叢 玲，于惠琳，張麗霞，王春語

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新中心，遼寧沈陽 110161）

甜高粱莖稈總RNA提取方法的比較

叢 玲，于惠琳，張麗霞，王春語

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新中心，遼寧沈陽 110161）

甜高粱是最具潛力的能源作物之一，新鮮的甜高粱莖稈中含有大量汁液且富含多糖和多酚成分，很難獲得高質(zhì)量的總RNA。以甜高粱Rio的莖稈為實(shí)驗(yàn)材料，利用Trizol法、SDS法、改良CTAB法和RNAiso法分別提取新鮮莖稈總RNA，比較幾種方法獲取的總RNA質(zhì)量與純度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，RNAiso改良法提取的莖稈總RNA質(zhì)量高，完整性好，總RNA產(chǎn)物可直接用于建庫和轉(zhuǎn)錄組測序等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

甜高粱；莖稈；總RNA；RNAiso法

甜高粱是最有發(fā)展?jié)摿Φ哪茉醋魑镏?，其莖稈汁液豐富，含糖量高（莖稈汁液和含糖量分別達(dá)到60%和15%以上），經(jīng)過簡單發(fā)酵就可以生產(chǎn)乙醇，而且榨汁后殘?jiān)€可作為纖維素乙醇的原料，是重要的能源作物，可用于生產(chǎn)糖漿、糧食、乙醇、飼料以及造紙等［1］。加強(qiáng)甜高粱種質(zhì)資源的創(chuàng)新，選育生物產(chǎn)量高和莖稈含糖量高的能源用甜高粱品種是急需解決的問題［2］。但是，目前甜高粱莖稈含糖量的遺傳和分子調(diào)控還不清楚，提取完整性好、純度高的高質(zhì)量莖稈總RNA是開展甜高粱糖積累相關(guān)基因挖掘和分子調(diào)控機(jī)理研究的前提。目前，提取RNA的常規(guī)方法有異硫氰酸胍法、SDS法、苯酚法、Trizol法等。

本實(shí)驗(yàn)中主要對SDS法、CTAB改良法、Trizol法和RNAiso法這4種提取方法進(jìn)行比較，以期提取到滿足RNA高通量測序質(zhì)量要求的完整性好、高純度的甜高粱莖稈總RNA。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

采用甜高粱Rio品種為實(shí)驗(yàn)材料，2016年春季在沈陽大田種植，抽穗期后剪取高粱莖稈。因甜高粱莖稈中含有大量的汁液，出汁率一般在50%～60%，在液氮冷凍情況下，整段的高粱莖稈是很難被粉碎的。預(yù)實(shí)驗(yàn)中參考王愛勤等的方法，常溫下將高粱莖稈榨汁粉碎形成勻漿后提取總RNA，結(jié)果提取的RNA均出現(xiàn)嚴(yán)重降解［3］。后經(jīng)改良，在田間取樣時(shí)先將莖稈剪成薄片（厚度0．5～1．0 cm），迅速液氮冷凍帶回實(shí)驗(yàn)室，－80℃保存?zhèn)溆谩Ｌ崛】俁NA前，在液氮冷凍條件下，利用小型研磨機(jī)（德國IKA A11）將莖稈薄片快速粉碎成粉末，然后再進(jìn)行后續(xù)提取操作。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑

SDS裂解液100 mmol／L LiCl，100 mmol／L Tris，50 mmol／L EDTA，2%SDS，使用前加16% PVP和1%β－巰基乙醇。CTAB提取液100 mmol／L Tris-HCl（pH 8．0），50 mmol／L EDTA，2 mol／L NaCl，2%CTAB，使用前加1%DTT。Trizol reagent試劑購自Invitrogen公司。RNAiso Plus試劑購自大連寶生物（TaKaRa）公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SDS法

按照魏鑫等的方法，取液氮研磨好的莖稈粉末1 g，加入10 ml SDS裂解液進(jìn)行總RNA提取，最終獲得的總RNA提取樣品用適量DEPC水溶解，－80℃保存?zhèn)溆茫?］。

1.2.2 CTAB改良法

在尹慧等的提取方法基礎(chǔ)上，略有修改，加入LiCl沉淀步驟［5］。取液氮研磨好的材料1 g于離心管中，加入10 ml提取液進(jìn)行總RNA提取。在第一次等體積氯仿抽提后，取上清加入1／3體積的LiCl（12M），－20℃放置6～8 h。4℃12 000 g離心30 min，倒掉上清液，沉淀用約2／5管容積的無菌DEPC水溶解。然后再重復(fù)等體積氯仿抽提、無水乙醇沉淀等常規(guī)操作，最后適量DEPC水溶解RNA沉淀，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 Trizol法

在Trizol reagent產(chǎn)品提供的操作流程基礎(chǔ)上，略有修改，加入微量乙醇沉淀步驟。在常規(guī)提取步驟的氯仿抽提后，在上層清液中小心加入1／6體積的無水乙醇，冰上靜置20 min，然后離心15 min取上清。然后按原操作流程繼續(xù)異丙醇沉淀等操作，最后加適量DEPC水溶解總RNA提取物－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 RNAiso法

