牛 瑩，蔣林珊

（大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116622）

納米管輔助紫杉醇化療口腔舌癌的增敏療效分析

牛 瑩，蔣林珊

（大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116622）

旨在研究多壁碳納米管負(fù)載紫杉醇后對(duì)口腔舌癌SCC-15細(xì)胞的影響，探討多壁碳納米管負(fù)載紫杉醇后化療口腔舌癌的增敏療效作用。通過制備多壁碳納米管和多壁碳納米管-多烯紫杉醇載藥系統(tǒng)，分別與SCC-15口腔舌癌細(xì)胞共育，采用CCK-8檢測(cè)活性，Prestoblue檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，免疫組化法檢測(cè)P53蛋白的表達(dá)，hoechst/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，探討碳納米管對(duì)紫杉醇化療口腔舌癌的敏感性是否提高，為臨床化療腫瘤提供了新方法。

多壁碳納米管；紫杉醇；多壁碳納米管-紫杉醇；SCC-15口腔舌癌細(xì)胞

0 引言

舌癌是人類最常見的腫瘤之一，臨床治療多以化療為主，剛開始治療效果好，但是一段時(shí)間后易復(fù)發(fā)，對(duì)人體健康危害嚴(yán)重。治療舌癌的化療藥中，以新型抗腫瘤藥物多烯紫杉醇最為有效，但多烯紫杉醇（Paclitaxel）水溶性差，口服生物利用度不高，多以靜脈注射進(jìn)行治療，臨床注射劑應(yīng)用時(shí)，其溶劑毒性較大，干擾藥效[1]。所以迫切需要研制生物利用度高、毒性低的多烯紫杉醇新劑型，以提高其臨床療效。多壁碳納米管為一種中間空心的管腔，有很大的比表面積，對(duì)多種藥物有較強(qiáng)的負(fù)載能力，和很好的細(xì)胞滲透能力，可運(yùn)載化療藥物進(jìn)入細(xì)胞或組織，在此過程中，并不影響藥物的性能，且對(duì)癌細(xì)胞有很好的抑制作用，對(duì)正常細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生明顯的毒副作用，從而達(dá)到更好地化療口腔舌癌的效果[2]。

為提高紫杉醇化療口腔舌癌的敏感性，本研究以口腔舌癌SCC-15細(xì)胞系為模型，擬用抗腫瘤藥物多烯紫杉醇負(fù)載于碳納米管上，研發(fā)一種具有臨床應(yīng)用前景的載藥納米復(fù)合植入劑，通過載藥碳納米管系統(tǒng)和單純紫杉醇進(jìn)行腫瘤治療的體外實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等手段，采用細(xì)胞增殖和毒性檢測(cè)、細(xì)胞周期檢測(cè)等方法，檢測(cè)紫杉醇負(fù)載于碳納米管后對(duì)腫瘤化學(xué)治療的敏感性。為臨床化療腫瘤提供新方法。

1 多壁碳納米管的制備和純化

采用化學(xué)沉淀法制備多壁碳納米管（MWCNTS），用天平稱取250 mg MWCNTs加入到250 mL的濃H2SO4和濃 HNO3混合物(體積比=3:1)中，將樣品置于超聲清洗器中進(jìn)行處理5 h，10000 r/min，20 min，經(jīng)微孔濾膜抽濾，用移液槍取超純水清洗至調(diào)整PH至7.0，置于80℃條件下待其干燥至恒重后，備用。

2 多壁碳納米管-多烯紫杉醇載藥系統(tǒng)的制備

取一定量的多烯紫杉醇，加入無水乙醇溶解，再加入一定量的 MWCNTs，在探頭超聲下，慢慢加入一定量的ddH2O清洗，10000 r/min，高速離心10 min，獲取MWCNTs-多烯紫杉醇溶液；吸出上清液，加入一定量的表面活性劑，在超聲中處理2 h，10000 r/min，離心 10 min，去除游離的多烯紫杉醇和未分散的MWCNTs，得到載藥MWCNTs-多烯紫杉醇溶液，分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

