王景宇，周 玲，姜 超，郭 明

（大連大學 環(huán)境與化學工程學院，遼寧 大連 116622）

蠶絲固定血紅蛋白光譜法測定氧含量

王景宇，周 玲，姜 超，郭 明*

（大連大學 環(huán)境與化學工程學院，遼寧 大連 116622）

將血紅蛋白固定在蠶絲蛋白膜上，制成了一種新型的氧氣傳感器，采用反射光譜檢測此傳感器對氧氣的響應(yīng)。結(jié)果表明在氧含量為10%～50%的范圍內(nèi)，其光譜圖最高反射率與氧含量成線性響應(yīng)?？捎糜跈z測空氣中的氧含量，正常室溫條件下，傳感器膜可以連續(xù)使用半年以上。

蠶絲蛋白；血紅蛋白；氧含量

1 緒論

血紅蛋白(Hemoglobin-Hb)存在于血液的紅細胞中。血紅素是血紅蛋白的主要成分，是原卟啉IX與鐵的配合物[1]。圖1為血紅素分子結(jié)構(gòu)，其生理功能是在體內(nèi)運輸氧。

圖1 亞鐵血紅素分子

蠶絲蛋白是從蠶絲纖維中提取的蛋白，具有無毒性、無刺激性、且具有良好的透氣透濕性和優(yōu)異的生物相容性和生物可降解性[2,3]。在生物技術(shù)領(lǐng)域，絲素膜可作為固定化酶的載體和制備生物傳感器[4]。

有各種檢測空氣中氧氣的方法如氣相色譜法[5]、化學燃燒法[6]等，但這些方法有一定限制，如氣相色譜法需要大型的儀器，而化學燃燒法誤差較大。

本文將蠶絲蛋白制成帶有血紅蛋白的薄膜，利用血紅蛋白攜帶氧氣的特性，對空氣中的氧氣含量進行測定。

2 實驗方法

2.1 儀器與藥品

儀器：超聲波清洗儀（KQ-100，昆山市超聲儀器有限公司）、USB4000微型光纖光譜儀（美國海洋光學）、日立U-3900/3900H型紫外分光光度計（上海百賀儀器科技有限公司）、電熱套（DKT-B型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

藥品：家蠶蠶繭、牛血液Hemoglobin (Solarbio)、27MM透析袋（BIOSHARP）、無水氯化鈣（粒）、無水碳酸鈉、無水乙醇購自天津市科密歐化學試劑有限公司，均為分析純。

2.2 蠶絲蛋白的提取

按照陶俊逸[7]等人提取蠶絲蛋白的方法，對蠶繭層進行兩次脫膠并且鹽解，得到濃度約1%左右的蠶絲蛋白溶液。最后對此溶液進行濃縮、提純，制成7%的蠶絲蛋白水溶液。

2.3 血紅蛋白蠶絲膜的制備

將0.1 g的血紅蛋白加到5 mL蠶絲蛋白溶液中，滴加到聚碳酸酯薄片上，在烘箱中干燥成膜。

3 結(jié)果與討論

3.1 血紅蛋白的紫外光譜圖

采用紫外光譜儀檢測蠶絲蛋白溶液和含有血紅蛋白的蠶絲溶液，結(jié)果如圖2。從圖中可以看出，蠶絲蛋白在波長為275 nm的位置有吸收峰，含血紅蛋白的蠶絲蛋白在波長為275 nm和406 nm處均有特征吸收峰，而406 nm處的峰應(yīng)為血紅蛋白的。這與文獻的中的血紅蛋白的紫外峰是一致的。圖2中右下角小圖為制得的血紅蛋白蠶絲膜。

圖2 蠶絲蛋白與蠶絲蛋白固定血紅蛋白的紫外光譜圖

3.2 氧氣傳感器的性能考察

將制備的血紅蛋白蠶絲膜通入不同氧含量的氣體，然后測量其反射光譜。實驗結(jié)果見圖3，可見最大反射波在均在483 nm附近。本實驗采用的是氧氣和氮氣的混合物，隨氧含量的升高，反射光譜峰高升高，在氧含量為 10%、20%、30%、40%、50%下，其反射峰高分別為 35.7%、44.0%、52.1%和69.1%。血紅蛋白蠶絲膜能夠?qū)Σ煌鹾康臍怏w具有響應(yīng)可能是由于血紅蛋白可以結(jié)合氧氣的原因。主要原因是亞鐵血紅素分子與氧氣的結(jié)合引起 Fe（Ⅱ）的微小移動，其接受了O2的一對電子，F(xiàn)e（Ⅱ）為八面體配位，而且其價電子總數(shù)為 18，所以氧合血紅素亞鐵是比較穩(wěn)定的構(gòu)型。氧含量升高使血紅蛋白膜結(jié)合的氧氣增多，使血紅蛋白變成 R態(tài)，即松弛態(tài)，也更穩(wěn)定，從而引起反射的峰高升高[8]。

