王玉，徐維禎，穆宇松，王天楹，閆碧瑩，顏學勤，趙文然，鐘照華

1. 哈爾濱醫(yī)科大學微生物學教研室及伍連德研究所，哈爾濱 150081； 2. 哈爾濱醫(yī)科大學細胞生物學教研室，哈爾濱 150081

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·論著·

柯薩奇病毒B3型3D蛋白抗體的制備

王玉1，徐維禎1，穆宇松1，王天楹1，閆碧瑩1，顏學勤1，趙文然2，鐘照華1

1. 哈爾濱醫(yī)科大學微生物學教研室及伍連德研究所，哈爾濱 150081； 2. 哈爾濱醫(yī)科大學細胞生物學教研室，哈爾濱 150081

腸道病毒3D蛋白是其RNA聚合酶?？滤_奇病毒B3型(coxsackievirus B3，CVB3)主要感染心臟，其3D蛋白在心肌表達中的時序和分布尚不清楚。本研究將通過聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)獲得的CVB 3D片段插入pET28a(+)的表達框，獲得pET28a(+)-3D重組質(zhì)粒。異丙基 β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)誘導pET28a(+)-3D表達3D-His蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)后，切膠，獲得3D-His蛋白。3D-His蛋白加佐劑免疫新西蘭大白兔制備3D蛋白多克隆抗體，蛋白免疫印跡法檢測抗體效價及特異性。結(jié)果顯示，本研究獲得了高效價且特異性好的抗CVB3 3D蛋白抗體，可用于CVB3 3D蛋白功能的后續(xù)研究。

柯薩奇病毒B3型；3D聚合酶；抗體；原核表達

柯薩奇病毒B組(coxsackievirus B，CVB)屬小RNA病毒科腸病毒屬，目前已鑒定出6種血清型(CVB1～CVB6)。CVB是人類病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)的主要病原[1-2]。我國長春地區(qū)對近10年來疑似病毒性心肌炎患者的研究[3]顯示，成人患者CVB感染陽性率為63.4%，血清型以B3、B4、B5為主；兒童患者CVB感染陽性率為65.8%，血清型以B3、B4為主。在約50%擴張型心肌病患者中發(fā)現(xiàn)CVB反應性抗體，而在多達70%的患者中檢測到該病毒的基因組成分[4-5]。

CVB顆粒是無包膜20面體結(jié)構(gòu)，直徑約30 nm[6]。病毒基因組是一條單股正鏈RNA(+ssRNA)，全長7 396個核苷酸(nucleotide，nt)，其5′非編碼區(qū)(non-coding region，NCR)較長且高度結(jié)構(gòu)化，只有一個較大的開放讀碼框(open reading frame，ORF)和一較短的3′非編碼區(qū)，最后以poly(A)尾終止。ORF在宿主細胞胞質(zhì)中翻譯成多聚蛋白后，病毒蛋白酶對其進行加工產(chǎn)生11種蛋白，包括4個衣殼蛋白(VP1～VP4)和7個功能蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)[7]。

小RNA病毒基因組編碼的多聚蛋白被切割后產(chǎn)生11種蛋白，最后一個是RNA依賴性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)，被稱為3D。3D的結(jié)構(gòu)在過去幾十年被廣泛研究，包括脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus, PV)、CVB3、腸病毒71型(enterovirus 71，EV71)和人鼻病毒(human rhinovirus，HRV)[8-13]。3D晶體構(gòu)象如一杯狀右手，包括手掌結(jié)構(gòu)域、拇指結(jié)構(gòu)域和手指結(jié)構(gòu)域[14]。手指和拇指結(jié)構(gòu)域穿過蛋白質(zhì)N端部分相互連接，形成一個完全環(huán)繞GDD活性位點的構(gòu)象[15-16]。3D蛋白主要負責病毒基因組RNA的轉(zhuǎn)錄，合成子代病毒基因組，在CVB感染和復制中發(fā)揮關鍵作用[17-19]。CVB感染有組織親嗜性和時序變化，目前對其3D蛋白在心肌組織中表達的時序與分布了解甚少，因此獲得3D抗體有助于從病毒基因組轉(zhuǎn)錄的視角理解CVB致病過程，為抗CVB藥物的研發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