3 細(xì)胞培養(yǎng)、檢測(cè)及結(jié)果

3.1 SCC-15細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

將消化液（0.25%胰蛋白酶）從冰箱中取出，加熱使其融化；打開紫外燈照射超凈工作臺(tái)30 min，用75%酒精溶液擦凈；取對(duì)數(shù)生長的SCC-15細(xì)胞，吸出舊培養(yǎng)液，加入3 mLPBS緩沖液，充分震蕩；加入0.25%胰蛋白酶消化液，消化5～10 min；在倒置顯微鏡下仔細(xì)觀察培養(yǎng)瓶，待培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞腫脹或細(xì)胞增大后停止消化；取適量DMEM-F12培養(yǎng)液（含10%小牛血清），輕輕吹洗培養(yǎng)瓶底層貼有細(xì)胞的部分，使細(xì)胞脫落并分散形成細(xì)胞懸液，1000 r/mim，離心5 min；吸出離心管的上清液，加入培養(yǎng)液（含10%小牛血清）2 mL，輕輕吹打使之成為均勻的細(xì)胞懸液，進(jìn)行分裝；寫上細(xì)胞的種類和日期，做好標(biāo)記。稍微擰松培養(yǎng)瓶蓋，置于 37℃，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)胞生長狀況；

3.2 細(xì)胞毒性檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)將 MWCNTs-多烯紫杉醇溶液和單純紫杉醇溶液按不同濃度分6組。按照CCK-8法，6組的濃度分別2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 μg/mL，作用數(shù)小時(shí)后，計(jì)算其對(duì)SCC-15細(xì)胞生長的抑制率表示其對(duì) SCC-15細(xì)胞的毒性。取對(duì)數(shù)生長期的SCC-15 細(xì)胞按 6×103個(gè)/孔（200 μL）接種于 96 孔培養(yǎng)板中；將培養(yǎng)板放于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后分別將藥物倍比稀釋，形成6個(gè)級(jí)別的濃度。每一濃度的化療藥物設(shè)6個(gè)平行孔，每個(gè)孔加入藥物20 μL，并設(shè)立陰性對(duì)照組（只加培養(yǎng)液，無細(xì)胞和藥物），陽性對(duì)照組（有細(xì)胞和培養(yǎng)液，無藥物），置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，倒置顯微鏡下觀察；每孔加入CCK-8溶液20 μL；將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h；最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的OD值，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組的OD值/對(duì)照組的OD值）×100%

設(shè)計(jì)不同濃度的多壁碳納米管-紫杉醇實(shí)驗(yàn)組和單純紫杉醇實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，作用24 h后，觀察兩種藥物對(duì)SCC-15細(xì)胞生長的抑制率，由此評(píng)價(jià)兩種藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果見圖1，藥物濃度在 4 μg/mL以下時(shí)對(duì) SCC-15細(xì)胞的抑制率較低（＜40%），且各濃度組之間無顯著差異（P＞0.05），隨著藥物濃度的增高，抑制率的差別逐漸增大。和單純紫杉醇藥物組相比，多壁碳納米管-紫杉醇藥物組的抑制率最高，與單純紫杉醇藥物組差別顯著（P＜0.05）。

圖1 不同濃度的多壁碳納米管-紫杉醇和單純紫杉醇對(duì)細(xì)胞生長的抑制作用

3.3 多壁碳納米管-紫杉醇和紫杉醇載藥系統(tǒng)對(duì)SCC-15細(xì)胞生長的抑制

本實(shí)驗(yàn)分為多壁碳納米管-紫杉醇藥物組，紫杉醇藥物組，無藥對(duì)照組，每組設(shè) 6個(gè)復(fù)孔，采用Prestoblue法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長期的SCC-15細(xì)胞按6×103（200 μL/孔）接種于96孔培養(yǎng)板中，放于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后更換DMEN-F12培養(yǎng)液；向兩藥物組加入受試藥物各 200 μL，無藥對(duì)照組加入培養(yǎng)液 200 μL，充分混勻后在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h；加入Prestoblue 5 μL，10min后用酶標(biāo)儀檢測(cè)560 nm處的OD值。

細(xì)胞增殖抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組的OD值/無藥對(duì)照組的OD值）×100%

多壁碳納米管-紫杉醇和紫杉醇均能抑制口腔舌癌SCC-15細(xì)胞增殖，與無藥對(duì)照組相比，均有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)果見表 1，多壁碳納米管-紫杉醇對(duì)SCC-15細(xì)胞的增值抑制率比紫杉醇高6%。

