曾小宇，苗銀萍，趙冰琳，魏卓，趙林萍

(1. 鄭州中道生物技術(shù)有限公司, 鄭州 450000; 2. 河南中標(biāo)檢測(cè)服務(wù)有限公司, 鄭州 450000; 3. 鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 鄭州 450000)

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不同抗原對(duì)豬瘟病毒抗體ELISA檢測(cè)效果的影響

曾小宇1，苗銀萍1，趙冰琳2，魏卓1，趙林萍3*

(1. 鄭州中道生物技術(shù)有限公司, 鄭州 450000; 2. 河南中標(biāo)檢測(cè)服務(wù)有限公司, 鄭州 450000; 3. 鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 鄭州 450000)

為研究不同抗原對(duì)豬瘟病毒抗體ELISA檢測(cè)效果的影響，通過原核表達(dá)獲取豬瘟病毒重組E2蛋白、E0蛋白、C蛋白和NS5B蛋白，大小分別約為35、42、16和80 kD。經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化并利用BandScan軟件進(jìn)行計(jì)算，純度均在90%以上，滿足ELISA檢測(cè)包被用原料純度的要求。將上述4種蛋白作為包被抗原進(jìn)行ELISA，以10份企業(yè)陽性質(zhì)控品血清和10份企業(yè)陰性質(zhì)控品血清為檢驗(yàn)指標(biāo)比較不同抗原對(duì)豬瘟病毒抗體ELISA檢測(cè)效果的影響。結(jié)果以E2蛋白為原料的包被板檢測(cè)質(zhì)控血清時(shí)，靈敏度和特異性均達(dá)到80%以上，能夠滿足豬瘟病毒抗體ELISA檢測(cè)的要求，故選擇E2蛋白作為包被抗原并進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)試劑的研制。用研制的試劑與國(guó)際知名度高、產(chǎn)品質(zhì)量好的美國(guó)IDEXX同類試劑對(duì)432份臨床豬血清進(jìn)行符合性檢測(cè)，結(jié)果與美國(guó)IDEXX試劑的陽性符合率為95.53%，陰性符合率為86.56%，總符合率為91.67%，兩種試劑檢測(cè)結(jié)果具有較高的一致性。試驗(yàn)表明，用E2蛋白為包被抗原對(duì)豬瘟病毒抗體進(jìn)行ELISA檢測(cè)的效果最好，制備的檢測(cè)試劑可用于臨床豬瘟病毒血清抗體的檢測(cè)，為今后豬瘟病毒抗體ELISA檢測(cè)試劑的進(jìn)一步研制奠定了基礎(chǔ)。

ELISA；檢測(cè)效果；原核表達(dá)；E2蛋白

豬瘟是危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一，廣泛存在于全世界范圍內(nèi)，具有發(fā)病急、發(fā)病快的特點(diǎn)，給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。目前，對(duì)該病尚無有效的治療藥物，疫苗免疫是唯一有效預(yù)防該病的手段[3-5]，因此定期開展免疫豬場(chǎng)的抗體監(jiān)測(cè)對(duì)防控豬瘟疫病具有重大的意義。

目前用于豬瘟病毒抗體檢測(cè)的方法有病毒中和試驗(yàn)和ELISA試驗(yàn)，其中病毒中和試驗(yàn)包括熒光抗體病毒中和試驗(yàn)(FAVN)和過氧化物酶聯(lián)中和試驗(yàn)(NPLA)，這兩種方法具有特異性強(qiáng)，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，均為國(guó)際貿(mào)易指定方法[6]。由于病毒中和試驗(yàn)涉及到病毒培養(yǎng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室和從業(yè)人員的要求高，存在散毒的風(fēng)險(xiǎn)，且每批次檢測(cè)樣本的數(shù)量有限，僅用于對(duì)可疑樣本進(jìn)行確診，不宜進(jìn)行大量樣本的普查工作[7]。ELISA試驗(yàn)方法簡(jiǎn)便，易于操作，能對(duì)樣本進(jìn)行批量檢測(cè)，同時(shí)具有較強(qiáng)的敏感度和特異性，基于以上優(yōu)點(diǎn)，以E2蛋白、E0蛋白、C蛋白和NS5B蛋白4種豬瘟病毒蛋白為包被抗原進(jìn)行比較，篩選出效果最好的一種蛋白作為包被抗原進(jìn)行豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑的初步研制，為該檢測(cè)試劑的進(jìn)一步研制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床豬血清432份 來自河南省南陽市某養(yǎng)殖場(chǎng)，每份5 mL～10 mL不等。

