郭婉萍，趙晶，欒春雨，郭灣，權(quán)春善

(大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大連民族大學(xué)生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116600)

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水產(chǎn)養(yǎng)殖用復(fù)合微生物粉劑中菌種的分子生物學(xué)鑒定

郭婉萍，趙晶*，欒春雨，郭灣，權(quán)春善

(大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大連民族大學(xué)生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116600)

對(duì)兩種市售水產(chǎn)養(yǎng)殖用復(fù)合微生物粉劑中微生物菌種進(jìn)行鑒定。利用平板分離技術(shù)對(duì)粉劑中的微生物進(jìn)行分離純化，進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察、16S rDNA和26S rDNA序列分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明，兩種微生物粉劑中菌群結(jié)構(gòu)存在一定差異，S1粉劑中鑒定出5株芽孢桿菌和2株酵母菌，分別為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌或索諾拉沙漠芽孢桿菌、葡萄牙棒孢酵母和庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母；S2粉劑中鑒定出3株芽孢桿菌、1株放線菌、2株酵母菌和3株腸球菌，分別為解木糖賴氨酸芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌或索諾拉沙漠芽孢桿菌、芬氏纖維微菌、釀酒酵母、庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母、鶉雞腸球菌、屎腸球菌或乳酸腸球菌。明確水產(chǎn)養(yǎng)殖用復(fù)合微生物粉劑的菌群結(jié)構(gòu)，為同類產(chǎn)品的安全性及有效性評(píng)估提供理論基礎(chǔ)。

水產(chǎn)養(yǎng)殖；復(fù)合微生物粉劑；菌群結(jié)構(gòu)；鑒定；16S rDNA；26S rDNA

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)集約化程度的提高，養(yǎng)殖水體污染嚴(yán)重、水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害發(fā)生率增加等問(wèn)題不斷凸顯，嚴(yán)重制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治的傳統(tǒng)方法主要是使用抗生素及化學(xué)藥物，然而，該方法會(huì)導(dǎo)致病原微生物的耐藥性提高、養(yǎng)殖對(duì)象體內(nèi)藥物殘留甚至藥害事故，具有一定的局限性，不利于水產(chǎn)品的質(zhì)量安全。近年來(lái)，微生物制劑作為一類新型的水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥，由于其廉價(jià)、安全高效、無(wú)污染、有效改善水體環(huán)境、防治病害及促進(jìn)養(yǎng)殖對(duì)象生長(zhǎng)等特點(diǎn)，已在國(guó)內(nèi)外得到廣泛重視[1-3]。按照菌種組成，微生物制劑分為單一菌種制劑和復(fù)合菌種制劑，其中市售的多為復(fù)合微生物制劑，不同品牌存在微生物菌種及配比的差異。目前，我國(guó)對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖用微生物制劑缺乏有效管理，尤其是對(duì)于用于水質(zhì)改良的微生物制劑菌種，缺乏明確規(guī)定。目前市售復(fù)合微生物制劑存在菌種種類標(biāo)注不完整，產(chǎn)品說(shuō)明存在夸大效果等問(wèn)題，產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊，是否適合水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境有待考察[4]。對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖復(fù)合微生物制劑的有效性和安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，是確保產(chǎn)品質(zhì)量和使用效果的必要手段，而菌種組成是評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一。目前僅有少數(shù)研究對(duì)農(nóng)業(yè)及環(huán)保領(lǐng)域使用的復(fù)合微生物制劑進(jìn)行了菌種鑒定[5-7]，對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖用復(fù)合微生物制劑尚無(wú)菌種組成分析的研究。

微生物制劑主要有固體、半固體和液體制劑三種劑型，其中固體制劑以粉劑劑型為主，具有便于運(yùn)輸和保存、菌種數(shù)量較為穩(wěn)定的特點(diǎn)[4]。本研究選擇兩種市售水產(chǎn)養(yǎng)殖復(fù)合微生物粉劑為研究對(duì)象，利用分子生物學(xué)鑒定方法，鑒定其中的菌種多樣性，為該類產(chǎn)品的質(zhì)量檢測(cè)和所含菌種的安全性評(píng)估奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 水產(chǎn)養(yǎng)殖用復(fù)合微生物粉劑 市售EM菌劑 (下文中用S1表示)，產(chǎn)地河北，標(biāo)注菌群包括乳酸桿菌、芽孢桿菌、放線菌等，活菌總數(shù)未注明。市售復(fù)合菌劑(下文中用S2表示)，產(chǎn)地河南，標(biāo)注菌群包括放線菌、乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌等，活菌總數(shù)≥500億/克。

