程春振, 馬文昇, 劉煒?gòu)O, 張梓浩, 齊 全, 孫雪麗, 張永艷, 賴鐘雄

(福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002)

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三明野生蕉和天寶蕉對FocTR4侵染早期應(yīng)答的差異

程春振, 馬文昇, 劉煒?gòu)O, 張梓浩, 齊 全, 孫雪麗, 張永艷, 賴鐘雄

(福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002)

以GFP標(biāo)記的香蕉枯萎病菌FocTR4作為病原菌，比較了水培條件下FocTR4對“天寶蕉”和三明野生蕉的早期侵染情況.研究表明，F(xiàn)ocTR4在“天寶蕉”韌皮部的定殖明顯早于三明野生蕉.枯萎病菌感染香蕉后會誘發(fā)香蕉細(xì)胞內(nèi)活性氧爆發(fā)和激活寄主抗氧化系統(tǒng).通過研究水培和土培條件下兩種香蕉種質(zhì)接種枯萎病菌后根系超氧化物歧化酶(SOD)變化情況，發(fā)現(xiàn)三明野生蕉根系SOD活性高于“天寶蕉”，三明野生蕉感染枯萎病后根系SOD活性增強(qiáng)，而“天寶蕉”根系SOD活性下降，說明三明野生蕉的耐枯萎病能力可能與其根系較高和早期上調(diào)的SOD活性有關(guān).

香蕉; 枯萎病; 綠色熒光蛋白; 超氧化物歧化酶; 早期應(yīng)答

香蕉(Musaspp.)是全球重要的經(jīng)濟(jì)作物，是僅次于柑橘的第二大水果，同時也是僅次于水稻、小麥和玉米的第四大糧食作物[1].我國是香蕉的重要原產(chǎn)地，種植面積達(dá)41.3×104hm2，年產(chǎn)1 000多萬噸，是世界上第二大香蕉生產(chǎn)國[2].香蕉產(chǎn)業(yè)已成為我國華南地區(qū)重要的農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)，然而近年來香蕉正遭受香蕉枯萎病的嚴(yán)重危害[3].Molina[4]研究表明，香蕉枯萎病是世界農(nóng)業(yè)史上記載的分布最廣、最具毀滅性的植物病害，是香蕉產(chǎn)業(yè)最大的威脅.目前該病害已發(fā)生在全球幾乎所有的香蕉產(chǎn)區(qū)，并有迅速蔓延的趨勢.

香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴專化型(Fusariumoxyporumf. sp.cubense,Foc)引起的土傳真菌病害.該病原菌根據(jù)寄主范圍，可分為1號(Focrace 1)，2號(Focrace 2)和4號(Focrace 4)生理小種.其中，4號小種根據(jù)其溫度適應(yīng)性的不同又可分為亞熱帶4號小種(Subtropical race 4,FocSTR4)和熱帶4號小種(Tropical race 4,FocTR4).FocTR4的致病寄主范圍最廣，致病能力也最強(qiáng).國際香蕉和大蕉改良網(wǎng)絡(luò)組織主席Emile Frison于2003年甚至發(fā)出警告：香蕉可能會因為FocTR4的危害在十年內(nèi)滅絕！2013年，以香蕉作為糧食作物的非洲首次發(fā)現(xiàn)了FocTR4，引起了國際上的強(qiáng)烈關(guān)注[3].

Foc進(jìn)入土壤后，在沒有香蕉寄主的情況下仍可生存長達(dá)30年之久，使得香蕉枯萎病的防治難度極大[5,6].目前，香蕉枯萎病的防治辦法主要有化學(xué)防治、農(nóng)業(yè)防治、生物防治等.盡管做了很多探索，到目前為止仍未找到有效的化學(xué)試劑和農(nóng)業(yè)、生物防治方法[7].抗病品種的選育是應(yīng)對香蕉枯萎病的最根本、最有效、最持久的方法[8].栽培香蕉抗性較差，野生蕉在長期自然進(jìn)化過程中保留了大量優(yōu)良基因，在抗病、抗寒和抗逆等方面均表現(xiàn)出良好特性，為香蕉育種提供了重要的遺傳資源[9,10].因此，有學(xué)者提出可以在栽培蕉選育中適當(dāng)引入野生蕉基因(主要是B基因組基因)進(jìn)而提高香蕉抗逆能力.

