常樣品分為校正集和預測集，其中最大值和最小值均應在校正集。表2為本試驗樣品中桔霉素、淀粉及水分含量的統(tǒng)計參數(shù)。樣品值具有較大的差異性，變異系數(shù)(Coefficients of variation，CV)范圍較寬。

表2 紅曲米中各成分化學值的統(tǒng)計結(jié)果

1.3.3 光譜預處理

樣品近紅外光譜圖譜不僅受被檢測物化學成分濃度的影響，還受其物理特性的影響，且樣品光譜間差異主要是由于其物理特性引起的[17]。為了提高檢測目標的光譜信息有必要對樣品光譜圖譜進行預處理。樣品的均勻程度、粒徑大小和光程遠近往往影響樣品近紅外光譜圖譜的形狀，在解決由樣品的粒徑不均勻或測樣容器不一致對樣品近紅外光譜的影響上，多采用多元散射校正技術(shù)(MSC)和標準歸一化(SNV)處理。經(jīng)過MSC和SNV處理后，光譜如圖4a和圖4b所示，基本消除了因紅曲米顆粒不均勻而引起的樣品光譜圖譜散射現(xiàn)象。

消除基線和其他背景的干擾通常采用導數(shù)處理，從而分辨重疊峰，提高分辨率和靈敏度。常用的導數(shù)處理方法有一階導數(shù)處理(First derivative, 1D)和二階導數(shù)處理(Second derivative, 2D)。經(jīng)過1D和2D處理后，紅曲樣品的近紅外光譜圖譜如圖5所示，經(jīng)導數(shù)處理后雖然消除了光譜基線漂移，但同時局部噪聲也被放大，在實際應用時，往往在后續(xù)進行Savitzky-Golay (S.G)卷積平滑或Norris導數(shù)濾波(NDF)處理，以消除高頻噪聲。

圖4 經(jīng)MSC和SNV處理后紅曲米近紅外光譜

圖5 經(jīng)一階導和二階導處理后紅曲米近紅外光譜

1.4 模型構(gòu)建方法與評價參數(shù)

1.4.1 建模方法

主要采用多元線性回歸(Stepwise Multiple Linear Regression, SMLR)、 偏最小二乘回歸(Partial least squares, PLS)、主成分回歸(Principal Component Regression, PCR)3種方法構(gòu)建近紅外光譜對紅曲米中桔霉素、淀粉及水分含量測定的預測模型。

1.4.2 模型評價參數(shù)

近紅外光譜模型的穩(wěn)健性及適應性評價通常采用相關(guān)系數(shù)(Correlation coefficient of calibration,R)、校正均方根誤差(Root mean square error of calibration，RMSEC)、預測均方根誤差(Root mean square error of predication，RMSEP)、預測相對分析偏差(Ratio of prediction to deviation，RPD)等指標來進行評定。

當R≥0.90時，說明模型具有良好精度；當0.70≤R<0.89時，模型具有較好精度；當0.50≤R<0.69時，模型可用于定性測定評價；當R<0.49時，模型穩(wěn)健性較差。RMSEP值越小，RPD值越大，表明所建模型對未知樣品的預測性能越好。

2 結(jié)果與分析

2.1 SMLR模型的建立

采用TQ Analyst 8.0軟件建立紅曲米中桔霉素、淀粉及水分含量的SMLR模型。光譜數(shù)據(jù)處理方法相互獨立，采用正交處理，以RMSECV為評價標準，確定數(shù)據(jù)預處理最優(yōu)組合方法。依照相關(guān)性大小選擇變量數(shù)，當變量逐漸增加時入選信息增加，模型的RMSECV值減小，當過渡引入變量時(引入了部分噪聲等非目標信息)，其RMSECV值又增加，因此以最小的RMSECV值確定最優(yōu)變量數(shù)。模型輸出結(jié)果如相關(guān)系數(shù)(R)、建模標準偏差(RMSEC)及預測標準偏差(RMSEP)值如表3所示。

表3 紅曲色素的SMLR模型結(jié)果統(tǒng)計表

注：*1D為一階導數(shù)光譜，MSC為多元散射校正，S.G為卷積平滑。

由表3可知，紅曲米中桔霉素、淀粉和水分的相關(guān)系數(shù)均大于0.85，表明SMLR模型具有較好的穩(wěn)健性。從RPD 值來看，淀粉、水分模型可用于精確定量預測；桔霉素素模型可以滿足定量分級。

利用紅曲米中各組分的SMLR模型對未知紅曲樣品中桔霉素、淀粉和水分含量進行預測時，預測結(jié)果具有較高的線性和良好預測精度(RPD = 1.18～ 3.25)。紅曲米中桔霉素、淀粉和水分的SMLR模型的校正集和預測集樣品的真實值與預測值分別如圖6所示。