表1 多壁碳納米管-紫杉醇和紫杉醇載藥系統(tǒng)對(duì)SCC-15細(xì)胞增殖的抑制率

3.4 P53蛋白檢測(cè)

取以上各組細(xì)胞（無藥對(duì)照組、紫杉醇組、MWCNTs-紫杉醇組）經(jīng) 10000 r/mim,離心后取載玻片進(jìn)行細(xì)胞涂片；向每張涂片加過氧化氫溶液2 mL，室溫下孵育20 min；用PBS洗3次，每次5 min；加非免疫動(dòng)物血清50 μL，室溫下孵育10 mim，再用吸管吸取PBS沖洗1次；加入50 μL的P53抗體（一抗），4℃培養(yǎng)24 h；用吸管吸取PBS沖洗3次，每次5 min；吸取50 μL生物素標(biāo)記的第二抗體，加到涂片上，室溫下孵育10 min；PBS沖洗3次，每次5 min；加入鏈親和素-過氧化物酶溶液，室溫下孵育10 mim；PBS沖洗3次，每次5 min；加入100 μL新鮮配制的的DAB溶液，置顯微鏡下觀察細(xì)胞；用自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，中性樹脂封固。

免疫組化法檢測(cè)P53蛋白的表達(dá)，由圖2、圖3所示，相對(duì)于無藥對(duì)照組圖4，單純紫杉醇組和多壁碳納米管-紫杉醇組均抑制突變型P53蛋白的表達(dá)，多壁碳納米管-紫杉醇組更為明顯。

圖2 培養(yǎng)24h紫杉醇組細(xì)胞突變型p53蛋白的表達(dá)（sp*200）

圖3 培養(yǎng)24 h多壁碳納米管-紫杉醇組細(xì)胞突變型p53蛋白的表達(dá)（sp*200）

圖4 培養(yǎng)24 h無藥對(duì)照組細(xì)胞突變型p53蛋白的表達(dá)（sp*200）

3.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

對(duì)數(shù)生長的 SCC-15細(xì)胞2×105/孔接種于 24孔培養(yǎng)板中，置培養(yǎng)箱中24 h后，分為三組，對(duì)照組1（空白組）和對(duì)照組2分別加入10 μg/mL的無血清培養(yǎng)液，單純的多烯紫杉醇溶液，實(shí)驗(yàn)組加入MWCNTs-多烯紫杉醇，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h；加入PBS洗3遍；加入5 μg/mL的hoechst33342，避光染色 10 min；加入 15 μg/mL 的 PI，避光染色 10 min；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光。

結(jié)果判斷：正常細(xì)胞為低藍(lán)光/低紅光，壞死細(xì)胞為低藍(lán)光/高紅光,早期凋亡細(xì)胞為高藍(lán)光/低紅光，晚期凋亡細(xì)胞高藍(lán)光/紅光。

如表2所示，空白組可見細(xì)胞核呈均勻彌散的低藍(lán)色熒光，紅色熒光少見；單純紫杉醇組除可見到低藍(lán)色熒光以外，還可見少量高藍(lán)色和紅色熒光(晚期凋亡細(xì)胞)；多壁碳納米管-紫杉醇組可見高藍(lán)色熒光（早期凋亡細(xì)胞）和部分紅色熒光（晚期凋亡細(xì)胞），由此可知紫杉醇組和多壁碳納米管-紫杉醇組與空白組比較，細(xì)胞凋亡數(shù)量多，而紫杉醇組晚期細(xì)胞凋亡數(shù)較少，多壁碳納米管-紫杉醇組晚期細(xì)胞凋亡數(shù)量多，說明多壁碳納米管-紫杉醇組比紫杉醇組具有更高的誘導(dǎo)SCC-15口腔舌癌細(xì)胞凋亡的作用。