根據(jù)寶生物公司RNA提取試劑（RNAiso Plus）的操作流程進(jìn)行提取。為去除材料中的多糖成分，加入寶生物公司的植物總RNA提取輔助試劑（Fruit-mateTMfor RNA purification）。每0．1 g液氮研磨的材料加1 ml輔助試劑，混合均勻后離心除去不溶物。向上清液中加入等體積的RNAiso Plus，混勻室溫靜置5 min，再加入氯仿（RNAiso Reagent的1／5體積量）并混合均勻，室溫靜置5 min，12 000 g 4℃離心15 min。離心后溶液分為三層，取最上層液轉(zhuǎn)移至另一新離心管中，加入等體積的異丙醇，充分混勻后在室溫靜置10 min。12 000 g 4℃離心10 min。棄上清，75%乙醇洗滌后室溫干燥，加適量DEPC水溶解，－80℃保存。

1.2.5 RNA質(zhì)量檢測

取1 μl總RNA提取產(chǎn)物，以DEPC水為空白對照，在超微量分光光度計(jì)（Thermo Scientific NanoDrop 2000c）上測定RNA在260、280、230 nm下的吸光率，通過換算得出RNA濃度值，并計(jì)算A260／A280和A260／230確定RNA的純度。取1 μl總RNA提取產(chǎn)物，利用1．2%非變性瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓為150 V，電泳30 min。在凝膠成像儀上觀察RNA電泳條帶，初步分析RNA提取物的清晰度和完整性。因莖稈總RNA提取產(chǎn)物將用于轉(zhuǎn)錄組測序等后續(xù)的分析研究，對總RNA的完整性要求更高，本實(shí)驗(yàn)利用生物分析儀（Agilent 2100 Bioanalyzer）檢測總RNA提取物的濃度和RIN值，精確評價(jià)RNA的完整性［6，7］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法莖稈總RNA的完整性比較

各種方法提取的RNA樣品的電泳結(jié)果見圖1。圖1-A是SDS法提取總RNA電泳圖，可見28 s部分降解，5 s條帶亮度高于28 s和18 s，且有少量DNA污染，28 s條帶上方出現(xiàn)大量彌散拖尾現(xiàn)象，說明多糖、蛋白質(zhì)污染嚴(yán)重。圖1-B是CTAB改良法的電泳結(jié)果，可見28s、18s rRNA條帶明顯降解，5s條帶亮度遠(yuǎn)高于28s和18s條帶，雖然沒有蛋白質(zhì)、DNA等污染，總RNA完整性已完全破壞。用Trizol法提取的總RNA，電泳（圖1-C）顯示28s條帶稍有降解，無蛋白等污染。圖1-D是RNAiso法提取總RNA的電泳圖，可見28 s、18 s rRNA條帶分離明顯清晰，28 s、18 s條帶亮度比5 s大，表明其完整性良好；點(diǎn)樣孔中無DNA殘留痕跡，28 s條帶上方無彌散拖尾現(xiàn)象，說明沒有多糖、蛋白等雜質(zhì)的污染。

因SDS法和CTAB改良法提取的總RNA已經(jīng)大量降解，不適合后續(xù)實(shí)驗(yàn)，所以本實(shí)驗(yàn)將Trizol法和RNAiso法提取的RNA利用生物分析儀（Agilent 2100 Bioanalyzer）進(jìn)行檢測，進(jìn)一步測定總RNA提取物的濃度、純度和RIN值，精確RNA的完整性。圖2顯示的是兩種方法的總RNA樣品毛細(xì)管電泳報(bào)告。從圖中可以看出，2-A（RNAiso法）的RNA樣品28 s峰和18 s峰清晰可見，無雜峰；2-B（Trizol法）中18 s峰后面存在些許雜峰，這與瓊脂糖電泳的結(jié)果基本一致。

圖1 不同提取方法獲得的總RNA瓊脂糖電泳結(jié)果A，SDS提取法；B，CTAB改良法；C，Trizol法；D，RNAiso法。

圖2 總RNA產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳結(jié)果（Agilent 2100 Bioanalyzer）A，RNAiso法總RNA提取物；B，Trizol法總RNA提取物。

2.2 不同提取方法莖稈總RNA的純度比較

將4種不同方法提取的總RNA進(jìn)行紫外分光光度計(jì)純度分析，分別測量在230、260、280 nm下的吸光度值，高純度RNA的A260nm／A280nm的比值應(yīng)介于1．8～2．0，A260nm／A230nm應(yīng)大于1．7。RIN值是指RNA integrity number，即RNA分子完整數(shù)，是Agilent 2100生物分析儀系統(tǒng)中針對真核生物總RNA Nano分析法采集樣品開發(fā)的一種統(tǒng)計(jì)方法［7］。RIN值的數(shù)值從0～10，數(shù)值越大表明RNA質(zhì)量越好、越完整，直接反映了RNA質(zhì)量的高低，只有RIN值＞8的RNA樣品，能夠滿足文庫建庫、轉(zhuǎn)錄組測序等研究要求。表1中列出了上述4種方法提取RNA樣品的濃度、吸光度比值等多個(gè)純度指標(biāo)。從表1看出，用改良CTAB法、SDS法、Trizol法以及RNAiso法提取的總RNA的A260nm／A280nm的比值都大于1．8，但改良CTAB法和SDS法提取的總RNA的D260nm／D280nm比值大于2．0，說明含有高鹽和酚等雜質(zhì)的污染。Trizol法和RNAiso法提取的RNA樣品的濃度和純度都比較好，但Trizol法提取的總RNA濃度明顯低于RNAiso法，而且完整性差，RIN值低于8，不能滿足轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒?yàn)的要求。

