劉 燁 馬曉燕

（遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110032）

·研究報告·

腎衰飲對慢性腎功能衰竭大鼠ATF6/CHOP通路的作用研究*

劉 燁 馬曉燕△

（遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110032）

目的 觀察腎衰飲對慢性腎功能衰竭大鼠腎臟ATF6/CHOP通路的影響，探析腎衰飲延緩慢性腎功能衰竭的作用機制。方法 52只SD大鼠，按體質(zhì)量分層隨機抽取10只為正常組，其他大鼠采用腺嘌呤灌胃法模型3周。造模成功后隨機分為模型組、腎衰飲組和尿毒清組。腎衰飲組和尿毒清組分別給予腎衰飲煎劑和尿毒清顆粒連續(xù)灌胃4周。全自動生化分析儀檢測血肌酐、尿素氮含量，HE染色觀察各組大鼠腎組織病理變化，Western Blot技術檢測大鼠腎臟ATF6、CHOP、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達情況。結果 與正常組比較，模型組Scr、BUN水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，腎衰飲組和尿毒清組大鼠Scr、BUN水平均顯著降低（P＜0.01）。HE染色提示：腎衰飲及尿毒清能夠改善模型組大鼠腎臟病理學改變。Western Blot結果提示：與正常組比較，模型組大鼠腎臟ATF6、CHOP、Caspase-3蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），Bcl-2/Bax水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，腎衰飲組大鼠ATF6、CHOP、Caspase-3蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），Bcl-2/Bax水平顯著升高（P＜0.01）。結論 腎衰飲可能通過影響ATF6/CHOP通路，減少腎組織細胞凋亡，保護受損腎臟功能。

慢性腎功能衰竭 腎衰飲 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激 ATF6 CHOP 凋亡

【Key words】Chronic renal insufficiency；Shenshuaiyin Decoction；Endoplasmic reticulum stress；ATF6；CHOP；Apoptosis

隨著我國人口平均年齡的增加及老齡化的到來，慢性腎功能衰竭（CRF）嚴重威脅著人們健康和生活質(zhì)量。CRF是各種慢性腎臟疾病發(fā)展的最終階段。對于患者而言，本病治療將進行腎移植或終生接受透析，價格昂貴，且不適用于疾病的早、中期階段。因此，積極防治慢性腎臟疾病，延緩腎功能衰竭進程具有重要意義。

腎間質(zhì)纖維化是各種腎臟疾病發(fā)展到終末期的共同途徑和主要病理基礎，炎癥和凋亡是其重要的病理變化［1-2］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（ERS）是啟動炎癥反應和細胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，腎臟細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達，具有發(fā)生ERS的條件和基礎。對ERS進行干預調(diào)節(jié)，對于挽救殘存的腎臟細胞，保護腎臟功能具有重要影響。

課題組前期實驗研究證實，腎衰飲能夠減輕腎組織損傷，改善腎功能［3-4］，但對于其作用機制的探究尚不全面。本實驗以腎衰大鼠為實驗對象，以ERS為切入點，探究腎衰飲對腎衰竭大鼠腎臟功能的保護作用，為闡明腎衰飲防治腎衰的作用及機制提供實驗依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康SD雄性大鼠52只，體質(zhì)量（180±20）g，購買于遼寧長生生物技術有限公司，許可證號：SCXK（遼）2010-0001。飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心，自由攝食與飲水。溫度（22±1）℃，濕度（50±5）%。適應性飼養(yǎng)7 d。