表2 hoechst33342、PI雙染法檢測(cè)口腔舌癌細(xì)胞SCC-15細(xì)胞內(nèi)熒光（100×）

4 討論

紫杉醇是從紅豆杉中提取出來的化合物，在化療口腔舌癌方面療效較好，但是由于其水溶性差，口服生物利用度不高，多以靜脈注射進(jìn)行治療，臨床注射劑應(yīng)用時(shí)，其溶毒性較大，嚴(yán)重干擾了藥效，這就限制了紫杉醇靜脈注射化療腫瘤。所以，研制生物相容性好、利用度高及毒性低的多烯紫杉醇成為當(dāng)前人們的關(guān)注的焦點(diǎn)。目前，國內(nèi)外多烯紫杉醇新劑型的探究熱點(diǎn)主要集中在靶向性和水溶性兩個(gè)方面，常用的且研究較為廣泛的有脂質(zhì)體、膠束、納米粒等，這些藥物能準(zhǔn)確地到達(dá)腫瘤病灶，并緩慢的釋放。但是這些藥物也有很大的毒副反應(yīng)，如過敏反應(yīng)，對(duì)心、腎及神經(jīng)也有一定程度的毒副作用等[3]。且靶向性不強(qiáng)，粒徑大小不穩(wěn)定，因此，粒徑大小恒定、水溶性好、藥物釋放緩慢及靶向性好的 MWCNTs-Paclitaxel制劑成為研究當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[4,5]。

有研究者[6]將Paclitaxel吸附到了PLGA（聚合納米粒）上，在對(duì)該聚合納米粒進(jìn)行表面修飾，由此降低細(xì)胞毒性。使多烯紫杉醇在正常組織的蓄積顯著減少，使腫瘤病灶的靶向性大大提高。Mu[7]采用萃取技術(shù)制備的PLGA納米微球，其平均粒徑為納米級(jí)，這種納米級(jí)的結(jié)構(gòu)能顯著減少對(duì)正常細(xì)胞的損害。張景勍等[8]通過蒸發(fā)法制備的紫杉醇制劑，在外加磁場(chǎng)的作用下，可以使Paclitaxel準(zhǔn)確的到達(dá)腫瘤病灶，提高了靶向性。本研究用沉淀法制備 MWCNTs，并將其負(fù)載于 Paclitaxel上，形成 MWCNTs-Paclitaxel溶液。進(jìn)行了一系列的體外檢測(cè)試驗(yàn)，以達(dá)到提高Paclitaxel的靶向性和細(xì)胞抑制率，降低毒副作用的效果。在細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，我們將MWCNTs-Paclitaxel溶液和單純的 Paclitaxel溶液分別分為 6個(gè)濃度組（2.0～64.0 μg/mL），與SCC-15細(xì)胞共育數(shù)小時(shí)后，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率表示表示對(duì)口腔舌癌SCC-15細(xì)胞的毒性。結(jié)果表明，兩個(gè)藥物組均能抑制細(xì)胞的增殖，當(dāng)藥物濃度在 4 μg/mL以下時(shí)，對(duì)SCC-15細(xì)胞的抑制率較低（＜40%），各濃度組之間無明顯差異（P＞0.05）,隨著藥物濃度增加，抑制率差別逐漸增大，和單純的多烯紫杉醇組相比，MWCNTs-Paclitaxel組的抑制率高，與單純Paclitaxel組差別顯著（P＜0.05）,表明低濃度的MWCNTs-Paclitaxel對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性小，高濃度的MWCNTs-Paclitaxel對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性大，且有劑量依賴性，由此可知，MWCNTs-Paclitaxel有很好的靶向性。在此之前，研究者Joshi M等[9]將甲氨蝶呤與C60富勒烯和MWCNTs進(jìn)行偶聯(lián)，用MTT法進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)，研究表明該復(fù)合物在一定濃度下對(duì)腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的毒性。然而，近年來，碳納米管的生物安全性同樣引起了人們的注意。Hu S等[10]將聚乙二醇修飾的MWCNTs注射到BALBA/c小鼠體內(nèi)，與單用MWCNTs相比，小鼠的免疫功能基本不受影響。高寧寧等[11]將功能化的MWCNTs進(jìn)行小鼠腹腔注射，觀察其對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的影響，研究發(fā)現(xiàn)修飾后的MWCNTs的生物相容性大大改善。為此，為了提高碳納米管的生物相容性，減少對(duì)正常組織的損害，今后的研究還應(yīng)從多種角度，用不同的方法來研究其毒理作用。