圖6 紅曲米成分的SMLR模型預測結(jié)果

2.2 PLS模型的建立

采用內(nèi)部交叉驗證法，在各成分的最佳主因子條件下，建立了桔霉素、淀粉及水分含量的PLS模型，如表4所示。

表4 紅曲米成分的PLS模型結(jié)果統(tǒng)計表

注：*1D為一階導數(shù)光譜，SNV為標準正交化，S.G為卷積平滑。

由表4可知，紅曲米中桔霉素、淀粉、水分PLS模型的相關(guān)系數(shù)均大于0.8，表明紅曲米中這些成分的PLS模型具有較好的穩(wěn)健性。水分PLS模型(RPD=2.45)可以滿足定量分級；桔霉素(RPD=1.29)和淀粉(RPD=1.95)模型相對較差，只能滿足一般定性分級。

采用紅曲米各組分PLS模型對未知紅曲樣品中桔霉素、淀粉和水分含量進行預測時，預測結(jié)果具有良好的線性關(guān)系和預測精度(RPD=1.29～2.45)。紅曲米中桔霉素、淀粉和水分的PLS模型的校正集和預測集樣品的真實值與預測值分別如圖7所示。

圖7 紅曲米成分的PLS模型預測結(jié)果

2.3 PCR模型的建立

采用全譜數(shù)據(jù)進行數(shù)學模型構(gòu)建時，計算量大，而且在有些光譜區(qū)域內(nèi)樣品的光譜信息很弱，與樣品成分含量間的相關(guān)性較差。采用主成分分析可以壓縮數(shù)據(jù)，將較多變量轉(zhuǎn)化為較少的新變量，且變量相互獨立。采用主成分分析構(gòu)建模型時選取最佳主成分數(shù)至關(guān)重要，當選取的主成分數(shù)過多時，可能引入噪聲；當選取的主成分數(shù)過少時，可能丟失部分信息。在紅曲米中各成分最佳主因子數(shù)條件下，得到了紅曲米中桔霉素、淀粉、水分含量的PCR模型，如表5所示。

表5 紅曲米成分的PCR模型結(jié)果統(tǒng)計表

注：1D為一階導數(shù)光譜，MSC為多元散射校正，S.G為卷積平滑。

由表5可知，紅曲米中桔霉素、淀粉和水分PCR模型的相關(guān)系數(shù)均大于0.7，表明紅曲米中3種成分的PCR模型具有較好的穩(wěn)健性。水分PCR模型(RPD=2.81)可以滿足定量分級；桔霉素(RPD=1.43)和淀粉(RPD=1.52)模型相對較差，只能滿足一般定性分級。

采用紅曲米中各組分的PCR模型對未知紅曲樣品中桔霉素、淀粉和水分含量進行預測時，預測結(jié)果具有良好的線性關(guān)系和預測精度(RPD=1.43～2.81)。紅曲米中桔霉素、淀粉和水分PCR模型的校正集和預測集樣品的真實值與預測值分別如圖8所示。

圖8 紅曲米成分的PCR模型預測結(jié)果

3 結(jié)論

分別采用SMLR、PLS、PCR構(gòu)建了紅曲米中桔霉素、淀粉和水分含量的近紅外光譜快速檢驗預測模型。在對光譜預處理上，通過MSC、SNV方法消除紅曲米粉顆粒不均對光譜的散射影響；通過對光譜的導數(shù)處理消除了樣品近紅外光譜的基線漂移現(xiàn)象；對于光譜高頻噪聲的消除，采用S-G卷積平滑和Norris導數(shù)濾波的方法。通過馬氏距離(MD)識別光譜異常樣本，對于樣品中化學異常值的識別是通過杠桿值和學生殘差來實現(xiàn)的。結(jié)果表明，桔霉素、淀粉和水分含量的3種預測模型均具有良好的穩(wěn)健性，且預測性能較好。對于水分含量，只有PLS和PCR模型可用于較準確定量測定(RPD=2.45和2.81)；對于淀粉，只有SMLR模型可用于較準確定量測定(RPD=2.58)；對于桔霉素，3種模型的RPD值均小于2，雖然不能用于準確定量測定，但能滿足定性分析或分級。此模型的建立將為紅曲米中桔霉素、淀粉、水分含量的快速檢測提供新的方法。

[1]Kim C, Jung H, Kim Y O, et al. Antimicrobial activities of amino acid derivatives of Monascus pigments[J]. FEMS Microbiology Letters, 2006, 264(1): 117-124

[2]Hong S, Lee I, Kim S, et al. Improved functionality of soft soybean curd containing Monascus fermented soybean ethanol extract[J]. Food Science and Biotechnology, 2012, 21(3): 701-707[3]Lee C L, Pan T M. Development of Monascus fermentation technology for high hypolipidemic effect[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 94(6):1449-1459

[4]Lin Y L，Wang T H，Lee M H，et al．Biologically active components and nutraceuticals in the Monascus-fermented rice：a review[J]．Applied Microbiology and Biotechnology，2008，77(5)：965-973

[5]Mohan Kumari H P，Akhilender Naidu K，Vishwanatha S，et al．Safety evaluation of Monascus purpureus red mould rice in albino rats[J]．Food and Chemical Toxicology，2009，47(8)：1739-1746

[6]Pattanagul P，Pinthong R，Phianmongkhol A，et al．Review of angkak production (Monascus purpureus)[J]．Chiang Mai Journal of Science，2007，34(3)：319-328