1.1.2 主要試劑及儀器 2×Taq預(yù)混PCR反應(yīng)體系購(gòu)自北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司，DL2000 DNA Marker、λ-Hind Ⅲ digest DNA Marker、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、DNA純化試劑盒等均購(gòu)自寶生物(Takara)工程(大連)有限公司，酵母基因組DNA快速抽提試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。HVE-50高壓滅菌器購(gòu)自日本Hirayama公司，DH500A電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自天津泰斯特儀器有限公司，ZWY-240恒溫?fù)u床購(gòu)自上海智城分析儀器制造有限公司，ABI Veriti PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司 ，Mupid-2plus核酸電泳儀購(gòu)自日本Mupid公司，GelDoc-ItTM300凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)UVP公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種篩選培養(yǎng)基的配置 菌種篩選培養(yǎng)基的配置按文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。

1.2.2 菌種分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察 以無(wú)菌藥匙稱取固體菌劑10 g至盛有90 mL滅菌蒸餾水的錐形瓶中，振搖30 min，制成10-1的菌懸液并進(jìn)行梯度稀釋。采用平板稀釋涂布法對(duì)酵母菌、放線菌、乳酸菌、芽孢桿菌分別進(jìn)行分離，其中乳酸菌采用雙層平板法培養(yǎng)。酵母菌培養(yǎng)條件為28 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，放線菌培養(yǎng)條件為28 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，芽孢桿菌培養(yǎng)條件為30 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，乳酸菌培養(yǎng)條件為36 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d。挑取單菌落劃線分離獲得純種，觀察菌落特征，并于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。純化后的菌種接種于未加瓊脂的菌種篩選培養(yǎng)基，180 r/min振蕩培養(yǎng)。

1.2.3 菌種分子生物學(xué)鑒定

1.2.3.1 基因組提取 酵母基因組提取按照酵母基因組DNA快速抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，放線菌、乳酸菌、芽孢桿菌基因組DNA提取按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組 DNA的完整性。

1.2.3.2 16S rDNA和26S rDNA的PCR擴(kuò)增 以提取的放線菌、乳酸菌、芽孢桿菌基因組DNA為模板，利用通用引物16S-27f和16S-1541r進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增，正向27f引物序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向1541r引物序列為5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′；以提取的酵母菌基因組DNA為模板，利用通用引物NL1和NL4進(jìn)行26S rDNA D1/D2區(qū)PCR擴(kuò)增，正向NL-1引物序列為：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′，反向NL-4引物序列為5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′，由生工生物工程(上海)公司合成。 PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，100 V恒壓30 min，UVP凝膠成像系統(tǒng)觀察并成像分析。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后送生工生物工程(上海)公司測(cè)序。

1.2.3.3 PCR產(chǎn)物鑒定及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

采用BLAST檢索GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析，確定其種屬。利用MEGA 5.0軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行16S rDNA和26S rDNA序列比對(duì)分析，并采用鄰接法(Neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，通過(guò)1000次的自舉分析(bootstrap)進(jìn)行置信度檢測(cè)。序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲取登錄號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選菌株的形態(tài)學(xué)觀察 利用菌種篩選培養(yǎng)基對(duì)S1和S2兩種粉劑中的菌株進(jìn)行分離培養(yǎng)，從S1粉劑中篩選得到的5株芽孢桿菌分別編號(hào)為S1-B1、S1-B2、S1-B3、S1-B4和S1-B5；2株酵母菌分別編號(hào)為S1-Y1和S1-Y2。從S2粉劑中篩選得到的3株芽孢桿菌分別編號(hào)為S2-B1、S2-B2和S2-B3；1株放線菌編號(hào)為S2-A1；2株酵母菌分別編號(hào)為S2-Y1和S2-Y2; 3株腸球菌分別編號(hào)為S2-L1、S2-L2和S2-L3。對(duì)各菌株的菌落及細(xì)胞形態(tài)特征進(jìn)行觀察，結(jié)果見(jiàn)表1。其中3株腸球菌均能使溴甲酚綠變?yōu)辄S色。