紫杉醇作為重要的化療藥物，特異性作用于細(xì)胞的G2期和M期，從而阻斷細(xì)胞的增殖。MTT法和Prestoblue法是體外檢測(cè)細(xì)胞活性常用的方法，但是因?yàn)镸TT還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物水溶性低，需要溶解后才能檢測(cè)，所以選用Prestoblue檢測(cè) MWCNTs-Paclitaxel和單純Paclitaxel對(duì)口腔舌癌SCC-15細(xì)胞生長的抑制率，結(jié)果表明：在與SCC-15細(xì)胞共育72小時(shí)后，MWCNTs -Paclitaxel和單純Paclitaxel均能抑制SCC-15細(xì)胞的增殖，且與無藥對(duì)照組相比，都具有顯著地差異性。其中，MWCNTs-Paclitaxel藥物組對(duì)SCC-15細(xì)胞的增殖抑制率比單純Paclitaxel組高6%。付旭東[12]將NGR-SWCNTs-Paclitaxel納米制劑與MCF-7細(xì)胞共育72小時(shí)后，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，并選用了不同的細(xì)胞株進(jìn)行檢測(cè)，如SMMC-7721肝癌細(xì)胞、PC-3前列腺癌細(xì)胞、EC9706食管癌細(xì)胞等，結(jié)果表明以碳納米管為載體的制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用與多項(xiàng)研究結(jié)果一致[13,14]。除了細(xì)胞活性的檢測(cè)外，我們進(jìn)行了P53蛋白的表達(dá)和細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。

P53蛋白是一種抑癌基因，當(dāng)受到刺激后可突變?yōu)榘┗?，因此失活的P53基因?qū)δ[瘤的形成非常重要，并對(duì)其發(fā)生和發(fā)展有很大的影響。P53蛋白的突變與很多人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程息息相關(guān)。Bosari等[15,16]采用免疫組化法抑制大腸癌P53蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了大腸癌預(yù)后差的原因是由于P53基因蛋白過表達(dá)。本研究采用免疫組化法，將MWCNTs-Paclitaxel和單純的多烯紫杉醇與 SCC-15細(xì)胞共育，再在顯微鏡下觀察。由于P53蛋白突變后，其半衰期變短、構(gòu)象改變，所以可以被檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：兩組藥物均能抑制突變型 P53蛋白的表達(dá)，以MWCNTs-Paclitaxel更為明顯。早前，柴瀟瀟[17]研究發(fā)現(xiàn) Paclitaxel可以使癌細(xì)胞凋亡。本研究采用hoechst33342/PI雙染法檢測(cè)了細(xì)胞凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MWCNTs-Paclitaxel和單純的 Paclitaxel都能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但是MWCNTs-Paclitaxel較單純的Paclitaxel具有更顯著的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。還有研究者[18]認(rèn)為GDF3過表達(dá)可以促進(jìn)Paclitaxel誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。今后，在分子水平上探討Paclitaxel誘導(dǎo)SCC-15細(xì)胞凋亡的機(jī)制將成為我們的研究重點(diǎn)。

5 結(jié)論

紫杉醇載藥的MWCNTs對(duì)SCC-15口腔舌癌細(xì)胞有明顯的細(xì)胞增殖抑制率，能顯著的抑制P53蛋白的表達(dá)以及更顯著地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。所以可以認(rèn)為和單純的紫杉醇相比，碳納米管提高了紫杉醇化療口腔舌癌的敏感性，碳納米管紫杉醇載藥系統(tǒng)治療腫瘤的療效顯著提高，為臨床化療腫瘤提供了新方法。

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Nanotubes Auxiliary Paclitaxel Chemotherapy Sensitization Effect Analysis of Oral Tongue Cancer

NIU Ying, JIANG Lin-shan
(College of Medicine, Dalian University, Dalian 116622, China)

To study on multi-walled carbon nanotubes load after paclitaxel on SCC - 15 oral tongue cancer cell, the influence of load explore multi-walled carbon nanotubes paclitaxel chemotherapy after the sensitization effect of oral tongue cancer. Through the preparation of multi-walled carbon nanotubes and multi-walled carbon nanotubes -polyene taxol drug delivery system, respectively with SCC to 15 oral tongue cancer cells produced, tested by CCK-8 testing activity, Prestoblue detection cell proliferation inhibition rate, immunohistochemical method to detect the expression of P53 protein, hoechst/PI double staining to detect apoptosis, explore carbon nanotubes on taxol oral tongue cancer chemotherapy sensitivity is improved, which provides a new way for clinical tumor chemotherapy.

multi-walled carbon nanotubes; Paclitaxel; multi-walled carbon nanotubes-Paclitaxel; oral squamous cell carcinomaSCC-15 cells

R739.8

A

1008-2395(2017)03-0063-06

2017-05-22

?，摚?974-），女，講師，博士，研究方向：口腔醫(yī)學(xué)。