攜帶嗜心肌CVB3 Woodruff株全長cDNA序列的質(zhì)粒pMKS1由Lindsay Whitton教授(美國加利福尼亞Scripps Research Institute)惠贈。pET28a(+)載體、大腸埃希菌BL21菌種由本實驗室保存。限制性內(nèi)切酶HindⅢ-HF、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、T4 DNA連接酶購自紐英倫生物技術(shù)有限公司，質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自康寧生命科學有限公司，DL15000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、Premix Ex Taq Hot Start Version、6×Loading Buffer購自TaKaRa公司，異丙基 β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)購自Sigma公司，聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)快速制備試劑盒購自EpiZyme公司，PageRuler預染蛋白Marker購自Thermo Fisher公司，考馬斯亮藍快速染液、5×十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)-PAGE蛋白上樣緩沖液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，His鼠多克隆抗體購自北京傲銳東源生物科技有限公司，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記兔抗小鼠IgG、HRP標記山羊抗兔IgG購自萬類生物科技有限公司，抗VP1抗體購自美國Dako公司，GAPDH兔多克隆抗體購自美國Proteintech公司，超敏增強化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)即用型底物購自武漢博士德生物工程有限公司，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)合成引物購自蘇州金維智生物科技有限公司。6～8周齡新西蘭大白兔體重(2.5±0.5)kg，購自哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院動物實驗中心。

1.2 方法

1.2.1 pET28a(+)-3D原核表達載體的構(gòu)建 利用Primer 5.0軟件設計帶有HindⅢ酶切位點的上游引物5′-GTGAAGCTTTAGGAGAGATCG-AGTTTATTGAGAG-3′，帶有XhoⅠ酶切位點的下游引物5′-ATATCTCGAGGAAAGAGTCCAA-CCACTTC-3′。以pMKS1質(zhì)粒為模板，PCR擴增3D片段，對目的片段與pET28a(+)載體雙酶切后，4 ℃連接過夜。次日，將連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌 BL21感受態(tài)細胞，于電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司)中37 ℃過夜培養(yǎng)，挑選單克隆菌株37 ℃過夜培養(yǎng)，然后凍存菌種并酶切鑒定，同時送博仕生物技術(shù)有限公司測序鑒定。

1.2.2 3D-His蛋白的誘導表達、鑒定及表達條件優(yōu)化 IPTG誘導3D-His蛋白表達，離心后分別取上清液和沉淀，加入蛋白上樣緩沖液煮沸10 min，通過SDS-PAGE分析蛋白表達可溶性。獲得的蛋白經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別用1∶2 000稀釋的抗His鼠多克隆抗體作為一抗孵育2 h和1∶3 000稀釋的HRP標記兔抗小鼠IgG作為二抗孵育1 h，用含吐溫20的Tris-HCl緩沖鹽溶液(Tris buffered saline with Tween 20，TBST)洗膜3次后曝光，蛋白免疫印跡法分析蛋白特異性。分別對誘導濃度(分別設0.05、0.2、0.4、0.6 mmol/L)、溫度(分別設25、30、37 ℃)、時間(分別誘導2、4、6 h)進行優(yōu)化，觀察蛋白表達可溶性及表達量變化。

1.2.3 兔多克隆抗血清的制備及檢測 每只新西蘭大白兔每次注射抗原800 μg，將等體積的3D-His蛋白與佐劑乳化完全，采用脊椎兩側(cè)皮下多點免疫注射法進行免疫。首次免疫后，間隔2周進行第2次免疫；再間隔2周進行第3次免疫；第4次和第5次免疫分別間隔1周。免疫3次后，每次繼續(xù)免疫前抽取血液，分離血清并檢測效價。最后一次免疫1周后心臟采血，分離血清，分裝，保存于-80 ℃冰箱備用。分別用TBST 1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000稀釋的多克隆抗血清行蛋白免疫印跡法檢測3D-His蛋白，從而確定多克隆抗血清效價。通過蛋白免疫印跡法檢測其是否能識別原核表達的3D-His蛋白、CVB3感染細胞中的3D蛋白及其特異性。