2.2 16S rDNA和26S rDNA基因序列 PCR 擴(kuò)增 以提取的各篩選菌株基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示(圖1)，擴(kuò)增的目的片段電泳條帶清晰，芽孢桿菌、放線菌及腸球菌16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1500 bp左右；酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為500～650 bp左右。

表1 菌落及細(xì)胞形態(tài)特征觀察結(jié)果Tab 1 The morphological characteristics of cells and colonies

續(xù)表

M：DL2000 DNA Marker；圖(a)為S1和S2菌劑中芽孢桿菌16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；圖(b)為S2菌劑中放線菌16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；圖(c)為S1和S2菌劑中酵母菌26S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；圖(d)為S2菌劑中腸球菌16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M: DL2000 DNA Marker; (a): PCR products of 16S rDNA of Bacillus strains in S1 and S2 microbial powders;(b): PCR product of 16S rDNA of an Actinomycete strain in S2 microbial powder;(c): PCR products of 26S rDNA of yeast strains in S1 and S2 microbial powders; (d): PCR products of 16S rDNA of Enterococcus strains in S2 microbial powder圖1 16S rDNA和26S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig 1 Electrophoresis of 16S rDNA and 26S rDNA PCR products

2.3 同源性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3.1 芽孢桿菌同源性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析 將S1和S2菌劑中篩選得到的8株芽孢桿菌與Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中已收錄菌株的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。

結(jié)果表明，S1菌劑中5株芽孢桿菌均為芽孢桿菌屬，其中S1-B1和S1-B5與Bacillussubtilis(枯草芽孢桿菌)相似性在99%-100%之間，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中處于同一分支，親緣關(guān)系最近，因此將兩株菌鑒定為枯草芽孢桿菌；S1-B2、S1-B3和S1-B4與Bacilluslicheniformis(地衣芽孢桿菌)和Bacillussonorensis(索諾拉沙漠芽孢桿菌)相似性在99%～100%之間，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示這三株菌與Bacilluslicheniformis及Bacillussonorensis處于同一分支，親緣關(guān)系最近，因此這三株菌為地衣芽孢桿菌或索諾拉沙漠芽孢桿菌。

S2菌劑中，S2-B1與賴氨酸芽孢桿菌屬菌株相似性在99%～100%之間，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示其與Lysinibacillusxylanilyticus(解木糖賴氨酸芽孢桿菌)處于同一分支，親緣關(guān)系最近，因此將S2-B1鑒定為解木糖賴氨酸芽孢桿菌。S2-B2與S2-B3為芽孢桿菌屬，其中S2-B2與Bacilluscirculans(環(huán)狀芽孢桿菌)相似性在 99%～100%之間，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中處于同一分支，親緣關(guān)系最近，因此將S2-B2鑒定為環(huán)狀芽孢桿菌；S2-B3與Bacilluslicheniformis(地衣芽孢桿菌)和Bacillussonorensis(索諾拉沙漠芽孢桿菌)相似性在99%～100%之間，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中處于同一分支，親緣關(guān)系最近，因此S2-B3為地衣芽孢桿菌或索諾拉沙漠芽孢桿菌。

圖2 芽孢桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig 2 Phylogenetic trees of Bacillus strains

2.3.2 放線菌同源性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析 將S2菌劑中篩選得到的1株放線菌與Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中已收錄菌株的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)。結(jié)果表明，S2-A1與Cellulosimicrobiumfunkei(芬氏纖維微菌)相似性在 99%～100%之間，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中處于同一分支，親緣關(guān)系最近，因此將S2-A1鑒定為芬氏纖維微菌。

圖3 放線菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig 3 Phylogenetic tree of an Actinomycete strain

2.3.3 酵母菌同源性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析 將S1和S2菌劑中篩選得到的4株酵母菌與Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中已收錄菌株的26S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4)。結(jié)果表明，S1-Y1與Clavisporalusitaniae(Candidalusitaniae)(葡萄牙棒孢酵母)相似性在 99%～100%之間，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中處于同一分支，親緣關(guān)系最近，因此將S1-Y1鑒定為葡萄牙棒孢酵母。S1-Y2與Pichiakudriavzevii(庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母)相似性在 99%～100%之間，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中處于同一分支，親緣關(guān)系最近，因此將S1-Y2鑒定為庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母。S2-Y1與Saccharomycescerevisiae(釀酒酵母)相似性在 99%～100%之間，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中處于同一分支，親緣關(guān)系最近，因此將S2-Y1鑒定為釀酒酵母。S2-Y2與Pichiakudriavzevii(庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母)相似性在 99%～100%之間，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中處于同一分支，親緣關(guān)系最近，因此將S2-Y2鑒定為庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母。

