趙曉誠(chéng)，黨瑞華，黃永震，藍(lán)賢勇，宋恩亮，陳 宏，左自意,雷初朝﹡

(1．西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東 濟(jì)南 250100;3.陜西意發(fā)生態(tài)農(nóng)牧發(fā)展有限公司,陜西 山陽(yáng) 726499)

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科學(xué)試驗(yàn)

嶺南牛mtDNA D-loop區(qū)遺傳多樣性研究

趙曉誠(chéng)1，黨瑞華1，黃永震1，藍(lán)賢勇1，宋恩亮2，陳 宏1，左自意3,雷初朝1﹡

(1．西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東 濟(jì)南 250100;3.陜西意發(fā)生態(tài)農(nóng)牧發(fā)展有限公司,陜西 山陽(yáng) 726499)

[目的] 通過(guò)測(cè)定嶺南牛線粒體D-loop全序列來(lái)了解嶺南牛的母系起源及遺傳多樣性。[方法] 采用PCR擴(kuò)增、測(cè)序及生物信息學(xué)方法。[結(jié)果] 通過(guò)對(duì)30頭嶺南牛mtDNA D-loop序列分析，共發(fā)現(xiàn)62個(gè)變異位點(diǎn)和19種單倍型，核苷酸多樣度(Pi)為0.0260，單倍型多樣度(Hd)為0.8920，表明嶺南牛遺傳多樣性豐富。構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹表明嶺南牛有普通牛和瘤牛2種母系起源。[結(jié)論] 嶺南牛屬于南方牛類型，受瘤牛的影響較大，具有瘤牛和普通牛的種質(zhì)特征。

嶺南牛；mtDNA D-loop；遺傳多樣性；母系起源

我國(guó)黃牛是指除牦牛和水牛以外的所有家牛的統(tǒng)稱。中國(guó)是世界上黃牛品種資源最豐富的國(guó)家之一。按地域?qū)⒅袊?guó)黃牛分為北方黃牛、中原黃牛和南方黃牛三種類型[1]。關(guān)于中國(guó)黃牛的起源，歷來(lái)有不同的觀點(diǎn)。國(guó)內(nèi)學(xué)者在我國(guó)黃牛Y染色體分子遺傳多態(tài)性[2,3]、血液蛋白多態(tài)性[4]及線粒體DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(mtDNA RFLP)[5]等多個(gè)層面做了大量研究，結(jié)果均支持我國(guó)黃牛為多元起源的觀點(diǎn)。北方黃牛大多屬于普通牛，而瘤牛主要影響南方黃牛，中原黃牛同時(shí)受普通牛和瘤牛的影響。

線粒體是動(dòng)物細(xì)胞中重要的細(xì)胞器之一，也是一種遺傳信息載體。哺乳動(dòng)物的線粒體DNA (mtDNA)位于細(xì)胞質(zhì)中，是一種共價(jià)閉合的環(huán)狀雙鏈DNA分子，其大小約為16. 5 kb。線粒體DNA的基因組織結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、穩(wěn)定，在世代間沒(méi)有基因重組，但其進(jìn)化速率卻比單拷貝核基因高5～10倍。線粒體DNA的遺傳過(guò)程嚴(yán)格遵守單性母性遺傳，即僅從卵子的細(xì)胞質(zhì)中遺傳到下一代，不受國(guó)外引進(jìn)公牛的影響，可以更好地反映家牛的母系起源[6-8]。而在mtDNA中，D-loop區(qū)的進(jìn)化速率又比其他區(qū)域高出5～10倍，是線粒體DNA中研究最多的標(biāo)記。雷初朝等[9]首次對(duì)我國(guó)8個(gè)黃牛品種的mtDNA D-loop 區(qū)全序列進(jìn)行了測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)中國(guó)黃牛主要為普通牛和瘤牛起源。Loftus 等[10]測(cè)定了6 個(gè)歐洲牛、3個(gè)印度牛、4 個(gè)非洲牛品種的D-loop 序列，發(fā)現(xiàn)家牛D-loop序列明顯分為瘤牛和普通牛兩種支系。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)在黃牛線粒體D-loop 區(qū)方面做了大量的研究，但關(guān)于嶺南牛的遺傳多樣性研究還未見報(bào)道。嶺南牛主產(chǎn)于陜西省商洛市秦巴山區(qū)的山陽(yáng)、鎮(zhèn)安、柞水等縣。1982年邱懷教授等專家赴產(chǎn)區(qū)進(jìn)行考察，將其命名為嶺南牛。嶺南牛具有適應(yīng)性強(qiáng)、挽力大、耐粗放、善爬坡、產(chǎn)肉性能好、繁殖力高等優(yōu)良品質(zhì)[11]。本研究主要通過(guò)測(cè)定嶺南牛線粒體D-loop全序列，以鑒定其母系起源及遺傳多樣度，為其保種和改良提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

