牛 瑩,蔣林珊
(大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院,遼寧 大連 116622)
納米管輔助紫杉醇化療口腔舌癌的增敏療效分析
牛 瑩,蔣林珊
(大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院,遼寧 大連 116622)
旨在研究多壁碳納米管負(fù)載紫杉醇后對(duì)口腔舌癌SCC-15細(xì)胞的影響,探討多壁碳納米管負(fù)載紫杉醇后化療口腔舌癌的增敏療效作用。通過制備多壁碳納米管和多壁碳納米管-多烯紫杉醇載藥系統(tǒng),分別與SCC-15口腔舌癌細(xì)胞共育,采用CCK-8檢測(cè)活性,Prestoblue檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率,免疫組化法檢測(cè)P53蛋白的表達(dá),hoechst/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡,探討碳納米管對(duì)紫杉醇化療口腔舌癌的敏感性是否提高,為臨床化療腫瘤提供了新方法。
多壁碳納米管;紫杉醇;多壁碳納米管-紫杉醇;SCC-15口腔舌癌細(xì)胞
舌癌是人類最常見的腫瘤之一,臨床治療多以化療為主,剛開始治療效果好,但是一段時(shí)間后易復(fù)發(fā),對(duì)人體健康危害嚴(yán)重。治療舌癌的化療藥中,以新型抗腫瘤藥物多烯紫杉醇最為有效,但多烯紫杉醇(Paclitaxel)水溶性差,口服生物利用度不高,多以靜脈注射進(jìn)行治療,臨床注射劑應(yīng)用時(shí),其溶劑毒性較大,干擾藥效[1]。所以迫切需要研制生物利用度高、毒性低的多烯紫杉醇新劑型,以提高其臨床療效。多壁碳納米管為一種中間空心的管腔,有很大的比表面積,對(duì)多種藥物有較強(qiáng)的負(fù)載能力,和很好的細(xì)胞滲透能力,可運(yùn)載化療藥物進(jìn)入細(xì)胞或組織,在此過程中,并不影響藥物的性能,且對(duì)癌細(xì)胞有很好的抑制作用,對(duì)正常細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生明顯的毒副作用,從而達(dá)到更好地化療口腔舌癌的效果[2]。
為提高紫杉醇化療口腔舌癌的敏感性,本研究以口腔舌癌SCC-15細(xì)胞系為模型,擬用抗腫瘤藥物多烯紫杉醇負(fù)載于碳納米管上,研發(fā)一種具有臨床應(yīng)用前景的載藥納米復(fù)合植入劑,通過載藥碳納米管系統(tǒng)和單純紫杉醇進(jìn)行腫瘤治療的體外實(shí)驗(yàn),運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等手段,采用細(xì)胞增殖和毒性檢測(cè)、細(xì)胞周期檢測(cè)等方法,檢測(cè)紫杉醇負(fù)載于碳納米管后對(duì)腫瘤化學(xué)治療的敏感性。為臨床化療腫瘤提供新方法。
采用化學(xué)沉淀法制備多壁碳納米管(MWCNTS),用天平稱取250 mg MWCNTs加入到250 mL的濃H2SO4和濃 HNO3混合物(體積比=3:1)中,將樣品置于超聲清洗器中進(jìn)行處理5 h,10000 r/min,20 min,經(jīng)微孔濾膜抽濾,用移液槍取超純水清洗至調(diào)整PH至7.0,置于80℃條件下待其干燥至恒重后,備用。
取一定量的多烯紫杉醇,加入無水乙醇溶解,再加入一定量的 MWCNTs,在探頭超聲下,慢慢加入一定量的ddH2O清洗,10000 r/min,高速離心10 min,獲取MWCNTs-多烯紫杉醇溶液;吸出上清液,加入一定量的表面活性劑,在超聲中處理2 h,10000 r/min,離心 10 min,去除游離的多烯紫杉醇和未分散的MWCNTs,得到載藥MWCNTs-多烯紫杉醇溶液,分裝保存?zhèn)溆谩?/p>
3.1 SCC-15細(xì)胞培養(yǎng)與傳代
將消化液(0.25%胰蛋白酶)從冰箱中取出,加熱使其融化;打開紫外燈照射超凈工作臺(tái)30 min,用75%酒精溶液擦凈;取對(duì)數(shù)生長的SCC-15細(xì)胞,吸出舊培養(yǎng)液,加入3 mLPBS緩沖液,充分震蕩;加入0.25%胰蛋白酶消化液,消化5~10 min;在倒置顯微鏡下仔細(xì)觀察培養(yǎng)瓶,待培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞腫脹或細(xì)胞增大后停止消化;取適量DMEM-F12培養(yǎng)液(含10%小牛血清),輕輕吹洗培養(yǎng)瓶底層貼有細(xì)胞的部分,使細(xì)胞脫落并分散形成細(xì)胞懸液,1000 r/mim,離心5 min;吸出離心管的上清液,加入培養(yǎng)液(含10%小牛血清)2 mL,輕輕吹打使之成為均勻的細(xì)胞懸液,進(jìn)行分裝;寫上細(xì)胞的種類和日期,做好標(biāo)記。稍微擰松培養(yǎng)瓶蓋,置于 37℃,5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)胞生長狀況;