1.2 試藥與儀器 腺嘌呤25 g/瓶（Amresco，美國）；尿毒清5 g/袋（廣州康臣藥業(yè)有限公司）；腎衰飲購自遼寧省中醫(yī)院中藥局（組成：黃芪40 g，太子參20 g，水紅花子15 g，夏枯草20 g，砂仁10 g，白術15 g，菟絲子15 g，土茯苓30 g，白茅根30 g，藿香15 g，大黃10 g，法半夏10 g，丹參15 g，水蛭5 g，莪術10 g，鱉甲20 g。遼寧省中醫(yī)院中藥局）；肌酐（Scr）測定試劑盒（貨號：C013-2。南京建成生物工程研究所）；尿素氮（BUN）測定試劑盒 （貨號：C011-2，南京建成生物工程研究所）；ATF6抗體（貨號：bs1287R。中國博奧森）、CHOP抗體（貨號：2958。美國CST）、Bcl-2抗體 （貨號：bs-20163R。中國博奧森）、Bax（貨號：bs-0127M。中國博奧森）、Caspase-3抗體 （貨號：9662。美國CST）；β-actin（貨號：J2114。美國santa）羊抗兔過氧化物酶標記IgG（貨號：CW0103。中國康維）、羊抗小鼠過氧化物酶標記IgG（貨號：CW0102。中國康維）。儀器設備：TriStar2 LB 942型多功能酶標儀（伯托公司，德國），組織破碎機（德國，IKA），低速冷凍離心機（Thermo，美國），干式恒溫器酶標儀Multiskan FC型（Thermo，美國），垂直板電泳裝置（Bio-Rad，美國），Trans-Blot SD半干轉?。˙io-Rad，美國）。

1.3 分組與造模 按體質(zhì)量分層隨機抽取10只為正常組，剩余42只大鼠進行造模：腺嘌呤懸濁液200 mg/（kg·d）連續(xù)灌胃3周［5］［正常組予8 mL/（kg·d）0.9%氯化鈉溶液灌胃］。第4周時模型組隨機抓取6只大鼠，正常組取2只進行腎功能檢測及腎臟病理觀察。造模成功后，將所有造模大鼠隨機分為模型組、腎衰飲組與尿毒清組，各12只。尿毒清組予尿毒清顆粒2.25 g/kg灌胃治療；腎衰飲組大鼠給予毫升藥液含生藥量為3.36 g的腎衰飲煎劑33.3 g/kg灌胃治療；模型組和正常組予0.9%氯化鈉溶液8 mL/kg灌胃。連續(xù)給藥4周后，所有大鼠取材，進行各指標監(jiān)測。造模及治療期間大鼠死亡情況：模型組3只，尿毒清組2只，腎衰飲組2只。死亡原因考慮為灌胃手法不當，灌胃液體誤入氣管所致。

1.4 標本采集與檢測 腎功能檢測采用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清Scr及BUN含量比較。形態(tài)學檢測腎組織逐步進行4%多聚甲醛固定、乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、厚度為4～5 μm切片。切片進行HE染色，最后用光學顯微鏡觀察各組腎臟組織的病理變化并拍照。Western blot檢測，稱量0.1 g腎臟組織，加1 mL裂解液研磨提，勻漿液1200 r/min 10 min，4℃離心取上清。采用BCA法檢測蛋白濃度，蛋白100℃變性5 min，每孔60 μg蛋白電泳，經(jīng)轉膜、封閉后，一抗孵育 ATF6（1∶300）、CHOP（1∶1000）、Bcl-2（1∶1000）、Bax（1∶1000）、Caspase-3（1∶1000）、β-actin（1∶800）室溫孵育1 h后4℃過夜，次日二抗孵育1 h后加ECL發(fā)光液曝光，目的蛋白分別與β-actin條帶的光密度比值后，再各組比較。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料以 （±s）表示，采用單因素方差分析結合Turkeys test比較各組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠血清Scr、BUN水平的比較 見表1。與正常組比較，模型組Scr、BUN含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，腎衰飲組及尿毒清組Scr、BUN含量顯著降低（P＜0.01），且腎衰飲組下調(diào)更明顯。

表1 各組大鼠血清Scr、BUN含量比較（±s）

表1 各組大鼠血清Scr、BUN含量比較（±s）

與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 n 肌酐（μmol/L） 尿素氮（mmol/L）正常組 8 40.75±7.00 3.82±1.4模型組 9 84.15±10.93**10.00±1.69**腎衰飲組 10 54.85±4.74△△7.17±1.23△△尿毒清組 10 59.03±4.75△△8.02±1.17△△

