王志恒，劉雅琴，馮翠娥，李仁杰，陳啟鵬

（北方民族大學生物科學與工程學院，寧夏葡萄與葡萄酒技術創(chuàng)新中心，國家民委發(fā)酵釀造工程生物技術重點實驗室，寧夏銀川750021）

寧夏賀蘭山東麓釀酒酵母分離篩選及菌株鑒定

王志恒，劉雅琴*，馮翠娥，李仁杰，陳啟鵬

（北方民族大學生物科學與工程學院，寧夏葡萄與葡萄酒技術創(chuàng)新中心，國家民委發(fā)酵釀造工程生物技術重點實驗室，寧夏銀川750021）

為進一步探究寧夏賀蘭山東麓釀酒葡萄酵母菌的多樣性，更好開發(fā)利用葡萄產(chǎn)區(qū)酵母菌資源。從寧夏賀蘭山東麓的西夏王陵、紅寺堡、玉泉營、青銅峽、張裕十五世酒莊地區(qū)的葡萄園土壤、葡萄漿果表皮以及葡萄自然發(fā)酵過程中進行酵母菌的分離篩選，對得到的122株酵母菌株運用WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進行初步分類，同時結合26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析。共鑒定出克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、大隱球酵母（Cryptococcus magnus）共 5種酵母菌。進而初步確定寧夏賀蘭山東麓釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)酵母菌的主要種類，為地方特色葡萄酒酵母菌的篩選和選育提供理論基礎和研究依據(jù)。

釀酒葡萄；酵母菌；分離篩選；分子鑒定

寧夏賀蘭山東麓具有典型的氣候特征和獨特的地理條件，是中國葡萄栽培的最適生態(tài)區(qū)之一，也是近年來新興的葡萄酒產(chǎn)區(qū)[1]。在傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)，酵母菌由于逐漸適應了當?shù)氐臍夂驐l件、土壤和葡萄品種，以及自然選擇的作用，形成了適合當?shù)仄咸丫频奶赜械奶烊粌?yōu)良酵母菌株分布，具有很強的地域特性，有助于釀酒師釀造出風味復雜而又有品種典型性的獨特葡萄酒[2]。

2007年劉愛國等[3]對采集自廣夏三基地葡萄園的酵母菌鑒定為6屬7種；同時，劉愛國[4]對分離自西夏王陵葡萄園的酵母菌鑒定為4屬4種；對篩選于玉泉營農(nóng)場葡萄園的酵母菌鑒定為4屬5種；2008年王惠等[5]對采集自賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)共18個葡萄品種樣品自然發(fā)酵，被測酵母菌株鑒定為10屬19種。2009年王國平等[6]將御馬葡萄酒廠葡萄基地的酵母菌鑒定為5屬7種，2009年宋育陽等[7]用蛇龍珠葡萄品種進行自然發(fā)酵，對分離的酵母菌進行鑒定得到4屬5種；2010年宋育陽等[8]將御馬葡萄基地的神索葡萄品種自然發(fā)酵，將分離獲得的酵母菌鑒定為4屬5種。前人的研究表明，寧夏賀蘭山東麓釀酒葡萄酵母菌種類多、資源豐富。

本試驗從寧夏賀蘭山東麓的西夏王陵、紅寺堡、玉泉營、青銅峽、張裕摩塞爾十五世酒莊5個地區(qū)葡萄園樣品進行分離篩選，采用WL培養(yǎng)基初步分類，并進行分子鑒定，為篩選和選育具有地方特色葡萄酒酵母菌提供理論基礎和研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1 試劑與主要儀器

正向引物 NL1（5’-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG-3’）和反向引物 NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）、酵母基因組DNA提取試劑盒：康為世紀生物科技有限公司；APOLLO PCR儀、BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)美國伯樂公司；SPX-150B智能型生化培養(yǎng)箱：上海瑯玕實驗設備有限公司；DYCP-31B瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)：北京六一儀器廠等。

1.1.2 培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基[9]（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸粉10，瓊脂20，自然pH值，121℃滅菌20 min；用于酵母菌的分離篩選和菌種保藏。

WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[10]（g/L）：酵母浸粉4，胰蛋白胨 5，葡萄糖 5，瓊脂 20，磷酸二氫鉀0.055，氯化鉀0.425，氯化鈣 0.125，氯化鐵 0.0025，硫酸鎂 0.125，硫酸錳0.002，溴甲酚綠0.022，pH值為6.5左右，121℃滅菌20 min，用于酵母菌的初步形態(tài)分類。