3.2 細(xì)胞毒性檢測(cè)
本實(shí)驗(yàn)將 MWCNTs-多烯紫杉醇溶液和單純紫杉醇溶液按不同濃度分6組。按照CCK-8法,6組的濃度分別2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 μg/mL,作用數(shù)小時(shí)后,計(jì)算其對(duì)SCC-15細(xì)胞生長的抑制率表示其對(duì) SCC-15細(xì)胞的毒性。取對(duì)數(shù)生長期的SCC-15 細(xì)胞按 6×103個(gè)/孔(200 μL)接種于 96 孔培養(yǎng)板中;將培養(yǎng)板放于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后分別將藥物倍比稀釋,形成6個(gè)級(jí)別的濃度。每一濃度的化療藥物設(shè)6個(gè)平行孔,每個(gè)孔加入藥物20 μL,并設(shè)立陰性對(duì)照組(只加培養(yǎng)液,無細(xì)胞和藥物),陽性對(duì)照組(有細(xì)胞和培養(yǎng)液,無藥物),置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h,倒置顯微鏡下觀察;每孔加入CCK-8溶液20 μL;將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h;最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的OD值,記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組的OD值/對(duì)照組的OD值)×100%
設(shè)計(jì)不同濃度的多壁碳納米管-紫杉醇實(shí)驗(yàn)組和單純紫杉醇實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn),作用24 h后,觀察兩種藥物對(duì)SCC-15細(xì)胞生長的抑制率,由此評(píng)價(jià)兩種藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果見圖1,藥物濃度在 4 μg/mL以下時(shí)對(duì) SCC-15細(xì)胞的抑制率較低(<40%),且各濃度組之間無顯著差異(P>0.05),隨著藥物濃度的增高,抑制率的差別逐漸增大。和單純紫杉醇藥物組相比,多壁碳納米管-紫杉醇藥物組的抑制率最高,與單純紫杉醇藥物組差別顯著(P<0.05)。
圖1 不同濃度的多壁碳納米管-紫杉醇和單純紫杉醇對(duì)細(xì)胞生長的抑制作用
3.3 多壁碳納米管-紫杉醇和紫杉醇載藥系統(tǒng)對(duì)SCC-15細(xì)胞生長的抑制
本實(shí)驗(yàn)分為多壁碳納米管-紫杉醇藥物組,紫杉醇藥物組,無藥對(duì)照組,每組設(shè) 6個(gè)復(fù)孔,采用Prestoblue法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長期的SCC-15細(xì)胞按6×103(200 μL/孔)接種于96孔培養(yǎng)板中,放于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后更換DMEN-F12培養(yǎng)液;向兩藥物組加入受試藥物各 200 μL,無藥對(duì)照組加入培養(yǎng)液 200 μL,充分混勻后在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h;加入Prestoblue 5 μL,10min后用酶標(biāo)儀檢測(cè)560 nm處的OD值。
細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組的OD值/無藥對(duì)照組的OD值)×100%
多壁碳納米管-紫杉醇和紫杉醇均能抑制口腔舌癌SCC-15細(xì)胞增殖,與無藥對(duì)照組相比,均有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)果見表 1,多壁碳納米管-紫杉醇對(duì)SCC-15細(xì)胞的增值抑制率比紫杉醇高6%。
表1 多壁碳納米管-紫杉醇和紫杉醇載藥系統(tǒng)對(duì)SCC-15細(xì)胞增殖的抑制率
3.4 P53蛋白檢測(cè)