2.3.4 乳酸菌同源性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析 將S2菌劑中篩選得到的3株腸球菌與Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中已收錄菌株的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖5)。結(jié)果表明，S2-L1和S2-L3與Enterococcusfaecium(屎腸球菌)或Enterococcuslactis(乳酸腸球菌)相似性在 99%～100%之間，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中處于同一分支，親緣關(guān)系最近，因此這兩株菌為屎腸球菌或乳酸腸球菌。S2-L2與Enterococcusgallinarum(鶉雞腸球菌)相似性在 99%～100%之間，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中處于同一分支，親緣關(guān)系最近，因此將S2-L2鑒定為鶉雞腸球菌。三株菌均為乳酸菌。

圖4 酵母菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig 4 Phylogenetic trees of yeast strains

圖5 腸球菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig 5 Phylogenetic tree of Enterococcus strains

3 討 論

本研究對(duì)兩種市售水產(chǎn)養(yǎng)殖復(fù)合微生物粉劑中分離純化的微生物菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，S1粉劑中鑒定出5株芽孢桿菌，2株酵母菌；S2粉劑中鑒定出3株芽孢桿菌，1株放線菌，2株酵母菌，3株腸球菌。

芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中既可以作為飼料微生態(tài)添加劑，也可以作為水質(zhì)改良微生態(tài)調(diào)節(jié)劑使用。在兩種微生物粉劑中均鑒定出芽孢桿菌。其中，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌為我國(guó)農(nóng)業(yè)部2013年公布的可作為飼料添加劑的微生物菌種[4]。索諾拉沙漠芽孢桿菌與地衣芽孢桿菌有很近的親緣關(guān)系[9]，兩者的區(qū)分還需進(jìn)一步鑒定。解木糖賴氨酸芽孢桿菌目前相關(guān)的研究較少，該菌可作為抗黃曲霉素的生防菌株，具有纖維蛋白分解酶活性[10-12]，用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的有效性和安全性仍有待進(jìn)一步評(píng)價(jià)。環(huán)狀芽孢桿菌能夠有效修復(fù)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境，也可以作為水產(chǎn)飼用菌種，研究表明，其能夠提高鯉魚(yú)苗和虹鱒魚(yú)生長(zhǎng)速率和免疫能力[13-14]。

放線菌僅在S2粉劑中鑒定出。有研究顯示芬氏纖維微菌能夠降解纖維素和黃曲霉毒素，可用于畜禽飼料的降解處理以及受污染飼料中黃曲霉毒素的去除，對(duì)于促進(jìn)畜禽類的生長(zhǎng)繁殖具有重要作用[15-16]。然而，目前并無(wú)芬氏纖維微菌應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的研究報(bào)道，其有效性和安全性仍有待評(píng)估。

酵母菌是水生動(dòng)物消化道的常見(jiàn)優(yōu)勢(shì)菌群之一，在兩種微生物粉劑中均鑒定出酵母菌。其中，釀酒酵母為我國(guó)農(nóng)業(yè)部2013年公布的可作為飼料添加劑的微生物菌種[4]，在促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高水產(chǎn)飼料利用效率及增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物免疫能力等方面具有重要作用[17]。Clavisporalusitaniae是Candidalusitaniae的有性型，可能是白酒、陳醋等食品釀造大曲中的功能菌，然而，也有報(bào)道認(rèn)為其為條件性致病菌[18-20]，目前并無(wú)研究表明葡萄牙棒孢酵母用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母在健康凡納濱對(duì)蝦和印度鯪消化道和養(yǎng)殖水體中是優(yōu)勢(shì)菌株，該酵母菌具有多種胞外酶和單寧酶活性，可能對(duì)水生動(dòng)物具有較好的益生效果[21-23]；另有研究表明，庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母RY55菌株能夠合成殺傷毒素，對(duì)多種病原菌有顯著抗菌活性，有望成為新型生物防治菌株[24]。