2.2 各組大鼠腎臟組織形態(tài)學變化 見圖1。正常組大鼠腎臟形態(tài)正常，無炎性細胞浸潤。與正常組相比，模型組腎臟皮質(zhì)，腎小球結構形態(tài)大小異常，血管球萎縮腎球囊變大比例失調(diào)，腎小管變性壞死、萎縮，大量炎性細胞浸潤。腎衰飲組與尿毒清組對模型均有一定的改善作用，尿毒清組腎小球結構形態(tài)大小接近正常，血管球充盈，腎球囊腔大小比例基本正常，腎小管的管壁薄均勻管腔大小正常，腫脹有所減輕，少量炎性細胞浸潤；腎衰飲組腎小球結構形態(tài)大小接近正常，血管球充盈，腎球囊腔比例基本正常，腎小管的管壁薄厚管腔大小基本正常，腫脹基本消失，偶見少量炎性細胞浸潤。

圖1 各組大鼠腎臟組織（HE染色，200倍）

2.3 各組大鼠腎臟組織ATF6/CHOP通路蛋白表達水平比較 見表2。與正常組比較，模型組大鼠腎臟ATF6、CHOP、Caspase-3蛋白表達水平顯著升高 （P＜0.01），Bcl-2/Bax水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，腎衰飲組大鼠ATF6、CHOP、Caspase-3蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），Bcl-2/Bax水平顯著升高（P＜0.01）；尿毒清組ATF6、CHOP、Caspase-3蛋白表達水平顯著降低 （P＜0.01），Bcl-2/Bax水平顯著升高（P＜0.01）。

表2 大鼠腎臟ATF6/CHOP通路蛋白表達水平比較（±s）

表2 大鼠腎臟ATF6/CHOP通路蛋白表達水平比較（±s）

組別 n ATF6CHOP Bcl-2/Bax Caspase-3正常組 8 0.502±0.033模型組 9 0.626±0.016**腎衰飲組 10 0.519±0.049△△0.663±0.073 1.112±0.069**0.716±0.084△△0.00224±0.00018 0.543±0.015 0.00079±0.00008**0.899±0.086**0.00166±0.00025△△0.763±0.019△尿毒清組 10 0.544±0.028△△0.496±0.033△△0.00242±0.00041△△0.656±0.059△△

3 討 論

CRF是各種慢性腎臟疾病腎功能惡化的結果，嚴重影響著人民的生活質(zhì)量。中醫(yī)學對于CRF早中期的治療有著獨特的優(yōu)勢。筆者以中醫(yī)理論為依據(jù)，對CRF發(fā)病機制深入研究，認為內(nèi)生之毒是導致CRF的關鍵［6］，并提出以“補腎健脾，祛濕化濁、滌痰活血、清熱解毒”的治療原則［7］，自擬經(jīng)驗方腎衰飲，攻補兼施，集抗毒、解毒、排毒三法于一方，多途徑祛毒外出，同時，祛邪不忘扶正，重視調(diào)理脾胃升降［8］。一些前期實驗研究已經(jīng)證實，腎衰飲對減少蛋白尿，抑制腎纖維化的發(fā)生、發(fā)展具有很好的效果。

本實驗研究實驗發(fā)現(xiàn)，腎衰飲能夠降低CRF大鼠血清中Scr和BUN水平，改善模型組大鼠腎臟組織的病理狀態(tài)，對受損的腎臟組織功能起到了保護作用。Western Blot結果提示腎衰飲對CRF大鼠腎臟的保護作用可能是通過減輕腎組織ERS，減少腎臟細胞凋亡實現(xiàn)的。

腎小管上皮細胞過度凋亡可能是腎功能惡化的重要機制之一［9］。ERS是近年來發(fā)現(xiàn)的一種啟動凋亡的新途徑，ERS是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能紊亂時出現(xiàn)的一種亞細胞病理狀態(tài)，持續(xù)過度的ERS會引起細胞的凋亡［10］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是新生蛋白折疊的地方，只有正常折疊的蛋白才能夠運送至高爾基體，當外界環(huán)境發(fā)生改變，出現(xiàn)炎癥、氧化應激等刺激時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，未折疊蛋白就會在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積聚并引發(fā)未折疊蛋白反應（UPR），細胞啟動UPR恢復內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，從而保護發(fā)生ERS的細胞［11］。ERS發(fā)生時，UPR可激活3種轉錄因子，ATF6是其中之一。ERS發(fā)生時，ATF6會從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉位到高爾基體中被激活，轉而進入細胞核，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激元件結合后誘導應激反應基因的表達［12］。本文研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠ATF6蛋白表達顯著升高，說明CRF大鼠存在ERS，腎衰飲能夠下調(diào)模型組高表達的ATF6，說明腎衰飲可能通過該途徑減輕CRF大鼠腎臟ERS。