取以上各組細(xì)胞(無藥對(duì)照組、紫杉醇組、MWCNTs-紫杉醇組)經(jīng) 10000 r/mim,離心后取載玻片進(jìn)行細(xì)胞涂片;向每張涂片加過氧化氫溶液2 mL,室溫下孵育20 min;用PBS洗3次,每次5 min;加非免疫動(dòng)物血清50 μL,室溫下孵育10 mim,再用吸管吸取PBS沖洗1次;加入50 μL的P53抗體(一抗),4℃培養(yǎng)24 h;用吸管吸取PBS沖洗3次,每次5 min;吸取50 μL生物素標(biāo)記的第二抗體,加到涂片上,室溫下孵育10 min;PBS沖洗3次,每次5 min;加入鏈親和素-過氧化物酶溶液,室溫下孵育10 mim;PBS沖洗3次,每次5 min;加入100 μL新鮮配制的的DAB溶液,置顯微鏡下觀察細(xì)胞;用自來水沖洗,蘇木素復(fù)染,中性樹脂封固。
免疫組化法檢測(cè)P53蛋白的表達(dá),由圖2、圖3所示,相對(duì)于無藥對(duì)照組圖4,單純紫杉醇組和多壁碳納米管-紫杉醇組均抑制突變型P53蛋白的表達(dá),多壁碳納米管-紫杉醇組更為明顯。
圖2 培養(yǎng)24h紫杉醇組細(xì)胞突變型p53蛋白的表達(dá)(sp*200)
圖3 培養(yǎng)24 h多壁碳納米管-紫杉醇組細(xì)胞突變型p53蛋白的表達(dá)(sp*200)
圖4 培養(yǎng)24 h無藥對(duì)照組細(xì)胞突變型p53蛋白的表達(dá)(sp*200)
3.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)
對(duì)數(shù)生長的 SCC-15細(xì)胞2×105/孔接種于 24孔培養(yǎng)板中,置培養(yǎng)箱中24 h后,分為三組,對(duì)照組1(空白組)和對(duì)照組2分別加入10 μg/mL的無血清培養(yǎng)液,單純的多烯紫杉醇溶液,實(shí)驗(yàn)組加入MWCNTs-多烯紫杉醇,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h;加入PBS洗3遍;加入5 μg/mL的hoechst33342,避光染色 10 min;加入 15 μg/mL 的 PI,避光染色 10 min;用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光。
結(jié)果判斷:正常細(xì)胞為低藍(lán)光/低紅光,壞死細(xì)胞為低藍(lán)光/高紅光,早期凋亡細(xì)胞為高藍(lán)光/低紅光,晚期凋亡細(xì)胞高藍(lán)光/紅光。
如表2所示,空白組可見細(xì)胞核呈均勻彌散的低藍(lán)色熒光,紅色熒光少見;單純紫杉醇組除可見到低藍(lán)色熒光以外,還可見少量高藍(lán)色和紅色熒光(晚期凋亡細(xì)胞);多壁碳納米管-紫杉醇組可見高藍(lán)色熒光(早期凋亡細(xì)胞)和部分紅色熒光(晚期凋亡細(xì)胞),由此可知紫杉醇組和多壁碳納米管-紫杉醇組與空白組比較,細(xì)胞凋亡數(shù)量多,而紫杉醇組晚期細(xì)胞凋亡數(shù)較少,多壁碳納米管-紫杉醇組晚期細(xì)胞凋亡數(shù)量多,說明多壁碳納米管-紫杉醇組比紫杉醇組具有更高的誘導(dǎo)SCC-15口腔舌癌細(xì)胞凋亡的作用。
表2 hoechst33342、PI雙染法檢測(cè)口腔舌癌細(xì)胞SCC-15細(xì)胞內(nèi)熒光(100×)
紫杉醇是從紅豆杉中提取出來的化合物,在化療口腔舌癌方面療效較好,但是由于其水溶性差,口服生物利用度不高,多以靜脈注射進(jìn)行治療,臨床注射劑應(yīng)用時(shí),其溶毒性較大,嚴(yán)重干擾了藥效,這就限制了紫杉醇靜脈注射化療腫瘤。所以,研制生物相容性好、利用度高及毒性低的多烯紫杉醇成為當(dāng)前人們的關(guān)注的焦點(diǎn)。目前,國內(nèi)外多烯紫杉醇新劑型的探究熱點(diǎn)主要集中在靶向性和水溶性兩個(gè)方面,常用的且研究較為廣泛的有脂質(zhì)體、膠束、納米粒等,這些藥物能準(zhǔn)確地到達(dá)腫瘤病灶,并緩慢的釋放。但是這些藥物也有很大的毒副反應(yīng),如過敏反應(yīng),對(duì)心、腎及神經(jīng)也有一定程度的毒副作用等[3]。且靶向性不強(qiáng),粒徑大小不穩(wěn)定,因此,粒徑大小恒定、水溶性好、藥物釋放緩慢及靶向性好的 MWCNTs-Paclitaxel制劑成為研究當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[4,5]。