乳酸菌僅在S2粉劑中鑒定出，包括屎腸球菌或乳酸腸球菌和鶉雞腸球菌。其中，屎腸球菌和乳酸腸球菌為我國(guó)農(nóng)業(yè)部2013年公布的可作為飼料添加劑的微生物菌種[4]，由于親緣關(guān)系較近，兩者的區(qū)分還需進(jìn)一步鑒定。目前并無(wú)乳酸腸球菌應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的研究報(bào)道，其有效性和安全性仍有待評(píng)估。多項(xiàng)研究認(rèn)為屎腸球菌可以作為水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖中的益生菌使用。Bogut等[25]研究表明，飼料中添加屎腸球菌能夠提高六須鯰魚(yú)的生長(zhǎng)速率，降低腸道中有害菌如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等的數(shù)量。Gopalakannan等[26]發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌能夠有效控制鯉魚(yú)的嗜水氣單胞菌感染。Avella等[27]研究顯示，屎腸球菌能顯著降低鰨魚(yú)腸道中弧菌數(shù)量，促進(jìn)其生長(zhǎng)性能。然而，屎腸球菌也可能存在安全隱患，Sun等[28]認(rèn)為，飼料中添加屎腸球菌能夠使斜帶石斑魚(yú)血清溶菌酶活性顯著降低，可能會(huì)影響其免疫功能，此外，屎腸球菌對(duì)多種抗生素的耐藥性和致病性屎腸球菌的使用也會(huì)危害水產(chǎn)養(yǎng)殖安全[29]。鶉雞腸球菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用的研究較少，有研究表明其對(duì)鰻弧菌有強(qiáng)抑制作用，對(duì)鱸魚(yú)無(wú)致病性，可作為益生菌使用[30]。然而，一些鶉雞腸球菌菌株也能引起多種感染及疾病，對(duì)多種抗生素有耐藥性[31]。綜上所述，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用腸球菌的安全性仍有待深入研究。

菌種組成和菌種特性是微生物制劑的關(guān)鍵指標(biāo)，對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)具有重要影響。本研究發(fā)現(xiàn)，微生物制劑存在著實(shí)際菌群種類與標(biāo)注不符的問(wèn)題，其中部分菌種并不屬于國(guó)家規(guī)定的飼用微生物菌種，對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖的水質(zhì)改良能力亦不明確，可能對(duì)水生動(dòng)物健康與水產(chǎn)品質(zhì)量安全造成一定隱患。因此，當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖微生物制劑的生產(chǎn)工藝、質(zhì)量檢測(cè)與監(jiān)控力度有待加強(qiáng)。

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(編輯：陳希)

Molecular Identification of Strains Isolated from Composite Microbial Powders for Aquaculture

GUO Wan-ping, ZHAO Jing*, LUAN Chun-yu, GUO Wan, QUAN Chun-shan

(CollegeofLifeScience,DalianMinzuUniversity,KeyLaboratoryofBiotechnologyandBioresourcesUtilization(DalianMinzuUniversity),MinistryofEducation,Dalian116600,China)

ZHAOJing,E-mail:zhaojing@dlnu.edu.cn

In order to identify microbial strains in two commercial composite microbial powders for aquaculture, plate separation method was used to isolate and purify the microorganisms, morphological characteristics was observed, 16S rDNA/26S rDNA gene sequences analysis was conducted and phylogenetic trees were constructed. Variation in microflora structure existed between two microbial powders. Five Bacillus strains and two yeast strains were identified in S1 powder, includingBacillussubtilis,BacilluslicheniformisorBacillussonorensis,ClavisporalusitaniaeandPichiakudriavzevii; ThreeBacillusstrains, oneActinomycetestrain, two yeast strains and threeEnterococcuswere identified in S2 powder, includingLysinibacillusxylanilyticus,Bacilluscirculans,BacilluslicheniformisorBacillussonorensis,Cellulosimicrobiumfunkei,Saccharomycescerevisiae,Pichiakudriavzevii,Enterococcusgallinarum,EnterococcusfaeciumorEnterococcuslactis. Determination of the microflora structure of composite microbial powders for aquaculture would provide theoretical basis for evaluation of safety and effectiveness of similar products.

aquaculture,composite microbial powder,microflora structure,identification,16S rDNA,26S rDNA

大連民族大學(xué)2016年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(G201612026012, XA201603072)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(DC201502020407) 作者簡(jiǎn)介： 郭婉萍，從事生物化工方向研究。

趙晶。E-mail: zhaojing@dlnu.edu.cn

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.6.02

2016-12-07

A

1002-1280 (2017) 06-0009-10

S942.3；Q939