萬學(xué)東 王 博 陳群力 李三強(qiáng) 席守民

(河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河南 洛陽 471003)

褪黑素對(duì)軟脂酸誘導(dǎo)L02細(xì)胞胰島素抵抗的防護(hù)作用及機(jī)制

萬學(xué)東 王 博1陳群力 李三強(qiáng) 席守民

(河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河南 洛陽 471003)

目的 探討褪黑素(MT)對(duì)軟脂酸(PA)誘導(dǎo)L02細(xì)胞胰島素抵抗的防護(hù)作用及機(jī)制。方法 培養(yǎng)L02細(xì)胞，分別設(shè)立對(duì)照組(BSA組)、PA組、PA+MT組、PA+維生素C(VitC)組。各組藥物濃度和孵育時(shí)間根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需要來確定。用熒光比色法測定各組細(xì)胞胞內(nèi)氧自由基(ROS)水平，Western印跡法檢測胰島素刺激后胞內(nèi)胰島素信號(hào)蛋白磷酸化水平，包括Y-p-胰島素受體(IR)、Y-p-胰島素受體底物(IRS)1/2以及應(yīng)激敏感激酶p-JNK水平。結(jié)果 用不同濃度的PA處理L02細(xì)胞24 h，細(xì)胞內(nèi)ROS生成量呈現(xiàn)明顯的濃度依賴關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；用0.3 mmol/L的PA處理L02細(xì)胞不同時(shí)間，細(xì)胞內(nèi)ROS生成量存在明顯的時(shí)間依賴關(guān)系，在24 h達(dá)到最高，并在36 h后仍維持較高水平(P<0.05)；與BSA組相比，PA組ROS含量明顯升高(P<0.05)PA+MT組ROS含量無明顯變化(P>0.05)；PA+MT組ROS生成量明顯低于PA組(P<0.05)。PA+VitC組與PA組相比，ROS的生成量減少，但仍高于PA+MT組(P<0.05)。與BSA組相比，PA組Y-p-IR、Y-p-IRS1/2磷酸化水平減少，而p-JNK磷酸化水平升高；與PA組相比，PA+MT組Y-p-IR、Y-p-IRS1/2磷酸化水平顯著升高，p-JNK磷酸化水平明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 PA導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS增加，MT能夠清除PA產(chǎn)生的過量ROS。MT通過減少JNK的活化，改善因ROS引起的胰島素信號(hào)傳遞損傷，對(duì)PA誘導(dǎo)的胰島素抵抗具有防護(hù)作用。

胰島素抵抗；活性氧ROS；褪黑素；胰島素受體；胰島素受體底物1/2；c-Jun 氨基末端激酶JNK

胰島素抵抗是2型糖尿病(T2DM)的基本病理生理現(xiàn)象之一，并貫穿其發(fā)生發(fā)展的始終。血清游離脂肪酸(FFA)水平升高，在胰島素抵抗早期已經(jīng)發(fā)揮作用，是導(dǎo)致胰島素抵抗的重要的危險(xiǎn)因素之一，也是糖尿病脂毒學(xué)說的重要內(nèi)容〔1〕。氧化應(yīng)激作為一種重要的病理生理過程，參與了胰島素抵抗的形成，同時(shí)也是糖尿病各種慢性并發(fā)癥的共同基礎(chǔ)〔2〕。褪黑素(MT)是由松果體分泌的一種神經(jīng)激素，可以通過各種膜結(jié)構(gòu)進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮強(qiáng)大的抗氧化、抗自由基功能〔3〕。本研究觀察并分析MT對(duì)人胚胎干細(xì)胞L02細(xì)胞形成胰島素抵抗的防護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 PA、MT、2＇，7＇-二氯氫化熒光素二酯(DCFH-DA)、無血清白蛋白(BSA)等購自Sigma公司(USA)；胎牛血清(浙江三利公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco，USA)；磷酸化JNK(Thr183/Tyr185)和β-actin鼠多克隆抗體、磷酸化胰島素受體(IR)(Tyr1162/1163)兔多克隆抗體、磷酸化IR底物(S)1/2(Tyr612) 兔多克隆抗體購自Santa Cruz公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將L02細(xì)胞接種于含10%滅活胎牛血清的新鮮RPMI-1640培養(yǎng)液中，置37℃、飽和濕度5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。當(dāng)細(xì)胞80%長滿或接近匯合成片時(shí)則進(jìn)行傳代。吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞一次，然后加入胰蛋白酶溶液少許進(jìn)行消化，以能覆滿瓶底為限。在室溫中，于倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，立即終止消化。吸除消化液，加入培養(yǎng)液，用吸管吸取培養(yǎng)液輕輕反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液分為三等份裝入三個(gè)培養(yǎng)瓶中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞分組與處理 所有實(shí)驗(yàn)均采用處在對(duì)數(shù)生長期的L02細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將已傳代培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)2 d左右時(shí)間，吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞3次。對(duì)照組(BSA組)換含相應(yīng)濃度的BSA的無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，PA組換含實(shí)驗(yàn)濃度的PA的無血清RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，PA+MT組換含10 μmol/L MT和0.3 mmol/L PA的無血清RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，PA+維生素VitC)組換含1 mmol/L VitC和0.3 mmol/L PA的無血清RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要。