[7]Wua T S，Yang J J，Yub F Y，et al．Evaluation of nephrotoxic effects of mycotoxins，citrinin and patulin，on zebrafish(Danio rerio)embryos[J]．Food and Chemical Toxicology，2012，50(12)：4398-4404

[8]Han Q Q，Yu L B，Guo Y Q，et al．Toxic effects of citrinin on the male reproductive system in mice[J]．Experimental and Toxicologic Pathology，2012，64(5)：465-469

[9]Islam Mohammad Rafiqul，Roh Yoon-Seok，Cho Ara，et al．Immune modulatory effects of the foodborne contaminant citrinin in mice[J]．Food and Chemical Toxicology 2012，50(10)：3537-3547

[10]Lee C I，Hwang J F．Monascus-fermented red mold rice exhibits cytotoxic effect and induces apoptosis on human breast cancer cells[J]．Applied Microbiology and Biotechnology，2013，97(3)：1269-1278

[11]丁海泉, 盧啟鵬. 近紅外光譜技術(shù)在土壤養(yǎng)分分析中的研究進展及應用前景[J]. 光譜學與光譜分析, 2012, 32(1): 88-91 Ding Haiquan, Lu Qipeng. Research progress and application prospect of near infrared spectroscopy in soil nutrition analysis[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2012, 32(1): 88-91

[12]Cozzolino D. Use of near infrared spectroscopy(NIRS)to analyse animal feeds[J]. Agrociencia, 2002, 6: 25-32

[13]錢慧敏, 陳海燕, 王旻, 等. 近紅外標記技術(shù)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應用[J]. 藥物生物技術(shù), 2006, 13(4): 306-309 Qian Huimin, Chen Haiyan, Wang Min, et al. The near-infrared labeling conjugates and their application in biopharmaceutics[J]. Pharmaceutical Biotechnology, 2006, 13(4): 306-309

[14]Nicola? B M, Beullensa K, Bobelyna E, et al. Nondestructive measurement of fruit and vegetable quality by means of NIR spectroscopy: a review[J]. Postharvest Biology and Technology, 2007, 46(2): 99-118

[15]王田子, 鄭麗敏, 田立軍, 等. 近紅外在乳及乳制品質(zhì)量檢測中的研究進展[J]. 光譜學與光譜分析, 2010, 30(12): 3208-3212 Wang Tianzi, Zheng Limin, Tian Lijun, et al. Analysis of milk and dairy products by near-infrared spectroscopy: a review[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2010, 30(12): 3208-3212

[16]徐霞, 成芳, 應義斌. 近紅外光譜技術(shù)在肉品檢測中的應用和研究進展[J]. 光譜學與光譜分析, 2009, 29(7): 1876-1880 Xu Xia, Cheng Fang, Ying Yibin. Application and recent development of research on near-infrared spectroscopy for meat quality evaluation[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2009, 29(7): 1876-1880

[17]張曉偉, 王加華, 王昌祿, 等. 基于近紅外光譜技術(shù)檢測紅曲米中的紅曲色素含量[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2014, 30(5):273-279 Zhang Xiaowei, Wang Jiahua, Wang Changlu, et al. Determination of monascus pigments inred yeast rice using near infrared spectroscopy (NIR). Modern Food Science and Technology , 2014, 30(5):273-279

Rapid Determination of Citrinin, Starch and Moisture Content in Red Yeast Rice

Zhang Xiaowei Wang Jiahua Li Peirui

(College of Food Science and Engineering, Xuchang University1, Xuchang 461000)

Prediction models about the rapid determination of citrinin, starch, and moisture content in red yeast rice was built using Near Infrared Spectroscopy (NIR). Principal component regression (PCR), partial least squares (PLS) and Stepwise multiple linear regression (SMLR) were used to develop the prediction model, and correlation coefficient (R), ratio of prediction to deviation (RPD), root mean square error of predication (RMSEP) and root mean square error of calibration (RMSEC) were suggested to evaluate the performance of models. The results showed that MSC, SNV could eliminate spectral scattering causing by uneven red yeast rice parcels. Derivative treatment could eliminate the baseline drift. For moisture content, only PLS and PCR models were available for accurate quantitative determination (RPD were 2.45 and 2.81). For starch, only SMLR model can be used accurate quantitative determination (RPD were 2.58). For citrin, RPD value of the three models were less than two, so it could not be used to accurate quantitative determination, but could be used to qualitative analysis or classification. The studies had shown that near-infrared spectroscopy technology has the potential beneficial for measure eitrinin, stach and moisture content in red yeast rice online and is conducive to intelligent quality control of red yeast rice.

NIR, citrinin, starch, moisture, prediction model

河南省教育廳科技攻關(guān)項目(13B180242)，河南省高等學校重點科研項目(16A550005)，許昌學院重點科研項目(2016080)

2015-10-05

張曉偉，男，1982年出生，博士，食品微生物。

王加華，男，1979年出生，博士，農(nóng)產(chǎn)品無損檢測

TS201.3

A

1003-0174(2017)06-0152-07