有研究者[6]將Paclitaxel吸附到了PLGA(聚合納米粒)上,在對(duì)該聚合納米粒進(jìn)行表面修飾,由此降低細(xì)胞毒性。使多烯紫杉醇在正常組織的蓄積顯著減少,使腫瘤病灶的靶向性大大提高。Mu[7]采用萃取技術(shù)制備的PLGA納米微球,其平均粒徑為納米級(jí),這種納米級(jí)的結(jié)構(gòu)能顯著減少對(duì)正常細(xì)胞的損害。張景勍等[8]通過蒸發(fā)法制備的紫杉醇制劑,在外加磁場(chǎng)的作用下,可以使Paclitaxel準(zhǔn)確的到達(dá)腫瘤病灶,提高了靶向性。本研究用沉淀法制備 MWCNTs,并將其負(fù)載于 Paclitaxel上,形成 MWCNTs-Paclitaxel溶液。進(jìn)行了一系列的體外檢測(cè)試驗(yàn),以達(dá)到提高Paclitaxel的靶向性和細(xì)胞抑制率,降低毒副作用的效果。在細(xì)胞毒性試驗(yàn)中,我們將MWCNTs-Paclitaxel溶液和單純的 Paclitaxel溶液分別分為 6個(gè)濃度組(2.0~64.0 μg/mL),與SCC-15細(xì)胞共育數(shù)小時(shí)后,觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率表示表示對(duì)口腔舌癌SCC-15細(xì)胞的毒性。結(jié)果表明,兩個(gè)藥物組均能抑制細(xì)胞的增殖,當(dāng)藥物濃度在 4 μg/mL以下時(shí),對(duì)SCC-15細(xì)胞的抑制率較低(<40%),各濃度組之間無明顯差異(P>0.05),隨著藥物濃度增加,抑制率差別逐漸增大,和單純的多烯紫杉醇組相比,MWCNTs-Paclitaxel組的抑制率高,與單純Paclitaxel組差別顯著(P<0.05),表明低濃度的MWCNTs-Paclitaxel對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性小,高濃度的MWCNTs-Paclitaxel對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性大,且有劑量依賴性,由此可知,MWCNTs-Paclitaxel有很好的靶向性。在此之前,研究者Joshi M等[9]將甲氨蝶呤與C60富勒烯和MWCNTs進(jìn)行偶聯(lián),用MTT法進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè),研究表明該復(fù)合物在一定濃度下對(duì)腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的毒性。然而,近年來,碳納米管的生物安全性同樣引起了人們的注意。Hu S等[10]將聚乙二醇修飾的MWCNTs注射到BALBA/c小鼠體內(nèi),與單用MWCNTs相比,小鼠的免疫功能基本不受影響。高寧寧等[11]將功能化的MWCNTs進(jìn)行小鼠腹腔注射,觀察其對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的影響,研究發(fā)現(xiàn)修飾后的MWCNTs的生物相容性大大改善。為此,為了提高碳納米管的生物相容性,減少對(duì)正常組織的損害,今后的研究還應(yīng)從多種角度,用不同的方法來研究其毒理作用。
紫杉醇作為重要的化療藥物,特異性作用于細(xì)胞的G2期和M期,從而阻斷細(xì)胞的增殖。MTT法和Prestoblue法是體外檢測(cè)細(xì)胞活性常用的方法,但是因?yàn)镸TT還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物水溶性低,需要溶解后才能檢測(cè),所以選用Prestoblue檢測(cè) MWCNTs-Paclitaxel和單純Paclitaxel對(duì)口腔舌癌SCC-15細(xì)胞生長的抑制率,結(jié)果表明:在與SCC-15細(xì)胞共育72小時(shí)后,MWCNTs -Paclitaxel和單純Paclitaxel均能抑制SCC-15細(xì)胞的增殖,且與無藥對(duì)照組相比,都具有顯著地差異性。其中,MWCNTs-Paclitaxel藥物組對(duì)SCC-15細(xì)胞的增殖抑制率比單純Paclitaxel組高6%。付旭東[12]將NGR-SWCNTs-Paclitaxel納米制劑與MCF-7細(xì)胞共育72小時(shí)后,用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率,并選用了不同的細(xì)胞株進(jìn)行檢測(cè),如SMMC-7721肝癌細(xì)胞、PC-3前列腺癌細(xì)胞、EC9706食管癌細(xì)胞等,結(jié)果表明以碳納米管為載體的制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用與多項(xiàng)研究結(jié)果一致[13,14]。除了細(xì)胞活性的檢測(cè)外,我們進(jìn)行了P53蛋白的表達(dá)和細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。