福建野生蕉資源豐富，已有研究表明，三明野生蕉在自然條件下很少出現(xiàn)枯萎病染病癥狀，枯萎病檢出率也很低，說明其可能是研究野生蕉抗/耐枯萎病機(jī)理的理想材料.本研究擬以三明野生蕉和福建地區(qū)大量種植的“天寶蕉”為材料，比較分析枯萎病菌在二者根系中的定殖情況.枯萎病菌感染香蕉后會誘發(fā)香蕉細(xì)胞內(nèi)活性氧爆發(fā)，活性氧的清除需要抗氧化活性物質(zhì)的參與，因此香蕉感染枯萎病后細(xì)胞抗氧化物質(zhì)活性可作為研究香蕉-枯萎病菌互作機(jī)制的重要指標(biāo)[7,11].超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)是普遍存在于植物中的一類抗氧化活性物質(zhì)，有研究指出SOD活性越高，植物的抗逆性越強(qiáng)，發(fā)病程度越低[12,13].因此進(jìn)一步研究了三明野生蕉和“天寶蕉”感染枯萎病后根系SOD活性的變化情況，以期為揭示野生蕉抗/耐病機(jī)理奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用“天寶蕉”和三明野生蕉組培苗均由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供，組培苗經(jīng)生根煉苗后移栽至基質(zhì)中.待香蕉苗長至四葉一心時將其分成2組，一組培養(yǎng)于改良Hoagland培養(yǎng)液中，另一組繼續(xù)種植于基質(zhì)中，水培1周后用于枯萎病菌侵染.接種所用GFP標(biāo)記的FocTR4病原菌由福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院云英子老師提供.

1.2 枯萎病菌孢子懸浮液的制備及孢子萌發(fā)情況觀察

取出-20 ℃保存于斜面培養(yǎng)基的GFP標(biāo)記的FocTR4，室溫復(fù)蘇1～2 h.取邊緣菌絲接種于PDA培養(yǎng)基中部，于28 ℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)1周后用無菌水洗下菌體，經(jīng)6層無菌紗布過濾，獲得枯萎病菌孢子懸浮液.

為確保孢子活性，將部分孢子懸浮液4 000 r·min-1離心5 min，用液體PDA培養(yǎng)基重懸孢子.在28 ℃，150 r·min-1的搖床中培養(yǎng).每隔4 h取1 mL菌液于激光共聚焦顯微鏡(Olympus，型號：FV1200)下觀察孢子活性及萌發(fā)能力，具體步驟參照Li et al[14]的方法.

1.3 枯萎病菌侵染試驗

在光學(xué)顯微鏡下，用細(xì)胞計數(shù)器計算孢子濃度.分別向培養(yǎng)液和基質(zhì)中倒入終濃度為5×106個·mL-1的孢子懸浮液.分別于接種病原菌后0、5、10、20和25 h取水培的“天寶蕉”和三明野生蕉根系，用無菌水沖洗根系，然后置于激光共聚焦顯微鏡(Olympus，型號：FV1200)下觀察侵染情況.

1.4 SOD活性測定

接種病原菌后0、5、10、20和25 h分別取水培和土培的“天寶蕉”和三明野生蕉根系，用于SOD活性測定，具體步驟參照鄧貴明的方法[7].

2 結(jié)果與分析

2.1 枯萎病菌孢子活力及萌發(fā)情況

為觀察早期香蕉枯萎病菌孢子的萌發(fā)情況，在制備好孢子懸浮液后0、4、8、12 h進(jìn)行取樣，并在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察，4個不同時段孢子的形態(tài)結(jié)構(gòu)如圖1所示.在0 h時，孢子成圓球形，GFP熒光較強(qiáng)，說明孢子活力較好；4 h時，孢子伸長，說明此時孢子已經(jīng)開始萌發(fā)；8 h時，已經(jīng)可以觀察到較為細(xì)長的菌絲；12 h時，在熒光共聚焦顯微鏡下可以觀察到完整的菌絲體.通過GFP熒光的觀察，說明實驗室保存的GFP標(biāo)記的FocTR4菌株活性較高，可用于后續(xù)枯萎病菌接種試驗.

A-D分別為在PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)了0(A)、4(B)、8(C)和12 h(D)的GFP標(biāo)記的Foc TR4孢子.

2.2 枯萎病菌侵染情況

在激光共聚焦顯微鏡下觀察香蕉枯萎病菌侵染香蕉材料過程.如圖2所示，0 h時“天寶蕉”和三明野生蕉根上均沒有發(fā)現(xiàn)綠色熒光；5 h時“天寶蕉”和三明野生蕉根表皮層開始觀察到GFP，說明已有孢子開始附著于根部；10 h時，可以觀察到有枯萎病菌入侵到“天寶蕉”根系維管束，且枯萎病菌萌發(fā)管進(jìn)一步延伸，而此時三明野生蕉根系中并沒有發(fā)現(xiàn)枯萎病菌入侵到維管束的情況；20 h時，在“天寶蕉”根系維管束內(nèi)發(fā)現(xiàn)了伸長的枯萎病菌菌絲，而此時，在三明野生蕉中僅發(fā)現(xiàn)菌絲附著于根表皮附近；25 h時，“天寶蕉”根系維管束內(nèi)部發(fā)現(xiàn)了大量GFP標(biāo)記的枯萎病菌菌絲，在三明野生蕉根系維管束中也開始發(fā)現(xiàn)枯萎病菌定殖，但三明野生蕉維管束中發(fā)現(xiàn)的枯萎病菌菌絲明顯短于“天寶蕉”中發(fā)現(xiàn)的菌絲，說明三明野生蕉根系可能是通過分泌一些抗菌物質(zhì)進(jìn)而阻止枯萎病菌的入侵和抑制枯萎病菌的生長.