1.4 細(xì)胞中活性氧自由基(ROS)的測定 根據(jù)實(shí)驗(yàn)處理L02細(xì)胞后，加入終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA熒光探針，37℃孵育20 min以后收集細(xì)胞至離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入PBS吹散細(xì)胞，重復(fù)洗2遍，棄去未反應(yīng)的DCFH-DA。每管沉淀內(nèi)加入300 μl PBS吹散細(xì)胞，避光。用熒光分光光度計(jì)檢測細(xì)胞內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm，細(xì)胞進(jìn)行蛋白定量。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)DCF的熒光強(qiáng)度，可反映出細(xì)胞內(nèi)ROS的濃度。

1.5 Western 印跡檢測信號(hào)蛋白磷酸化水平 L02細(xì)胞分3組(BSA對(duì)照組，0.3 mmol/L PA處理組，0.3 mmol PA+10 μmol/L MT處理組)培養(yǎng)24 h。各組細(xì)胞棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷PBS洗滌3次。各組細(xì)胞換以含10-6mol/L胰島素的新鮮無血清RPMI-1640培養(yǎng)液，溫育15 min。收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液冰上作用20 min。超聲破碎，4℃、12 000 r/min離心25 min。取上清液用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)與等體積的5倍上樣電泳緩沖液混合，煮沸5 min。調(diào)整蛋白質(zhì)含量為60 μg/孔上樣進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳，于4℃下300 mA電轉(zhuǎn)印1 h至硝酸纖維素膜，加入3%BSA封閉液，4℃封閉過夜。棄去封閉液，加入用3% BSA，按1∶500稀釋的一抗，4℃封閉過夜。棄去雜交液，用含0.05%Tween-20的TBS-T洗液洗膜3次，加入3% BSA稀釋二抗(堿性磷酸酶標(biāo)記驢抗兔，稀釋度1∶1 000)，37℃孵育90 min。棄去雜交液，用含0.05%Tween-20的TBS-T洗液洗膜3次，將膜浸入NBT/BCIP顯色液中，室溫下放置20 min左右，待條帶顯色清楚后用水沖洗，將條帶拍照掃描定量并進(jìn)行圖像分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 PA影響L02細(xì)胞胞內(nèi)ROS含量的劑量變化關(guān)系 用不同濃度(0、0.1、0.3、0.5 mmol/L)的飽和脂肪酸PA處理L02細(xì)胞24 h，測定細(xì)胞內(nèi)的ROS含量，分別為(20.5±2.33)、(29.3±3.37)、(42.8±4.15)、(46.1±4.37)相對(duì)熒光度/mg蛋白。ROS含量呈現(xiàn)明顯的濃度依賴關(guān)系(P<0.05)。

2.2 PA影響L02細(xì)胞胞內(nèi)ROS含量的時(shí)間變化關(guān)系 用0.3 mmol/L的PA處理L02細(xì)胞不同時(shí)間(0、2、6、12、24、36 h)，結(jié)果顯示ROS含量存在明顯的時(shí)間依賴關(guān)系〔分別為(20.7±2.34)、(18.8±2.25)、(23.3±2.79)、(29.6±3.14)、(41.5±4.63)、(34.6±4.17)相對(duì)熒光度/mg蛋白〕，在24 h達(dá)到最高，并在36 h后仍維持較高水平(P<0.05)。