當ERS持續(xù)存在時，活化的ATF6能夠誘導CHOP［13］。CHOP又稱生長停滯及DNA損傷誘導蛋白153［14］。在正常情況下，CHOP主要存在于細胞漿中且表達量很低［15］，而細胞處于應激狀態(tài)時，ATF6可以上調(diào)CHOP表達，CHOP的主要作用是在UPR過程中通過編碼蛋白質(zhì)促進細胞凋亡［16］。在我們實驗研究中發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腎臟組織中CHOP蛋白高表達，且凋亡相關蛋白Caspase-3表達升高，Bcl-2/Bax比值降低，說明CHOP可能激活Caspase級聯(lián)反應誘導細胞凋亡，同時降低Bcl-2的表達，下調(diào)了細胞的抗凋亡能力。與模型組相比較，腎衰飲組CHOP與Caspase-3蛋白表達顯著下降，Bcl-2/Bax比值升高，提示我們腎衰飲可能通過ATF6/CHOP途徑減輕ERS反應，減少腎臟細胞凋亡。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，腎衰飲能夠延緩CRF大鼠腎臟病理形態(tài)學進展，改善受損腎功能，其機制可能是通過影響ATF6/CHOP途徑實現(xiàn)的。

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Effects of Shenshuaiyin Decoction on ATF6/CHOP Pathway in Kidney Tissues of Chronic Renal FailureRats

LIU Ye，MA Xiaoyan. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning，Shenyang 110032，China.

Objective：To discuss the pharmacology mechanism of Shenshuaiyin Decoction delaying the kidney failure by observing the effect of Shenshuaiyin Decoction on ATF6/CHOP pathway in kidney tissues of chronic renal failure rats.Methods：From 52 SD rats，8 rats were randomly selected as the normal group.The other rats were taken as renal failure models by adenine gavage method for 3 weeks.After successful modeling，the modeled rats were randomly divided into model group，Shenshuaiyin Decoction group and Niaoduqing group.The Shenshuaiyin Decoction group and Niaoduqing group rats were given Shenshuaiyin Decoction and Niaoduqing gavage for 4 weeks.SCr and BUN were tested using the automatic biochemical analyzer.The renal pathological changes in rats of each group were observed by HE staining method.ATF6，CHOP，Bcl-2，Bax and Caspase-3 protein expression were tested with Western blot methods.Results：Compared with the normal group，the Scr and BUN level in the model group increased significantly（P＜0.01）.Compared with the model group，the Scr and BUN level in Shenshuaiyin Decoction group and Niaoduqing group decreased significantly（P＜0.01）.HE staining results showed that Shenshuaiyin Decoction and Niaoduqing could improve the renal pathological changes in rats of the model group.Western blot results showed that compared with the normal group，the expression level of ATF6，CHOP，Caspase3 increased significantly（P＜0.01）and the expression levels of Bcl-2/Bax decreased significantly（P＜0.01）in the model group.Compared with the model group，the expression level of ATF6，CHOP，Caspase-3 decreased significantly（P＜0.05 or P＜0.01）and the expression levels of Bcl-2/Bax increased significantly（P＜0.01）in Shenshuaiyin Decoction group.Conclusion：Shenshuaiyin Decoction plays an important biological role in reducing renal tissue cell apoptosis and improving the impaired renal function via regulating ATF6/CHOP pathway of chronic renal failure rats.

R285.5

A

1004-745X（2017）05-0768-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.05.005

2017-02-24）

國家自然科學基金青年基金項目（81373527）；沈陽科學技術計劃項目（F13-220-9-18）

△通信作者（電子郵箱：aaaxyma@hotmail.com）