1.1.2 對(duì)照試劑盒 美國(guó)IDEXX公司豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒，批號(hào)：E331，購(gòu)自北京愛德士元亨生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 企業(yè)質(zhì)控品血清 經(jīng)由IDEXX對(duì)照試劑對(duì)大量臨床血清進(jìn)行篩查，挑選出陽性樣本和陰性樣本各10份，挑選后再用IDEXX對(duì)照試劑進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，確定10份陽性質(zhì)控品血清的檢測(cè)結(jié)果為陽性，10份陰性質(zhì)控品血清的檢測(cè)結(jié)果為陰性。陽性質(zhì)控品血清編號(hào)P1-P10，陰性質(zhì)控品血清編號(hào)N1-N10。

1.1.4 毒種 豬瘟活疫苗(細(xì)胞源)，兔化弱毒株(CVCCAV1412)，批號(hào)：130101CA，購(gòu)自洛陽普萊克生物技術(shù)有限公司。

1.1.5 菌株及載體 感受態(tài)E.coliDH5α、感受態(tài)E.coliBL21(DE3)和載體pET32a，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.6 酶標(biāo)板 批號(hào)：AT2922160613，購(gòu)自廈門市云鵬科技發(fā)展有限公司，抗原吸附用的固相載體。

1.1.7 其他試劑 BSA，批號(hào)：160905，純度≥96%，500 g/袋，購(gòu)自鹽城賽寶生物科技有限公司，用于抗原包被板的封閉；HRP標(biāo)記鼠抗豬IgG，批號(hào)：20160501，10 mL/瓶，購(gòu)自洛陽佰奧通實(shí)驗(yàn)材料中心，用于酶標(biāo)二抗工作液的配制；TMB·2HCl·2H2O，批號(hào)：710501102，純度≥98%，5 g/瓶，購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，用于顯色底物的配制；硫酸，批號(hào)161121，分析純，500 mL/瓶，購(gòu)自上海振企化學(xué)試劑有限公司，用于終止液的配制。BamH I、Hind III、EcoR I和XhoI限制性內(nèi)切酶，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。LB培養(yǎng)基，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.8 儀器 TP650 PCR儀，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；DYY-8C電泳儀，購(gòu)自上海市大一儀器廠；MK3酶標(biāo)儀，購(gòu)自賽默飛；電熱恒溫培養(yǎng)箱，購(gòu)自北京中興偉業(yè)儀器有限公司；TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，購(gòu)自湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器，購(gòu)自常州普天儀器制造有限公司；Tanon 1600凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自上海天能公司。

1.2 方法

1.2.1 豬瘟病毒E2蛋白、E0蛋白、C蛋白和NS5B蛋白的制備方法[8]

1.2.1.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)豬瘟兔化弱毒株基因序列，分別設(shè)計(jì)合成用于擴(kuò)增豬瘟病毒 E2基因、E0基因、C基因和NS5B基因的引物，并在上下游引物中分別引入酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基，引物5'端前三位是保護(hù)性堿基，斜體部分是限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。引物序列如下：

E2基因上游引物：

5'-TTTGGATCCCGGCTAGCCTGCAAGGAAGA-3'

E2基因下游引物：

5'-TATAAGCTTGTTGAAGTCGAAGCCACACC-3'

E0基因上游引物：

5'-TTTGAATTCATGTTGTACCAACCAGTTG-3'

E0基因下游引物：

5'-TTTCTCGAGGGTGCAGTTGTTAGTGTACC-3'

C基因上游引物：

5'-TTTGGATCCTCCGATGATGGCGCAAGTGG-3'

C基因下游引物：

5'-TTTAAGCTTGGCTTCAACTGGTTGGTACA-3'

NS5B基因上游引物：

5'-TTTGAATTCAGTAATTGGGTGATGCAAGA-3'

NS5B基因下游引物：

5'-TTTCTCGAGTGCCCCTCTCCCTATCAGCG-3'

E2基因和C基因酶切位點(diǎn)是BamH I和Hind III，E0基因和NS5B基因酶切位點(diǎn)是EcoR I和XhoI。

1.2.1.2 4種基因片段的擴(kuò)增 提取豬瘟兔化弱毒株中的RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，分別用4種特異性引物擴(kuò)增目的片段。