P53蛋白是一種抑癌基因,當(dāng)受到刺激后可突變?yōu)榘┗?,因此失活的P53基因?qū)δ[瘤的形成非常重要,并對(duì)其發(fā)生和發(fā)展有很大的影響。P53蛋白的突變與很多人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程息息相關(guān)。Bosari等[15,16]采用免疫組化法抑制大腸癌P53蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)了大腸癌預(yù)后差的原因是由于P53基因蛋白過表達(dá)。本研究采用免疫組化法,將MWCNTs-Paclitaxel和單純的多烯紫杉醇與 SCC-15細(xì)胞共育,再在顯微鏡下觀察。由于P53蛋白突變后,其半衰期變短、構(gòu)象改變,所以可以被檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn):兩組藥物均能抑制突變型 P53蛋白的表達(dá),以MWCNTs-Paclitaxel更為明顯。早前,柴瀟瀟[17]研究發(fā)現(xiàn) Paclitaxel可以使癌細(xì)胞凋亡。本研究采用hoechst33342/PI雙染法檢測(cè)了細(xì)胞凋亡,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MWCNTs-Paclitaxel和單純的 Paclitaxel都能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但是MWCNTs-Paclitaxel較單純的Paclitaxel具有更顯著的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。還有研究者[18]認(rèn)為GDF3過表達(dá)可以促進(jìn)Paclitaxel誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。今后,在分子水平上探討Paclitaxel誘導(dǎo)SCC-15細(xì)胞凋亡的機(jī)制將成為我們的研究重點(diǎn)。
紫杉醇載藥的MWCNTs對(duì)SCC-15口腔舌癌細(xì)胞有明顯的細(xì)胞增殖抑制率,能顯著的抑制P53蛋白的表達(dá)以及更顯著地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。所以可以認(rèn)為和單純的紫杉醇相比,碳納米管提高了紫杉醇化療口腔舌癌的敏感性,碳納米管紫杉醇載藥系統(tǒng)治療腫瘤的療效顯著提高,為臨床化療腫瘤提供了新方法。
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NIU Ying, JIANG Lin-shan
(College of Medicine, Dalian University, Dalian 116622, China)
To study on multi-walled carbon nanotubes load after paclitaxel on SCC - 15 oral tongue cancer cell, the influence of load explore multi-walled carbon nanotubes paclitaxel chemotherapy after the sensitization effect of oral tongue cancer. Through the preparation of multi-walled carbon nanotubes and multi-walled carbon nanotubes -polyene taxol drug delivery system, respectively with SCC to 15 oral tongue cancer cells produced, tested by CCK-8 testing activity, Prestoblue detection cell proliferation inhibition rate, immunohistochemical method to detect the expression of P53 protein, hoechst/PI double staining to detect apoptosis, explore carbon nanotubes on taxol oral tongue cancer chemotherapy sensitivity is improved, which provides a new way for clinical tumor chemotherapy.
multi-walled carbon nanotubes; Paclitaxel; multi-walled carbon nanotubes-Paclitaxel; oral squamous cell carcinomaSCC-15 cells
R739.8
A
1008-2395(2017)03-0063-06
2017-05-22
?,摚?974-),女,講師,博士,研究方向:口腔醫(yī)學(xué)。