2.3 MT和Vit C對(duì)L02細(xì)胞胞內(nèi)ROS含量的影響 與BSA組(21.34±2.41 相對(duì)熒光度/mg 蛋白)相比，PA組(46.62±4.54相對(duì)熒光度/mg 蛋白)的ROS含量明顯升高(P<0.05)；PA+MT組(21.34±2.41相對(duì)熒光度/mg 蛋白)ROS含量明顯低于PA組(P<0.05)；PA+MT組與BSA組相比，ROS含量沒有顯著差異(P>0.05)；PA+VitC組(34.16±3.82相對(duì)熒光度/mg 蛋白)與PA組相比，ROS的含量減少，但仍高于PA+MT組(P<0.05)，表明MT比VitC有更強(qiáng)的清除ROS能力。

2.4 PA和MT處理對(duì)L02細(xì)胞內(nèi)胰島素通路中信號(hào)蛋白磷酸化水平的影響 PA組與BSA組相比，Y-p-IR(灰度值0.63±0.12 vs 1.00±0.20，P<0.05)和Y-p-IRS1/2磷酸化水平減少(灰度值0.71±0.15 vs 1.00±0.19，P<0.05)；PA+MT組與PA組相比，Y-p-IR和Y-p-IRS1/2磷酸化水平升高(灰度值0.85±0.16，灰度值0.94±0.16 vs 0.71±0.15，均P<0.05)。見圖1。

2.5 PA和MT處理對(duì)L02細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶JNK磷酸化水平的影響 PA組與BSA組相比，p-JNK磷酸化水平升高(灰度值1.46±0.28 vs 1.00±0.18，P<0.05)；PA+MT組與PA組相比，p-JNK磷酸化水平減少(灰度值1.16±0.21，P<0.05)。見圖1。

圖1 Western印跡檢測L02細(xì)胞信號(hào)蛋白和激酶的磷酸化水平

3 討 論

研究表明，血漿中FFA濃度增高是引起胰島素抵抗和T2DM的重要危險(xiǎn)因素之一〔4，5〕。高FFA能夠通過線粒體解耦聯(lián)、β氧化、氨基己糖途徑的激活引起線粒體活性氧ROS的形成〔6〕。研究證實(shí)，ROS是機(jī)體多種因素誘導(dǎo)胰島素抵抗的共同途徑，在胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔7〕。本研究發(fā)現(xiàn)，用不同濃度的飽和脂肪酸PA孵育L02細(xì)胞24 h，細(xì)胞內(nèi)的ROS含量明顯升高，呈濃度依賴性，這種現(xiàn)象與Frankie等〔8〕在血管內(nèi)皮細(xì)胞中和Duvala等〔9〕在肌細(xì)胞中觀察的結(jié)果一致。ROS的生成量還與FFA孵育時(shí)間有關(guān)，隨著孵育時(shí)間的延長，細(xì)胞內(nèi)ROS水平逐漸增高，在24 h達(dá)到高峰，并且在36 h仍維持在高水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高濃度的FFA能夠在L02細(xì)胞中誘導(dǎo)ROS的生成，過量的ROS可破壞細(xì)胞的抗氧化防御體系，使細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，從而造成細(xì)胞損傷，這也是過量FFA脂毒性的重要內(nèi)容。MT具有復(fù)雜而廣泛的生理藥理作用，它能維持晝夜節(jié)律、促進(jìn)睡眠，能增強(qiáng)人體免疫功能，對(duì)生長發(fā)育、性功能、內(nèi)分泌和胞內(nèi)信號(hào)也具有調(diào)節(jié)功能〔10〕。很早的研究發(fā)現(xiàn)〔11〕，MT具有強(qiáng)大的抗氧化作用，是目前已知的體內(nèi)抗氧化作用最強(qiáng)的自由基清除劑。本研究顯示，補(bǔ)充抗氧化劑能明顯減少高M(jìn)T導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)ROS升高，其中MT清除ROS能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于抗氧化劑VitC，使細(xì)胞中PA產(chǎn)生的高濃度ROS恢復(fù)到正常水平，本研究結(jié)果在L02細(xì)胞中進(jìn)一步證實(shí)了MT強(qiáng)大的抗氧化清除自由基ROS能力。