1.2.1.3 4種基因重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 用BamH I和Hind III限制性內(nèi)切酶分別酶切E2基因、C基因和表達(dá)質(zhì)粒pET32a，同時(shí)用EcoR I和XhoI限制性內(nèi)切酶分別酶切E0基因、NS5B基因和表達(dá)質(zhì)粒pET32a。將酶切后的基因和表達(dá)質(zhì)粒按一定比例連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coliDH5α中。經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定后獲取4種重組表達(dá)質(zhì)粒，分別為pET32a-E2、pET32a-E0、pET32a-C和 pET32a-NS5B。

1.2.1.4 4種重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 分別將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coliBL21(DE3)中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，超聲破菌30 min。經(jīng)SDS-PAGE鑒定，挑選出陽性表達(dá)菌株進(jìn)行大批量誘導(dǎo)表達(dá)。用Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白。

1.2.2 豬瘟病毒抗體ELISA檢測(cè)方法的建立

1.2.2.1 操作方法 采用間接ELISA法原理[9]，將蛋白抗原按20 ng/孔包被到酶標(biāo)板上，經(jīng)2 ℃～8 ℃過夜吸附，次日將包被板中未吸附的抗原包被液洗去，再用10%的BSA溶液進(jìn)行封閉，2 ℃～8 ℃封閉12 h，洗去封閉液，37 ℃烘烤至干。將待檢樣品加入到抗原包被板中，37 ℃溫育30 min，洗滌5次后加入酶標(biāo)二抗，37 ℃溫育30 min，洗滌5次后加入顯色底物，37 ℃溫育10 min，加入終止液終止顯色反應(yīng)。若待檢樣品中含有豬瘟病毒抗體，則與包被板中的包被抗原結(jié)合形成抗原-抗體免疫復(fù)合物被固定在酶標(biāo)板上，并與隨后加入的酶標(biāo)記抗豬IgG形成“固相抗原-抗體-抗豬抗體-HRP”免疫復(fù)合物，洗滌后，加入顯色劑即顯色，為陽性，反之為陰性。

1.2.2.2 結(jié)果判定 參考相關(guān)文獻(xiàn)[10-11]，陰性標(biāo)本2.1倍處的OD值是線性的中間點(diǎn)，此點(diǎn)比較敏感和穩(wěn)定。故以陰性對(duì)照OD值的2.1倍為臨界值，若待檢樣本的OD值≥臨界值，結(jié)果判為陽性；若待檢樣本的OD值<臨界值，結(jié)果判為陰性。

1.2.2.3 4種包被蛋白的篩選 將原核表達(dá)獲取的豬瘟病毒重組E2蛋白、E0蛋白、C蛋白和NS5B蛋白分別進(jìn)行包被，以10份企業(yè)陽性質(zhì)控品血清和10份企業(yè)陰性質(zhì)控品血清為檢驗(yàn)指標(biāo)，篩選出最合適的包被原料。

1.2.2.4 與美國(guó)IDEXX同類試劑進(jìn)行符合性試驗(yàn)

分別用鄭州中道生物技術(shù)有限公司初步研制的豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑(以下簡(jiǎn)稱“中道試劑”)和美國(guó)IDEXX同類試劑檢測(cè)432份臨床豬血清，并進(jìn)行符合率比較，計(jì)算陽性符合率、陰性符合率和總符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 4 種基因片段的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果 經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，獲得大小為636 bp、768 bp、297 bp和2154 bp的目的片段(圖1)，與預(yù)計(jì)E2基因、E0基因、C基因和NS5B基因大小一致。

1: E2基因；2，4，6和8: DNA Marker DL 2000；3: E0基因；5: C基因；7: NS5B基因 1: E2 gene; 2, 4, 6and 8: DNA Marker DL2000; 3: E0 gene; 5: C gene; 7: NS5B gene圖1 4種基因片段的RT-PCR擴(kuò)增Fig 1 RT-PCR amplification of four gene products

2.2 4種基因重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 重組質(zhì)粒經(jīng)RT-PCR鑒定，均獲得與目的基因大小一致的片段。分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶作用，然后將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖2。由圖可見，酶切后均出現(xiàn)與目的片段大小一致的條帶和預(yù)期大小的載體。