1.1.3 酵母菌分離樣品來源

寧夏賀蘭山東麓的張裕十五世酒莊、西夏王陵、紅寺堡、玉泉營、青銅峽葡萄園釀酒葡萄自然發(fā)酵的不同時期、葡萄漿果、土壤作為酵母菌的分離樣品。

1.2 酵母菌的分離篩選

1.2.1 漿果中酵母菌的分離篩選

稱取成熟葡萄漿果1 g，破碎，加入裝有9 mL無菌水的三角瓶中，振蕩10 min，制成菌懸液，采用梯度稀釋的方法，將適宜稀釋度菌懸液涂布接種到固體YEPD培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)1 d～3 d，結合菌落顏色和形態(tài)，挑取單菌落，用平板劃線法在固體YEPD培養(yǎng)基上純化，接入斜面，4℃保藏待用。

1.2.2 葡萄園土壤中酵母菌的分離篩選

稱取土壤0.1 g，加10 mL無菌水，攪拌均勻，取上清，采用梯度稀釋的方法涂布接種到固體YEPD培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)1 d～3 d，結合菌落顏色和形態(tài)，挑取單菌落，用平板劃線法在固體YEPD培養(yǎng)基上進一步純化，接入斜面，4℃保藏待用。

1.2.3 自然發(fā)酵過程中酵母菌的分離篩選

發(fā)酵過程中酵母菌株的分離：采集成熟葡萄漿果手工破碎后，取葡萄汁（帶部分皮渣）置于200 mL三角瓶中，進行自然發(fā)酵。分別于發(fā)酵前期、中期、后期取1 mL發(fā)酵汁，加9 mL無菌水進行梯度稀釋涂布，挑取單菌落劃線純化，接入斜面，4℃保藏待用。

1.3 WL培養(yǎng)基對菌株的初步分類[10]

將保藏的不同來源的酵母菌株用液體YEPD培養(yǎng)基活化后，采用梯度稀釋涂布的方法接種于WL培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3 d～7 d后，觀察記錄菌落的顏色和形態(tài)。

1.4 酵母菌株鑒定

1.4.1 酵母菌株基因組DNA提取

本試驗酵母基因組DNA提取方法參照酵母基因組DNA提取試劑盒（康為世紀）提取法。

1.4.2 26S rDNA D1/D2序列的擴增與測序

擴增需要的引物和反應液組成參考劉愛國[3]等試驗方法，進行PCR擴增。PCR擴增程序：95℃，5 min；（94 ℃、45 s；52 ℃、1 min；72 ℃、30 s）共 30個循環(huán)；72℃，8 min。電泳確認目標產(chǎn)物有無效果。所得PCR產(chǎn)物送交昆泰銳生物公司純化測序。

1.4.3 酵母菌株序列分析

對所測菌株的26S rDNA D1/D2序列圖譜校正，提交GenBank，并在GenBank中進行在線分析（BLAST search），比較測試菌株與酵母菌種模式菌株對應序列的相似程度，對相似度超過99%以上的菌株對其做出種屬鑒定[11]。

2 結果與分析

2.1 寧夏賀蘭山東麓釀酒葡萄酵母菌分離篩選結果

本試驗共分離篩選到酵母菌122株，其中西夏王陵、紅寺堡、玉泉營、青銅峽、張裕十五世酒莊分別分離篩選酵母菌29株、19株、20株、22株和32株。部分酵母菌株分離純化結果如圖1所示。

2.2 寧夏賀蘭山東麓釀酒葡萄酵母菌在WL培養(yǎng)基上的初步形態(tài)分類結果

對分別從土壤、漿果、自然發(fā)酵過程分離篩選的122株野生酵母菌株，在WL培養(yǎng)基上培養(yǎng)所形成的菌落顏色和形態(tài)在體視解剖鏡下觀察的菌落特征，與Cavazza[12]和Pallman[13]描述的菌落特征對照，初步分類鑒定為10個酵母菌類型，形態(tài)特征見圖2。

圖1 部分酵母菌株分離純化結果圖Fig.1 Some yeast strains and purification results

2.3 寧夏賀蘭山東麓釀酒葡萄酵母菌在WL培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

寧夏賀蘭山東麓釀酒葡萄酵母菌在WL培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)見表1～表5。

依據(jù)表1的菌落顏色及形態(tài)記錄與Cavazza[11]和Pallman[12]描述的菌落特征對照，菌落類型Ⅰ為克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）；菌落類型II為美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）；菌落類型 III為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）；菌落類型Ⅳ為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；菌落類型Ⅴ為大隱球酵母（Cryptococcus magnus）；菌落類型Ⅵ為紅酵母（Rhodutorula）；菌落類型Ⅶ為葡萄酒有孢漢生酵母（Hanseniaspora vineae）；菌落類型Ⅷ未能鑒定。