圖2 枯萎病菌在“天寶蕉”(上圖)和三明野生蕉(下圖)根系中的侵染情況

2.3 枯萎病菌侵染對三明野生蕉和“天寶蕉”根系SOD活性的影響

根據(jù)枯萎病菌侵染情況，確定0、5、10、20和25 h為取樣時間點.分別在這5個時間點取樣，用于SOD酶活性的測定.如圖3所示，水培條件下的“天寶蕉”、三明野生蕉的根系SOD活性分別高于各自土培材料的SOD活性；三明野生蕉根系SOD活性也高于“天寶蕉”.枯萎病敏感品種“天寶蕉”在水培環(huán)境或土培環(huán)境下，其SOD活性都是是呈緩慢下降趨勢，這可能與它的感病性有關(guān)；而三明野生蕉在水培環(huán)境或土培環(huán)境下，其SOD活性總是略微下降后，又開始升高，直至達(dá)到峰值，說明三明野生蕉在感染枯萎病菌后抗氧化能力上升，這可能與它的耐病性有關(guān).

圖3 水培和土培“天寶蕉”(A和B)及三明野生蕉(C和D)接種枯萎病菌后根系SOD活性變化情況

3 討論

耐病性是植物與其病原生物在長期的互作過程中協(xié)同進(jìn)化、相互選擇、相互適應(yīng)的結(jié)果[5,15].植物抗病、耐病生理生化機(jī)制復(fù)雜，防御酶在這個過程中發(fā)揮著重要的作用.病原侵入植物體后，植物會產(chǎn)生化學(xué)物質(zhì)，如超氧陰離子自由基、過氧化氫等來抵御病原的入侵，而這些物質(zhì)的產(chǎn)生又會對植物細(xì)胞造成危害[16-18].這時候植物就會提高相應(yīng)清除這些有害物質(zhì)的防御酶(如SOD等)活性，使植物體免受毒害或減輕傷害.因而，正常植株酶活性的高低、侵染后植株防御酶的活性變化可作為耐病品種篩選的指標(biāo)之一[19].

本試驗中敏感品種“天寶蕉”在水培和土培條件下SOD活性都是緩慢下降；而三明野生蕉SOD活性都是先下降后上升.說明三明野生蕉能更好地清除體內(nèi)由枯萎病菌入侵產(chǎn)生的活性氧，減輕植株受到的毒害[20].另外，本研究還發(fā)現(xiàn)：在水培條件下，枯萎病菌入侵三明野生蕉維管束的速率要慢于“天寶蕉”，且入侵后菌絲的生長、伸長情況弱于“天寶蕉”，這說明三明野生蕉根系啟動了抗逆防御機(jī)制，在病原菌侵染早期便表現(xiàn)出了更強(qiáng)的抗病性.這種抗病性能力可能與其根系中較高的SOD活性有關(guān).

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(責(zé)任編輯:吳顯達(dá))

Comparisons of early responses of ‘Tianbaojiao’ banana and Sanming wild banana toFocTR4 infection

CHENG Chunzhen, MA Wensheng, LIU Weihua, ZHANG Zihao, QI Quan,SUN Xueli, ZHANG Yongyan, LAI Zhongxiong

(Institute of Horticultural Biotechnology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

GFP-labeledFocTR4 was used to infect Sanming wild banana and ‘Tianbaojiao’ banana, and its colonization was evaluated by spore and root development under laser scanning confocal microscope and superoxide dismutase (SOD) analysis of root. Colonization was first detected in the root phloem of ‘Tianbaojiao’ banana. Higher SOD activity was found in Sanming wild banana. And opposite changing patterns of SOD activity were found between 2 banana germplasms, with up-regulation being in Sanming wild banana and down-regulation in ‘Tianbaojiao banana’. It could be concluded that the higher and up-regulated SOD activity in the early infection stage is attributed to Fusarium wilt tolerance of Sanming wild banana.

banana; fusarium wilt; green fluorescent protein; superoxide dismutase; early response

2016-11-13

2016-12-30

國家自然科學(xué)基金項目(31601713)；福建省中青年教師教育科研項目(JAT160166)；福建農(nóng)林大學(xué)A類人才科研啟動基金(61201400707)；福建省省級扶貧重點縣科技人員專項計劃(K15160001A)；福建農(nóng)林大學(xué)博士后啟動基金(13230097).

程春振(1986-)，男，講師.研究方向：園藝植物生物技術(shù).Email：ld0532cheng@126.com.通訊作者賴鐘雄(1966-)，男，研究員.研究方向：園藝植物生物技術(shù).Email：Laizx01@163.com.

S668.1;S436.68

A

1671-5470(2017)04-0397-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.04.006