2.3 4種蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)2 h后，重組蛋白獲得表達(dá)，SDS-PAGE電泳圖可見，重組E2蛋白、E0蛋白、C蛋白和NS5B蛋白大小分別約為35 、42、16和80 kD(圖3中的2，5，8和11)。挑選陽性重組菌進(jìn)行大批量誘導(dǎo)表達(dá)，超聲破菌，用Ni-NTA親和層析柱純化，純化后蛋白(圖3中的3，6，9和12)經(jīng)BandScan軟件計(jì)算，純度分別為95%、90%、91%和92%，滿足ELISA檢測(cè)包被用原料純度的要求。

2.4 4種包被蛋白檢測(cè)企業(yè)質(zhì)控品血清的結(jié)果

將E2蛋白、E0蛋白、C蛋白和NS5B蛋白分別進(jìn)行包被，檢測(cè)10份企業(yè)陽性質(zhì)控品血清，P1-P10，結(jié)果見表1。檢測(cè)10份企業(yè)陰性質(zhì)控品血清，N1-N10，結(jié)果見表2。

1,6: DNA Marker DL 5000；2: pET32a-C酶切產(chǎn)物；3: pET32a- E2酶切產(chǎn)物；4: pET32a- E0酶切產(chǎn)物；5: pET32a-NS5B酶切產(chǎn)物1, 6: DNA Marker DL 5000; 2: pET32a-C digested product; 3: pET32a- E2 digested product; 4: pET32a- E0 digested product; 5: pET32a-NS5B digested product圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定Fig 2 Enzyme identification of recombinant expression plasmids

1,4,10: 蛋白Marker 80 kD；2: pET32a- E2/BL21(DE3)誘導(dǎo)后；3: 純化后E2蛋白；5: pET32a- E0/BL21(DE3)誘導(dǎo)后； 6: 純化后E0蛋白；7: 蛋白Marker 100 kD；8: pET32a- C/BL21(DE3)誘導(dǎo)后；9: 純化后C蛋白； 11: pET32a- NS5B/BL21(DE3)誘導(dǎo)后；12: 純化后NS5B蛋白1, 4,10: Protein Marker 80 kD; 2: pET32a- E2/BL21(DE3)with induction; 3: target protein E2 after purification; 5: pET32a- E0/BL21(DE3)with induction; 6: target protein E0 after purification; 7: Protein Marker 100 kD; 8: pET32a- C/BL21(DE3)with induction; 9: target protein C after purification; 11: pET32a- NS5B/BL21(DE3)with induction; 12: target protein NS5B after purification 圖3 4種重組蛋白的SDS-PAGE鑒定Fig 3 SDS-PAGE identification of four recombinant proteins

包被原料臨界值P1P2P3P4P5P6P7P8P9P10E20.1790.3540.3900.0520.7840.6910.4890.9981.5871.2271.998++-+++++++E00.2210.0450.1010.0870.4351.6450.0560.7410.1131.0571.524---++-+-++C0.2000.5780.6470.7460.8271.2670.1541.6451.0871.2850.798+++++-++++NS5B0.1830.0570.0680.0780.0950.1040.0820.0621.0450.9240.045-------++-

P1-P10為10份陽性質(zhì)控品血清編號(hào)。P1-P10酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果在表中用數(shù)值表示，判定結(jié)果用"+"和"-"表示。"+"表示檢測(cè)結(jié)果大于臨界值，為陽性；"-"表示檢測(cè)結(jié)果小于臨界值，為陰性

P1-P10 is the number of ten positive quality control sera. The instrument test results of P1-P10 were indicated by numerical values. The determination results of P1-P10 were indicated by symbol "+" and "-". If the determination results were greater than the critical value, symbol "+"was used. If the determination results were less than the critical value, symbol "-"was used

表2 4種豬瘟病毒蛋白分別作為包被抗原檢測(cè)10份企業(yè)陰性質(zhì)控品血清結(jié)果Tab 2 The results of ten negative quality control sera detected by four kinds of swine fever virus proteins

N1-N10為10份陰性質(zhì)控品血清編號(hào)。N1-N10酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果用數(shù)值表示，判定結(jié)果用"+"和"-"表示。"+"表示檢測(cè)結(jié)果大于臨界值，為陽性；"-"表示檢測(cè)結(jié)果小于臨界值，為陰性