表1 張裕摩塞爾十五世酒莊釀酒酵母菌WL培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)描述Table 1 The colonial morphology description of the Saccharomyces cerevisiae of Chateau Changyu Moser XV on WL nutrient agar

表2 紅寺堡葡萄園釀酒酵母菌WL培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)描述Table 2 The colonial morphology description of the Saccharomyces cerevisiae of Hongsibu on WL nutrient agar

表3 玉泉營葡萄園釀酒酵母菌WL培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)描述Table 3 The colonial morphology description of the Saccharomyces cerevisiae of Yuquanying on WL nutrient agar

表4 青銅峽葡萄園釀酒酵母菌WL培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)描述Table 4 The colonial morphology description of the Saccharomyces cerevisiae of Qingtongxia on WL nutrient agar

表5 西夏王陵葡萄園釀酒酵母菌WL培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)描述Table 5 The colonial morphology description of the Saccharomyces cerevisiae of Xixia Dynasty on WL nutrient agar

依據(jù)表2的菌落顏色及形態(tài)記錄Cavazza[11]和Pallman[12]描述的菌落特征對照，菌落類型Ⅰ為克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）；菌落類型II為美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）；菌落類型 III為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）；菌落類型Ⅳ為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；菌落類型Ⅴ為大隱球酵母（Cryptococcus magnus）；菌落類Ⅷ未能鑒定。

依據(jù)表3的菌落顏色及形態(tài)記錄與Cavazza[11]和Pallman[12]描述的菌落特征對照，菌落類型Ⅰ為克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）；菌落類型II為美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）；菌落類型 III為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）；菌落類型Ⅴ為大隱球酵母（Cryptococcus magnus）；菌落類型Ⅶ為葡萄酒有孢漢生酵母（Hanseniaspora vineae）；菌落類型Ⅸ未能鑒定。

依據(jù)表4的菌落顏色及形態(tài)記錄與Cavazza[11]和Pallman[12]描述的菌落特征對照，菌落類型Ⅰ為克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）；菌落類型II為美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）；菌落類型III為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）；菌落類型Ⅳ為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；菌落類型Ⅴ為大隱球酵母（Cryptococcus magnus）。

依據(jù)表5的菌落顏色及形態(tài)記錄與Cavazza[11]和Pallman[12]描述的菌落特征對照，菌落類型Ⅰ為克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）；菌落類型II為美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）；菌落類型III為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）；菌落類型Ⅳ為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；菌落類型Ⅴ為大隱球酵母（Cryptococcus magnus）；菌落類型Ⅶ為葡萄酒有孢漢生酵母（Hanseniaspora vineae）；菌落類型Ⅷ、Ⅹ未能鑒定。

2.4 26S rDNA D1/D2鑒定結果

依據(jù)酵母菌在WL培養(yǎng)基上的菌落特征及形態(tài)分類結果，選出具有代表性的10株酵母菌進行分類鑒定。用校正后的26S rDNA D1/D2區(qū)序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行在線同源序列比對（BLAST search），所得結果如表6。

表6 26S rDNA D1/D2菌株鑒定結果Table 6 26S rDNA D1/D2 Strain identification results

3 結論

對從寧夏賀蘭山東麓的葡萄園土壤、葡萄漿果表皮以及葡萄自然發(fā)酵過程中獲得的122株野生酵母菌株，通過在WL培養(yǎng)基上的通過在培養(yǎng)基上的培養(yǎng)結果，依據(jù)菌落顏色及形態(tài)記錄，可將酵母菌分為10類。菌落類型Ⅰ為克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）；菌落類型II為美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）；菌落類型III為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）；菌落類型Ⅳ為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；菌落類型Ⅴ為大隱球酵母（Cryptococcus magnus）；菌落類型Ⅵ為紅酵母（Rhodutorula）；菌落類型Ⅶ為葡萄酒有孢漢生酵母（Hanseniaspora vineae）；菌落類型Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ未能鑒定。

依據(jù)WL培養(yǎng)基的初步分類，選出具有代表性菌種類型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ各2株，結合26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析，可以將菌株分為5類，這5種類型分別為克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、大隱球酵母（Cryptococcus magnus）。