2 結(jié)果

2.1 3D-His蛋白的表達

以pMKS1質(zhì)粒為模板，PCR擴增出含有HindⅢ和XhoⅠ酶切位點的3D片段，將目的片段與載體分別雙酶切后進行連接并轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21感受態(tài)細胞中， 獲得原核表達質(zhì)粒pET28a(+)-3D。經(jīng)HindⅢ-HF和XhoⅠ雙酶切后，電泳出現(xiàn)5 369 bp和1 400 bp兩條帶，與pET28a(+)載體和3D-His基因片段大小一致。測序結(jié)果也與目的序列完全相同，表明載體構(gòu)建成功(圖1)。在37 ℃、1 mmol/L IPTG、誘導2 h條件下，分別對超聲后的上清液及沉淀進行SDS-PAGE，結(jié)果發(fā)現(xiàn)58 000左右處存在高表達的蛋白條帶，該位置與3D-His蛋白的理論位置相同，可見3D-His蛋白主要以包涵體形式表達(圖2A)。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，在58 000左右處可見目的蛋白條帶(圖2B)。

2.2 3D-His蛋白表達條件的優(yōu)化

在37 ℃條件下，經(jīng)不同濃度IPTG誘導后，取菌體超聲后的沉淀及上清液進行SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)誘導濃度對蛋白表達影響不大。IPTG終濃度為0.05 mmol/L就足以促使目的蛋白高效表達且以包涵體形式為主(圖3A、3B)。在37 ℃條件下，以0.05 mmol/L IPTG對目的蛋白進行不同時間誘導后，取菌體超聲后的沉淀及上清液進行SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)誘導時間對蛋白表達量有明顯影響。誘導時間與表達量成正比，蛋白在誘導6 h表達量較高且以包涵體形式為主(圖3C、3D)。在不同溫度下，以0.05 mmol/L IPTG對目的蛋白誘導6 h后，取菌體超聲后的沉淀及上清液進行SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)隨溫度的升高表達量升高，37 ℃時表達量較高且以包涵體形式為主(圖3E、3F)。

2.3 3D抗體的效價

新西蘭大白兔第4次免疫1周后，心臟取血5 mL。以免疫前血清為陰性對照，用3D-His蛋白免疫印跡法測定抗血清效價，最高可達1∶4 000(圖4)。

2.4 3D抗體的特異性

利用多克隆抗血清蛋白免疫印跡法檢測大腸埃希菌中表達的3D-His蛋白(圖5A)，以大腸埃希菌表達的空載體pET28a(+)為陰性對照，表明制備的抗血清能特異性識別3D-His蛋白。利用多克隆抗血清蛋白免疫印跡法檢測CVB3感染HeLa細胞16 h后總蛋白中的3D蛋白，以制備的抗血清為一抗，以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)假感染的HeLa細胞總蛋白為陰性對照。結(jié)果顯示，制備的抗血清能特異性識別CVB3 3D蛋白(58 000)。在CVB生物合成過程中，首先翻譯出大前體蛋白(polyprotein)，然后在2A蛋白酶的作用下降解為P1、P2、P3共3個前體蛋白，P3在3C蛋白酶作用下進一步降解為3A、3B、3CD、3C、3D。有趣的是，本研究制備的抗體在3D上方還出現(xiàn)3個條帶，從相對分子質(zhì)量推測，由上至下依次可能為P2+P3蛋白(146 000)、P3蛋白(83 000)、3CD蛋白(70 000)(圖5B)。

圖1 重組質(zhì)粒pET28a (+)-3D的BLAST比對結(jié)果

Fig.1 BLAST comparison of recombinant plasmid pET28a (+)-3D

A: Expression of 3D-His inE.coliBL21/pET28a(+)-3D after induction was analyzed by SDS-PAGE. Protein ladder: PageRuler Prestained Protein Ladder. Not induced: Not induced pET28a(+)-3D. B: Expression of 3D-His inE.coliBL21/pET28a(+)-3D after induction was subjected to Western blotting analysis with a monoclonal antibody to His tag.

圖2 3D-His融合蛋白的誘導表達及鑒定

Fig.2 Induced expression and identification of 3D-His protein

Protein ladder: PageRuler Prestained Protein Ladder. Not induced: Not induced pET28a(+)-3D.