N1-N10 is the number of ten negative quality control sera. The instrument test results of N1-N10 were indicated by numerical values. The determination results of N1-N10 were indicated by symbol "+" and "-". If the determination results were greater than the critical value, symbol "+"was used. If the determination results were less than the critical value, symbol "-"was used

由表1和表2可見，采用E2蛋白作為原料進(jìn)行包被，10份陽性質(zhì)控品血清檢測(cè)出9份為陽性結(jié)果，靈敏度為90%，10份陰性質(zhì)控品血清檢測(cè)出8份為陰性結(jié)果，特異性為80%；采用E0蛋白作為原料進(jìn)行包被，陽性質(zhì)控品血清檢測(cè)出5份為陽性，陰性質(zhì)控品血清檢測(cè)出6份為陰性，其靈敏度與特異性均在50%附近，說明用E0蛋白包被進(jìn)行樣本檢測(cè)時(shí)存在很大的隨機(jī)性；采用C蛋白作為原料進(jìn)行包被，雖然陽性質(zhì)控品血清檢測(cè)出9份為陽性，但陰性質(zhì)控品血清檢測(cè)出8份為陽性結(jié)果，說明該蛋白存在很嚴(yán)重的非特異性結(jié)合，特異性效果很差；采用NS5B蛋白作為原料進(jìn)行包被，檢測(cè)的質(zhì)控品血清基本為陰性，說明該蛋白的捕獲能力很弱，不能滿足豬瘟病毒抗體ELISA檢測(cè)的要求。故采用E2蛋白作為包被原料進(jìn)行豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑的初步研制。

2.5 與美國(guó)IDEXX同類試劑進(jìn)行符合性檢測(cè)的結(jié)果

分別用中道試劑與美國(guó)IDEXX同類試劑對(duì)432份臨床豬血清進(jìn)行符合性檢測(cè)，結(jié)果見表3。

表3 兩種試劑檢測(cè)432份臨床豬血清樣本的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab 3 The data statistics of pig clinical 432 samples of sera detected by two kinds of reagents

表3中A區(qū)域表示兩種試劑均檢測(cè)為陽性結(jié)果；B區(qū)域表示中道試劑檢測(cè)為陽性結(jié)果，IDEXX試劑檢測(cè)為陰性結(jié)果；C區(qū)域表示中道試劑檢測(cè)為陰性結(jié)果，美國(guó)IDEXX試劑檢測(cè)為陽性結(jié)果；D區(qū)域表示兩種試劑均檢測(cè)為陰性結(jié)果。以IDEXX試劑作為參考，中道試劑與之比較的結(jié)果為：陽性符合率為A/(A+C)*100%=95.53%；陰性符合率為D/(B+D)*100%=86.56%；總符合率為(A+D)/(A+B+C+D)*100%=91.67%。由此可見中道試劑與美國(guó)IDEXX同類試劑具有較高的一致性，能用于臨床豬瘟病毒血清抗體的檢測(cè)。

3 小結(jié)與討論

與細(xì)胞培養(yǎng)病毒相比，原核表達(dá)系統(tǒng)具有易于控制、成本低、不需要大量的人力物力、不會(huì)出現(xiàn)散毒等優(yōu)點(diǎn)；與真核表達(dá)系統(tǒng)相比，原核表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)單、易于控制、蛋白表達(dá)量多、成本低等優(yōu)點(diǎn)。故本文通過原核表達(dá)獲取重組豬瘟病毒E2蛋白、E0蛋白、C蛋白和NS5B蛋白，大小分別約為35、42、16和80 kD。經(jīng)過Ni-NTA親和層析柱純化并利用BandScan軟件計(jì)算，純度均在90%以上，滿足ELISA檢測(cè)包被用原料純度的要求。

以上述4種蛋白作為包被原料，分別進(jìn)行抗原包被板的制備，以10份企業(yè)陽性質(zhì)控品血清和10份企業(yè)陰性質(zhì)控品血清為檢驗(yàn)指標(biāo)比較不同抗原對(duì)豬瘟病毒抗體ELISA檢測(cè)效果的影響。結(jié)果采用E2蛋白作為原料進(jìn)行包被時(shí)，檢測(cè)靈敏度和特異性均達(dá)到80%以上，能夠滿足豬瘟病毒抗體ELISA檢測(cè)的要求；采用E0蛋白作為原料進(jìn)行包被時(shí)，檢測(cè)結(jié)果隨機(jī)性很大，數(shù)據(jù)無規(guī)律；采用C蛋白作為原料進(jìn)行包被時(shí)，檢測(cè)結(jié)果存在很嚴(yán)重的非特異性結(jié)合；采用NS5B蛋白作為原料進(jìn)行包被時(shí)，檢測(cè)結(jié)果基本為陰性，說明該蛋白的捕獲能力很弱，不能滿足豬瘟病毒抗體ELISA檢測(cè)的要求。故采用E2蛋白作為包被原料并進(jìn)行豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑的初步研制。