在肝細(xì)胞，胰島素與IR的α亞基結(jié)合后，引起受體β亞基的酪氨酸殘基自身磷酸化，通過激活I(lǐng)R胞質(zhì)段酪氨酸激酶識(shí)別募集IRS家族的各個(gè)成員，將IRS蛋白多個(gè)位點(diǎn)酪氨酸殘基磷酸化，后者再與含有SH2結(jié)構(gòu)域的多種蛋白結(jié)合，通過RAS/MAPK、PI3K/PKB和PKC等途徑傳導(dǎo)從而調(diào)節(jié)肝細(xì)胞蛋白質(zhì)合成、脂質(zhì)代謝、糖代謝、細(xì)胞生長和分化等。在胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的諸多環(huán)節(jié)中任何部分的異常，均會(huì)造成胰島素受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷，可能導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生〔12〕。研究表明，肥胖伴胰島素抵抗和T2DM患者的多種組織細(xì)胞IR的酪氨酸激酶活性是降低的。在內(nèi)皮細(xì)胞中，高濃度FFA可以通過抑制PKB等信號(hào)通路影響胰島素的信號(hào)傳導(dǎo)〔13〕，而在高脂喂養(yǎng)及ob/ob肥胖大鼠中發(fā)現(xiàn)，肌肉的胰島素抵抗與IRS的缺陷密切相關(guān)〔14〕。

應(yīng)激敏感激酶c-Jun氨基末端激酶(JNK)在細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)及多種疾病的發(fā)生與發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。JNK對(duì)細(xì)胞內(nèi)的ROS非常敏感，ROS升高引起的氧化應(yīng)激能夠激活JNK，活化應(yīng)激敏感信號(hào)通路，作用于不同的組織器官，能最終導(dǎo)致胰島素抵抗、β細(xì)胞功能紊亂、糖尿病并發(fā)癥的出現(xiàn)〔15〕。JNK屬于絲/蘇氨酸磷酸化激酶，可使IRS絲氨酸磷酸化，阻礙正常的酪氨酸磷酸化，導(dǎo)致正常的酪氨酸磷酸化受抑制，影響胰島素受體與IRS的結(jié)合，最終減弱IRS介導(dǎo)的胰島素信號(hào)傳遞，導(dǎo)致胰島素抵抗。Nguyen等〔16〕和Solinas等〔17〕分別在脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞中證實(shí)，JNK能被FFA激活，活化的JNK是FFA誘導(dǎo)細(xì)胞胰島素抵抗的主要中介體，而使用JNK的肽抑制劑或敲除JNK基因阻止IRS1的Ser307的磷酸化，增強(qiáng)胰島素信號(hào)傳遞，改善了胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)〔18，19〕。

本研究提示胰島素信號(hào)傳導(dǎo)在上游已經(jīng)受損，因IR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷是胰島素抵抗發(fā)生的主要原因，這也表明L02細(xì)胞已經(jīng)出現(xiàn)了胰島素抵抗。ROS引起的氧化應(yīng)激減少后，JNK的活化作用減弱，同時(shí)，胰島素信號(hào)傳遞功能卻得到增強(qiáng)，胰島素信號(hào)上游的多處受損的信號(hào)分子如IR、IRS酪氨酸磷酸化水平升高，活性部分增強(qiáng)，這標(biāo)志胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能得到改善，因此，MT對(duì)PA誘導(dǎo)的干細(xì)胞胰島素抵抗具有有效的防護(hù)作用。

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〔2016-01-24修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

河南科技大學(xué)創(chuàng)新能力培育基金(No.2012ZCX024)

席守民(1968-)，男，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事疾病及藥物的分子基礎(chǔ)研究。

萬學(xué)東(1966-)，男，博士，副教授，主要從事信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與疾病的研究。

R961

A

1005-9202(2017)13-3183-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.026

1 天津市東麗區(qū)中醫(yī)醫(yī)院外科