本試驗初步確定寧夏賀蘭山東麓釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)母菌的主要種類，為地方特色葡萄酒酵母菌的篩選和選育提供理論基礎和研究依據(jù)。

[1]宋育陽.寧夏賀蘭山葡萄酒廠酵母菌的鑒定及多樣性研究[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學碩士論文,2009

[2] 張春芝,莫寅斌.寧夏產(chǎn)區(qū)釀酒葡萄酵母菌初步分類鑒定及多樣性研究[J].中國釀造,2014,33(10):49-54

[3] 劉愛國,劉延琳,王澤舉,等.寧夏葡萄自然發(fā)酵過程中酵母菌的分子生物學鑒定[J].西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版),2008,36(11):203-207

[4] 劉愛國.寧夏賀蘭山東麓葡萄釀酒酵母菌的分離及其分類鑒定[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學,2008

[5] 王慧,張立強,劉天明.葡萄果粒表皮酵母菌多樣性研究[J].微生物學通報,2008,35(1):10-14

[6] 王國平,宋育陽,裴穎芳,等.寧夏御馬葡萄酒廠野生酵母菌株的分離篩選及分子鑒定[J].中國釀造,2009(8):38-41

[7] 宋育陽,裴穎芳,劉延琳.蛇龍珠自然發(fā)酵過程酵母菌的種類和動態(tài)變化[J].釀酒科技,2009(7):33-35

[8] 宋育陽,白穩(wěn)紅,劉延琳.神索葡萄自然發(fā)酵酵母菌群研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學學報,2010,29(4):513-517

[9] 薛軍俠,徐艷文,楊瑩,等.WL培養(yǎng)基在釀酒酵母篩選中的應用[J].中國釀造,2007,26(9):36-39

[10]張春芝,莫寅斌.寧夏產(chǎn)區(qū)釀酒葡萄酵母菌初步分類鑒定及多樣性研究[J].中國釀造,2014,33(10):49-54

[11]Cavazza A,Grando M S,Zini C.Rilevazione della flora microbicadi most ievini[J].Vignevini,1992,9:17-20

[12]Pallmann C L,Brown J A,Olineka T L,et al.Use of WL Medium to Profile Native Flora Fermentations[J].Am.J.Enol.Vitic,2001,52(3):198-203

[13]Heard G.Novel yeasts in winemaking-looking to the future[J].Food Australia,1999,51:347-352

Isolation and Identification of Saccharomyces cerevisiae Strain of East Helan Mountain Area in Ningxia

WANG Zhi-heng，LIU Ya-qin*，F(xiàn)ENG Cui-e，LI Ren-jie，CHEN Qi-peng
（College of Biological Science and Engineering，North University for Nationalities，Grape and Wine Innovation Center of Ningxia，Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biotechnology of State Ethnic Affairs Commission，Yinchuan 750021，Ningxia，China）

In order to further explore the diversity of Saccharomyces cerevisiae of Helan Mountain Area in Ningxia and realize better development and utilization of Saccharomyces cerevisiae resources，the wine grape regions of Mausoleum of Xixia Dynasty，Hongsibu，Yuquanying，Qingtongxia and Chateau Changyu Moser XV were taken as the research object.The Saccharomycetes in the soil was isolated，screened and observed in the natural fermentation process of grape berries epidermis and the fruit.The 122 Saccharomycetes strainswere preliminarily classified based on WL nutrient agar，and 26S rDNA D1/D2 sequence analysis was conducted.Totally，5 kinds of Saccharomycetes were identified in this study，including Pichia kluyveri，Metschnikowia pulcherrima，Hanseniaspora uvarum，Saccharomyces cerevisiae and Cryptococcus magnus.Thus the main species of Saccharomycetes in the wine grape region of Helan Mountain Area in Ningxia was preliminarily determined，which provides theoretical foundation and research basis for the screening and breeding of local Saccharomyces cerevisiae.

wine grape；Saccharomycetes；isolation and screening；molecular identification

2016-09-18

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.039

北方民族大學區(qū)級大學生創(chuàng)新訓練計劃項目（nxcx2015128）；寧夏葡萄與葡萄酒技術創(chuàng)新中心科研項目（1505）

王志恒（1992—），男（漢），本科在讀，專業(yè)：生物技術。

*通信作者：劉雅琴（1965—），女（漢），副教授，本科，研究方向：微生物資源開發(fā)利用。