利用酶聯(lián)免疫間接法原理，初步研制出豬瘟病毒抗體ELISA檢測(cè)試劑，并將其與國(guó)際知名度高、產(chǎn)品質(zhì)量好的美國(guó)IDEXX同類試劑對(duì)432份臨床豬血清進(jìn)行符合性檢測(cè)，結(jié)果與美國(guó)IDEXX試劑的陽性符合率為95.53%，陰性符合率為86.56%，總符合率為91.67%，符合性檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示兩種試劑檢測(cè)結(jié)果具有較高的一致性。同時(shí)，兩種試劑盒還存在有10%左右的差異，出現(xiàn)這種差異的可能原因有以下兩點(diǎn)：1)兩種試劑組分及檢驗(yàn)原理上的差異，美國(guó)IDEXX試劑是采用酶聯(lián)免疫阻斷法的原理，涉及到酶標(biāo)記單克隆抗體，中道試劑是采用酶聯(lián)免疫間接法的原理，涉及到物種IgG的酶標(biāo)二抗，因酶標(biāo)記物的不同，間接法酶標(biāo)的二抗相對(duì)于阻斷法而言，將樣本檢測(cè)出為陽性結(jié)果的概率要稍大一些。2)由于各地豬瘟病毒E2蛋白的基因序列略有不同，豬瘟病毒可以劃分為3個(gè)基因群，同時(shí)每群又劃分為一些亞群。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[12]，中國(guó)的豬瘟病毒主要是在第2.1亞群，英美國(guó)家的豬瘟病毒主要在第1.1亞群。所以同屬豬瘟病毒的E2蛋白，我國(guó)的E2蛋白和美國(guó)的E2蛋白在一些基因序列上也會(huì)存在些許的差異，從而以它們?yōu)樵线M(jìn)行產(chǎn)品生產(chǎn)后會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品間檢測(cè)結(jié)果存在一些差異。綜上所述，用E2蛋白為包被抗原對(duì)豬瘟病毒抗體進(jìn)行ELISA檢測(cè)的效果最好，制備的檢測(cè)試劑可初步用于臨床豬瘟病毒血清抗體的檢測(cè)，為今后豬瘟病毒抗體ELISA檢測(cè)試劑的進(jìn)一步研制奠定了基礎(chǔ)。

[1] 衛(wèi)選智, 張付華, 王新平, 等. 不同免疫程序?qū)ωi瘟活疫苗免疫效果的研究[J]. 中國(guó)獸藥雜志, 2017, 51(2): 7-12.

Wei X Z, Zhang F H, Wang X P,etal. Research about different immunization procedures on the immune effect of CSFV live vaccine[J]. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2017, 51(2): 7-12.

[2] 李明義, 白志娟, 王莉娟, 等. 豬瘟滅活疫苗抗體消長(zhǎng)規(guī)律動(dòng)態(tài)研究[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2005, 27(5): 385-388.

Li M Y, Bai Z J, Wang L J,etal. Dynamic study on the eating and flowing laws of CSF antibody induced by CSF inactivatd vaccine[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2005, 27(5): 385-388.

[3] Vandeputte J, Too H L, Ng F K,etal. Adsorption of colostral antibodies against classical swine fever, persistence of maternal antibodies, and effect on response to vaccination in baby pigs[J]. American Journal of Veterinary Research, 2001, 62(11): 1805-1811.

[4] 韓雪清, 劉湘濤, 趙啟祖. 豬瘟病毒及其豬瘟疫苗研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2000, 2(21): 1-7.

Han X Q, Liu X T, Zhao Q Z. Progress of study on swine fever virus and it's vaccine[J]. Progress in Veterinary Medicine, 2000, 2(21): 1-7.

[5] Tesmer S, Urbaneck D, kaden V,etal. Effect of attenuated hog cholera virus vaccine from the inoculation virus strain “c” on pregnant sows and the progeny[J]. Monatshefte Für Veterinrmedizin, 1973, 28(7): 251-254.