圖3 3D-His融合蛋白表達條件的優(yōu)化

Fig.3 Optimization of expression conditions for 3D-His protein

NC: Preimmune serum.

圖4 蛋白免疫印跡法檢測3D抗血清效價

Fig.4 The titers of anti-3D antibody determined by Western blotting

A: Western blotting analysis for 3D-His protein inE.coliBL21/pET28a(+)-3D. Total protein was extracted after induction with IPTG. B: Western blotting analysis for 3D protein in HeLa cells infected with CVB3. NC: protein in HeLa cells infected with PBS.

圖5 蛋白免疫印跡法檢測抗CVB3 3D抗體的特異性

Fig.5 Specificity of anti-3D antibody determined by Western blotting

3 討論

多克隆抗體是一種有效的蛋白檢測工具，目前市場上只有針對EV71的3D蛋白抗體，沒有針對CVB3的3D蛋白抗體。因此，為便于后期對CVB3 3D蛋白的研究，本研究利用構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a(+)-3D轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21，成功誘導3D-His蛋白表達，并以此作為免疫注射抗原，制備多克隆抗體。

本研究中，原核表達的3D-His蛋白以包涵體形式存在。表達時間短、缺乏某些蛋白折疊輔助因子、無法形成正確的次級鍵等原因均可導致包涵體的形成；而延長時間、降低溫度、降低IPTG濃度可增加蛋白的可溶性表達。因此，本研究分別對IPTG誘導濃度、誘導時間、誘導溫度等條件進行摸索，發(fā)現(xiàn)IPTG誘導濃度對蛋白表達影響不大，終濃度為0.05 mmol/L時蛋白即有較高表達；誘導時間對3D蛋白的表達有明顯影響，隨著時間的延長蛋白表達量增多；誘導溫度對3D蛋白也有一定影響，隨著溫度的升高蛋白表達量增多。但無論條件如何變化，3D蛋白均以包涵體的形式存在。該方法的缺點是不易分離和純化，且摸索變性、復性的最適條件較繁瑣；優(yōu)點是可使細胞內(nèi)表達的外源蛋白不易被細菌蛋白酶降解，且包涵體含重組蛋白量大，可經(jīng)SDS-PAGE分離目的蛋白，切下目的蛋白加佐劑，可直接用于免疫注射。本研究利用新西蘭大白兔免疫4次后的多克隆抗血清行蛋白免疫印跡法來檢測3D-His蛋白，發(fā)現(xiàn)所制備的多克隆抗血清效價可達1∶4 000，且特異性好。為避免假陽性，用該多克隆抗體對CVB3感染HeLa細胞16 h后提取的總蛋白進行檢測，發(fā)現(xiàn)可檢測到3D蛋白，且特異性好。因此，本研究所制備的CVB3 3D抗體可用于3D蛋白的相關研究。

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. ZHONG Zhaohua, E-mail: zhongzh@hrbmu.edu.cn

Preparation of coxsackievirus B3 3D protein polyclonal antibody

WANG Yu1, XU Weizhen1, MU Yusong1, WANG Tianying1, YAN Biying1, YAN Xueqin1, ZHAO Wenran2, ZHONG Zhaohua1

1. Department of Microbiology and Wu Lien-Teh Institute, Harbin Medical University, Harbin 150081, China; 2. Department of Cytobiology, Harbin Medical University, Harbin 150081, China

Coxsackievirus B3 (CVB3) mainly infects the heart, and the timing and distribution of viral RNA polymerase (3D protein) expression in the myocardium are currently unclear. In this study, the CVB3 3D gene was obtained by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into the prokaryotic expression vector pET28a(+). The expression of 3D was induced by isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), and the 3D-His protein was purified and used to immunize New Zealand white rabbits for antiserum against the 3D protein. An anti-CVB3 3D antibody with high titer and specificity was obtained, and it can be used for future functional study of CVB3 3D protein.

Coxsackievirus B3; 3D polymerase; Antibody; Prokaryotic expression

國家自然科學基金(81571999、81672007、31300144)

鐘照華

2017-03-13)