在陜西省商洛市山陽(yáng)縣牛耳川鎮(zhèn)意發(fā)牛場(chǎng)采集30頭嶺南牛耳組織樣，用75%酒精保存，并存放至-20℃冰箱備用。

1.2 基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增與測(cè)序

采用酚-氯仿法提取基因組DNA。采用雷初朝等[9]設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增線粒體DNA D-loop全序列，正鏈引物和反鏈引物分別為：F：5′-CTGCAGTCTCACCATCAACC-3′; R：5′-GGGGTGTAGATGCTTGC-3′。PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，59℃退火60 s，72℃延伸90 s，共40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物采用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)其大小、純度及亮度，將檢測(cè)合格的PCR產(chǎn)物送至西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用DNASTAR程序包中的SeqMan程序?qū)?0條嶺南牛D-loop序列及從GenBank 引用的2 條非洲牛支系(L27733 , L27735 )進(jìn)行人工校正與序列比對(duì)。用DNASP 5.0統(tǒng)計(jì)核苷酸多態(tài)位點(diǎn)、單倍型數(shù)量、單倍型多樣度、核苷酸多樣度、平均核苷酸差異等。用MEGA7軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 嶺南牛mtDNA D-loop區(qū)核苷酸變異與單倍型多樣性

30頭嶺南牛mtDNA D - loop區(qū)全序列中，12頭黃牛D-loop區(qū)長(zhǎng)910 bp，17頭長(zhǎng)911 bp，僅有1頭長(zhǎng)度為912 bp，這些都是因?yàn)镈-loop區(qū)存在堿基插入與缺失。在30頭嶺南牛線粒體D - loop中共發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)62個(gè)，占核苷酸總數(shù)的6.81%；其中，4種堿基A、T 、C、G 的頻率分別為33%、28.4%、25.0%、13.6%，平均核苷酸差異K為23.6390，核苷酸多樣度(Pi)為0.0260。在62個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中，轉(zhuǎn)換59個(gè)(占95.2%)，其中35個(gè)C/T轉(zhuǎn)換，24個(gè)A/G轉(zhuǎn)換；顛換3個(gè)(占4.8%)，均為C/G顛換。利用DNASP 5.0分析比較，發(fā)現(xiàn)30頭嶺南牛mtDNA D-loop序列有19種單倍型，單倍型多樣度(Hd)為0.8920；其中13種為普通牛單倍型，有14個(gè)個(gè)體；6種為瘤牛單倍型，有16個(gè)個(gè)體。

圖1 嶺南黃牛19個(gè)mtDNA D-loop單倍型及其多態(tài)位點(diǎn)

圖2 嶺南牛19個(gè)mtDNA D-loop單倍型構(gòu)建的NJ系統(tǒng)樹

參考Loftus等[10]發(fā)表的瘤牛序列(No. L27733)定義變異類型。“.”代表與第一條序列相同。

2.2 嶺南牛的系統(tǒng)進(jìn)化樹

根據(jù)測(cè)序的30條嶺南牛mtDNA D-loop序列，定義了19種單倍型，從GeneBank 上下載普通黃牛序列L27735，瘤牛序列L27733作為對(duì)照，利用MEGA7.0軟件對(duì)嶺南牛19個(gè)單倍型構(gòu)建NJ進(jìn)化樹。從圖2中可以看出，該進(jìn)化樹共分為兩個(gè)支系，一支為瘤牛，一支為普通牛，說(shuō)明嶺南牛是普通牛和瘤牛的混合母系起源。