前面的實驗是測定血紅蛋白的吸收峰（Absorption），但傳感器膜中的其它物質(zhì)會影響實驗的測定結(jié)果。而本實驗測定的是反射峰（reflanctance），這樣可以去除掉膜本身對光譜的影響，干擾更少。

圖3 傳感器在不同氧含量下的反射光譜

3.3 標準曲線

將氧含量和最高反射率作圖，得到對應(yīng)的方程為y = 0.82907 x +27.3115，相關(guān)系數(shù)R2為0.99956。其標準曲線如圖4。因此該血紅蛋白蠶絲膜可以作為傳感器測定不同氣體的氧含量。

圖4 傳感器測定氧的標準曲線

3.4 樣品測定

將空氣通入氧氣傳感器中，測定反射率，實驗結(jié)果見圖5，其反射峰高在波長483 nm下，最大反射率為45.5%。根據(jù)標準曲線計算得到空氣中氧氣含量為21.95%，與實際含量數(shù)值相接近。

3.5 膜壽命測定

將制備好的血紅蛋白蠶絲蛋白膜放入自封袋，保存6個月仍可對氧含量進行檢測，且性能良好。這說明此血紅蛋白蠶絲膜不但檢測方便，利于保存，而且使用壽命較長，攜帶方便。

圖5 置于空氣中的光譜圖

4 結(jié)論

本實驗選用絲素蛋白固定血紅蛋白制作氧傳感器，對空氣中氧含量進行測定，方法簡便、測定準確，而且所用材料皆為生物材料，綠色環(huán)保，其應(yīng)用價值較大，前景較好。

[1] Alayash A I. Oxygen therapeutics: can we tame haemoglobin[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2004, 3(2): 152-159.

[2] WANG S, ZHANG Y, YIN G, et al. Electrospun polylactide silk fibroin-gelatin composite tubular scaffolds for small diameter tissue engineering blood vessels[J]. Journal of Applied Polymer Science, 2009, 113(4): 2675-2682.

[3] WANG S D, ZHANG Y Z, YIN G B, et al. Fabrication of a composite vascular scaffold using electro spinning technology [J]. Materials Science and Engineering: C, 2010,30(5): 670-676.

[4] 李志林, 吳瑞紅. 蠶絲蛋白開發(fā)利用的研究進展[J]. 廣東化工, 2006, 33(2): 16-19.

[5] 陶俊逸, 邵駿驊, 張海萍, 等. 蠶絲蛋白制備方法的研究[J]. 蠶桑通報, 2012, 43(3): 18-21.

[6] 賈海琪, 何俊友. 測定空氣里氧氣含量改進探析[J]. 中國教育技術(shù)裝備, 2008(2): 45-45.

[7] 吳振偉. 氣相色譜法測定氧氣的含量[J]. 大氮肥, 2008(3):198-200.

[8] 陳耀強, 王婧, 萬家義, 等. 血紅蛋白的分子結(jié)構(gòu)及與其載氧功能相關(guān)的藥物研究進展[J]. 綿陽師范學院學報,2004, 23(5): 1-4.

Spectrometry Determination of Oxygen Content by Silk Fibroin Fixed Hemoglobin

WANG Jing-yu, ZHOU Ling, JIANG Chao, GUO Ming*
(College of Environment and Chemical Engineering, Dalian University, Dalian 116622, China)

A new kind of oxygen sensor was fabricated by hemoglobin fixed with silk fibroin. This sensor was used to determine the oxygen in air with reflectance spectrometry. Experimental results showed that along with the increase of content of oxygen at 10%～50%, the maximum of reflect peak was increase too in the linear relation. This sensor could be used to determine the content of oxygen in air. In the normal condition, the sensor membrane could be continuously used for half a year.

silk fibroin; hemoglobin; oxygen content

TQ460

A

1008-2395(2017)03-0036-03

2016-12-28

王景宇（1991-），女，碩士研究生，研究方向：一維光子晶體傳感器的制備及其性能。

郭明（1965-），男，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：光子晶體。