[6] Robertson A, Greig A S, Appel M,etal. Hog cholera IV. Detection of the virus in tissue culture prepatations by the fluorescent antibody technique[J]. Canadian Journal of Comparative Medicine & Veterinary Science, 1965, 29(9): 234-241.

[7] Moser C, Ruggli N, Tratschin J D,etal. Detection of antibodies against classical swine fever virus in swine sera by indirect ELISA using recombinant envelope glycoprotein E2[J]. Veterinary Microbiology, 1996, 51(1): 41-53.

[8] [美] J. 薩姆布魯克, D. W. 拉塞爾. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].黃培堂,譯. 北京: 科學(xué)出版社, 2002: 625-632.

[U.S.A]Written by J Sambrook, D W Russell. Molecular cloning: A laboratory manual[M].Translatied by Huang P T. Beijing: Science Press, 2002: 625-632.

[9] 李學(xué)伍. 豬病快速診斷與防治技術(shù)[M]. 北京: 機(jī)械工業(yè)出版社, 2014: 44.

Li X W. Technology of Rapid Diagnosis and Preventive Treatment for Swine Disease[M]. Beijing: China Machine Press, 2014: 44.

[10]Voller A, Bartlett A, Bidwell D E. Enzyme immunoassays with special reference to ELISA techniques[J]. Journal of Clinical Pathology, 1978, 31(6): 507-520.

[11]McLaren M L, Lillywhite J E, Au A C. Indirect enzyme linked immunosorbent assay (ELISA): Practical aspects of standardization and quality control[J]. Medical Laboratory Sciences, 1981, 38(3): 245-251.

[12]陳繼明. 重大動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)指南[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社, 2008: 190-191.

Chen J M. Manual for the monitoring of major animal diseases[M]. Beijing: China Agricultural Science and Technology Press, 2008: 190-191.

(編輯：李文平)

Effects of Different Antigents on ELISA Detecting Efficiency for the Antibody of Classical Swine Fever Virus

ZENG Xiao-yu1, MIAO Yin-ping1, ZHAO Bing-lin2, WEI Zhuo1, ZHAO Lin-ping3*

(1.ZhengzhouZhongdaoBiotechCoLtd,Zhengzhou450000,China; 2.HenanZhongbiaoTestingServiceCoLtd,Zhengzhou450000,China;
3.SchoolofLifeSciencesZhengzhouUniversity,Zhengzhou450000,China)

ZHAOLin-ping,E-mail:zlp369@vip.163.com

To understand the effects of different antigents on ELISA detecting efficiency for the antibody of classical swine fever virus (CSFV), the recombinant E2 protein, E0 protein, C protein and NS5B protein of CSFV were obtained by prokaryotic expression which were about 35,42,16 and 80 kD. These proteins were purified by using Ni-NTA affinity chromatographic column. The purity of the raw materials calculated by BandScan software was suitable for ELISA detection. The ELISA was carried on by using four proteins above as coating antigents. The effect of ELISA detection result for CSFV antibody by using different antigents was compared through ten samples of CSFV-positive sera and ten samples of CSFV-negative sera from company. The result showed that the sensitivity and specificity of reagent can reach more than 80% by using E2 protein as the raw material which was coated to detecting the control sera. Therefore, E2 protein was satisfied for CSFV antibody ELISA detection. As the results, E2 protein was treated as the coating antigent to developing ELISA reagent. The positive coincidence rate, negative coincidence rate and total coincidence rate of developed reagent were 95.53%, 86.56% and 91.67%, compared to IDEXX reagent with high popularity and good quality internationally from Untied States on 432 samples of pig clinical samples. In a word, the ability to detect the CSFV antibody from IDEXX and our company were almost the same. The results indicated that it's the best effect of ELISA detection result for CSFV antibody by using E2 protein as coating antigen. This reagent can be used for the detection of pig clinical sera, which laid the foundation for the further study of the detection reagent in ELISA.

ELISA; detecting efficiency; prokaryotic expression; E2 protein

曾小宇，碩士，工程師，從事動(dòng)物疫病診斷試劑的研發(fā)與生產(chǎn)。

趙林萍。E-mail: zlp369@vip.163.com

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.6.03

2017-03-09

A

1002-1280 (2017) 06-0019-08

S852.651