3 討論

近年來(lái)，D-loop區(qū)序列的核苷酸變異分析是動(dòng)物mtDNA研究最常用的標(biāo)記，國(guó)內(nèi)也做了很多相關(guān)研究，但是有關(guān)嶺南牛D-loop區(qū)遺傳變異的研究尚未見報(bào)道。本研究所檢測(cè)的30頭嶺南牛D-oop序列，有12頭序列長(zhǎng)度為910 bp，17頭長(zhǎng)911 bp，僅有1頭長(zhǎng)度為912 bp。這是由于mtDNA D-oop序列在762～769 bp之間為連續(xù)的堿基C，非常容易發(fā)生序列長(zhǎng)度的變異[12-14]。

核苷酸多樣度(Pi)是衡量群體遺傳變異程度的重要指標(biāo)。核苷酸多樣度(Pi)越高，則表明群體間遺傳變異越大。雷初朝等[9]分析中國(guó)8個(gè)黃牛品種mtDNA D-loop區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)其Pi值為0.0055～0.0539；蔡欣[13]發(fā)現(xiàn)中國(guó)17個(gè)黃牛品種的平均Pi值為0.0268。本研究發(fā)現(xiàn)嶺南牛的Pi值為0.0260，與蔡欣的結(jié)果基本一致，說(shuō)明嶺南牛的遺傳多樣性比較豐富。本研究發(fā)現(xiàn)嶺南牛的單倍型多樣度(Hd)為0.8920，僅比蔡欣[13]研究的中國(guó)17個(gè)黃牛品種的平均單倍型多樣度(0.9190)略低，表明嶺南牛群體遺傳變異程度相對(duì)較高，遺傳多樣性豐富，這可能與嶺南牛處于山區(qū)，與外界交流較少有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)嶺南牛19種單倍型中，有13種單倍型為普通牛，個(gè)體數(shù)為14頭；6種單倍型為瘤牛血統(tǒng)，個(gè)體數(shù)為16頭，表明嶺南牛受瘤牛影響更大一些，這與周艷等[14]對(duì)中國(guó)部分南方黃牛mtDNA D-loop區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)南方黃牛受瘤牛的影響更大的結(jié)論一致。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)嶺南牛mtDNA遺傳多樣性比較豐富，具有普通牛和瘤牛兩大母系起源，在遺傳血統(tǒng)上更偏向于瘤牛，且具有普通牛與瘤牛的種質(zhì)特征。

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Genetic Diversity of mtDNA D-loop Region in Lingnan Cattle

ZHAO Xiao-cheng1, DANG Rui-hua1, HUANG Yong-zhen1, LAN Xian-yong1, SONG En-liang2, CHEN Hong1, ZUO Zhi-yI3,LEI Chu-zhao1*
(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China; 2.InstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShandongAcademyofAgriculturalSciences,Jinan,Shandong, 250100,China;3.ShaanxiYifaEcologicalAnimalHusbandryDevelopingco.ltd,ShaanxiShanyang726499)

[Objective] The aim of the research was to study the maternal origin and genetic diversity of Lingnan cattle. [Method] The complete mtDNA D-loop regions of 30 Lingnan cattle were analyzed using PCR, sequencing and bioinformatics methods. [Result] The results showed that 62 variations were detected in the complete mtDNA D-loop regions of 30 Lingnan cattle, which defined 17 haplotypes. The nucleotide diversity (Pi) was 0.0260, and the haplotype diversity (Hd) was 0.8920, indicating an abundant genetic diversity in Lingnan cattle. The neighbor-joining tree showed that Lingnan cattle had two types of maternal origins from Bos taurus and Bos indicus. [Conclusion] Lingnan cattle, belonging to the southern cattle type in China, which was mainly affected by Bos indicus, had two types of maternal origins from Bos taurus and Bos indicus.

Lingnan cattle；mitochondrial DNA D-loop；genetic diversity；maternal origin

2017-02-12 接收日期:2017-02-20

國(guó)家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助(CARS-38)。

作者簡(jiǎn)介：趙曉誠(chéng)(1992-)，男，山西永濟(jì)人，碩士生，主要從事動(dòng)物遺傳資源研究。

*通訊作者：雷初朝(1968-)，男，湖南常寧人，教授，博導(dǎo)，主要從事牛遺傳資源研究。

S823.2

A

1001-9111(2017)02-0001-03