表1 不同方法提取甜高粱莖稈總RNA的結(jié)果比較Table 1 Comparison of total RNA from the stem of sweet sorghum by different methods

3 結(jié)論與討論

3.1 多糖去除對提取結(jié)果的影響

多糖污染是甜高粱莖稈總RNA提取中遇到的棘手難題。多糖的許多理化性質(zhì)與RNA相似，在提取中與RNA以復(fù)合體形式存在，很難將它們分開。在去除多糖的同時(shí)RNA也會(huì)被除去，造成RNA提取效率的大幅度降低和降解。目前去除植物多糖的方法主要有3種：一是用高濃度的Na＋、K＋改變多糖的溶解特性，使其脫離水相進(jìn)入有機(jī)相，然后用酚氯仿抽提去除［8］；二是在沉淀RNA之前采用乙二醇丁醚、乙醚或丁氧乙醇等把多糖去掉［9］；三是選擇性沉淀多糖或RNA。LiCl可以選擇性地沉淀RNA，去除大部分多糖，但實(shí)驗(yàn)周期較長，沉淀RNA一般都需要至少2 h以上的冰浴。在本實(shí)驗(yàn)中SDS和CTAB方法中都加入LiCl沉降的步驟，但仍然是難以去除多糖污。這可能與甜高粱莖稈組織中含糖量過高有關(guān)。另有文獻(xiàn)報(bào)道，低濃度的乙醇（10%～30%）可以沉淀多糖，而RNA則要在75%乙醇中才能沉淀下來，所以可以利用RNA與多糖在不同濃度乙醇中沉淀性不同來分離這2種物質(zhì)［10］。本文中，在常規(guī)Trizol試劑提取過程中加入一步低濃度無水乙醇去除多糖的步驟，但效果不理想，雖然有效去掉了多糖污染，但造成了RNA提取物的部分降解。而RNAiso方法中，TaKaRa植物RNA提取輔助試劑Fruit-mateTMfor RNA purification的加入，則既有效去除了植物多糖污染，又保證了RNA樣品的完整性，因此可以獲得質(zhì)量較高的總RNA。

3.2 不同提取方法的分析比較

根據(jù)結(jié)果可知，4種提取方法中，RNAiso法提取的甜高粱莖稈總RNA完整性好、純度高、濃度高，適合于RNA測序等下游后續(xù)實(shí)驗(yàn)的使用。SDS法和CTAB法提取的總RNA存在降解，并含有雜質(zhì)，效果不夠理想，不適用于RNA測序的實(shí)驗(yàn)要求。Trizol法提取的莖稈總RNA雖然在電泳和紫外分光光度測定的檢測中，質(zhì)量基本達(dá)標(biāo)，但經(jīng)Agilent 2100生物分析儀系統(tǒng)的檢測中，RIN值偏低，完整性不如RNAiso法，可以進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄PCR等簡單分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，但無法滿足RNA測序的高純度要求。

綜上所述，針對RNA高通量測序的實(shí)驗(yàn)要求，甜高粱莖稈總RNA的提取應(yīng)采用RNAiso法進(jìn)行。

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Comparison and Analysis of the Methods of RNA Isolation From Sweet Sorghum Stems

CONG Ling，YU Hui-lin，ZHANG Li-xia，WANG Chun-yu
（Innovation Center，Liaoning Academy of Agricultural Sciences，Shenyang，Liaoning 110161）

Sweet sorghum is a kind of promising energy crops．There are large amounts of juice andrich in polysaccharides and polyphenols in fresh stem of sweet sorghum，so it is very difficult to obtain high quality total RNA by common RNA extraction methods from the fresh stem．In this study，the total RNA of Rio stem was extracted by Trizol method，SDS method，modified CTAB method and RNAiso method respectively．The results showed that the total RNA extracted usingRNAiso method is of high quality and good integrity，and can be used directly for subsequent experiments such as database construction and transcriptome sequencing．

Sweet sorghum；Stem；Total RNA；RNAiso method

Q813．4；S514

B

1002－1728（2017）03－0024－04

10．3969／j．issn．1002－1728．2017．03．005

2017－04－18

國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（31501241）；遼寧省自然基金項(xiàng)目（2015020788）

叢玲（1980－），女，博士，助理研究員，主要從事高粱分子育種研究。E-mail：ling_1860＠163．com