毛翔光，趙家才，楊彩云, 高玉瓊, 何永富，李 雯,張 潔

(云南省種畜繁育推廣中心，云南 昆明 650212)

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影響大額牛精液質量主要因素的研究

毛翔光，趙家才，楊彩云, 高玉瓊, 何永富，李 雯,張 潔

(云南省種畜繁育推廣中心，云南 昆明 650212)

[目的]大額牛為我國地方畜禽遺傳資源瀕危品種，為了加強大額牛的保種力度，提高保種效率；本研究對影響大額牛精液質量的主要因素如采精方法、季節(jié)、個體遺傳等進行了比較研究。[方法] 大額牛用電刺激法和假陰道法采精，按照牛冷凍精液國家標準GB4143-2008的方法測定大額牛的采精量，精子密度，原精活力和冷凍精液解凍活力, 用程控冷凍儀冷凍大額牛精液。[結果]大額牛冷凍精液解凍效果較好，采精量為5.009±2.239 m}(n=226)，原精活力為54.184±15.760%(n=223)，精子密度為7.207±6.387億/mL(n=225)，解凍活力為36.007±2.092%(n=136)。精子冷凍解凍復蘇率達50%以上。大額牛電刺激采精成功率高。[結論]遷地保護條件下大額牛電刺激法采精獲得很好效果，也能用假陰道法采精,精液冷凍解凍效果較好，有利于大額牛遺傳物質的保存。

大額牛；遷地保種；冷凍精液；瀕危；解凍；遺傳資源

大額牛在我國僅產于云南省貢山縣獨龍江一帶，是一種珍貴的畜類，其分類學地位屬于牛亞科黃牛屬(BOS)中獨立的一個種Bos Frontalis。大額牛成年體重：公牛平均400～500 kg、母牛平均350～400 kg，12月齡平均體重可達200 kg；大額牛性成熟較晚，在自然野生狀態(tài)下，一般約50月齡才能達到性成熟；染色體數(shù)目2n=58。貢山縣為獨龍族怒族聚居區(qū)，大額牛在當?shù)刂饕┤馐秤茫谝澳翖l件下具有良好的產肉性能，肉質優(yōu)良，是我國的一個珍稀牛種。大額牛產區(qū)由于地處我國西南邊陲的少數(shù)民族地區(qū)，自然條件惡劣，地理環(huán)境非常特殊，交通極其不便，大額牛的馴養(yǎng)還處于較原始的狀態(tài)，目前尚處于半野生半家養(yǎng)狀態(tài)[1]。因此，我們開展了大額牛的遷地保種,進行了大額牛微型細管冷凍精液的試驗研究，對影響大額牛精液質量的因素進行了分析研究。

1 材料和方法

1.1 大額牛牛的飼養(yǎng)管理

大額牛從其原產地怒江州貢山縣引進到云南省種畜繁育推廣中心冷凍精液站,飼養(yǎng)方式為人工舍飼，日糧為全混合飼料，夏秋補飼適量青飼料，供給清潔飲水,定期免疫和檢疫。

1.2 試驗牛精液的來源

供試大額牛精液來源于遷地保護依法引進的純種大額牛。經過簡單馴化調教后，用電刺激法和假陰道法采集大額牛精液進行冷凍精液制作。

1.3 大額牛的電刺激法采精[2]

把采精的大額牛由飼養(yǎng)員牽引到保定架內妥善保定，確保人、畜安全。采精前用0.05%～0.1%的高錳酸鉀溶液清洗大額牛包皮和外陰部，采精員和精液收集員站在大額牛的左、右側并由另一助理將電刺激采精器電極探頭插入采精公牛直腸，然后打開電源輸出按鈕，使用自動或手動脈沖刺激大額牛副性腺使其充分分泌和陰莖勃起，待大額牛副性腺分泌和陰莖勃起充分后，當開始排精時收集其精液。

1.4 大額牛的精液品質測定指標

大額牛采精后，分別測定其采精量，精子密度，精子活力和畸形率，精子畸形率用姬姆薩染色法染色后鏡檢，合格的鮮精用于制作冷凍精液。

1.5 大額牛冷凍精液的制作程序

大額牛精液的采集。采集大額牛的精液要注意保溫防塵，防輻射。大額牛精液品質檢驗：按照國家牛精液品質檢驗方法，測定大額牛的采精量、精子密度、精子活力等指標[3]。

大額牛精液的稀釋。經檢驗，原精活力達60%以上，鮮精密度達3.0億/mL以上，且無其他異常的原精在等溫下用備好的冷凍稀釋液進行稀釋[3]，每個劑量塑料細管中精子總數(shù)為2 000～2 300萬。

大額牛精液的平衡與分裝標記。稀釋后的大額牛精液在室溫下分裝分裝于塑料細管中，自動封口和打印標記信息，待精液溫度降至室溫時(約1～1.5 h)，然后置于+4℃的冰箱或低溫操作柜中降溫平衡2～4 h，然后在溫度為4℃下把大額牛細管精液整齊排放在冷凍架上，把需要冷凍的全部精液放入程控冷凍儀內進行冷凍，冷凍曲線為：精液從+4℃以5℃/min的速度降溫至-10℃，再由-10℃以40℃/min的速度降溫至-100℃，從-100℃以20℃/min的速度降溫至-140℃后取出冷凍后的全部精液放入液氮中，包裝與拇指管內，隨機抽樣解凍，檢查冷凍解凍后精子活力等指標，常規(guī)解凍精液的水浴溫度為37±2℃，顯微鏡載物臺溫度為37℃[4]，凍精解凍時間10 s，解凍活力達0.35以上者儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 數(shù)據(jù)來源和處理[4]

大額牛精液質量測定數(shù)據(jù)來源于1998年至2002年和2011年至2016年的采精記錄,用生物統(tǒng)計法進行統(tǒng)計分析和顯著性檢驗。

2 結果

大額牛用電刺激法采精，采精量為5.24±2.372 mL(n=148)，原精活力為56.36±14.314%(n=148)，精子密度為4.43±4.585億/mL(n=148)，解凍活力為35.95±1.975%(n=84)。大額牛采精成功率為98.67%(223/226)，電刺激采精可利用率為56.76%(84/148)；假陰道法采精采精量為4.38±1.645 (n=66)，原精活力為55.41±9.757(n=66)，精子密度為14.07±5.0635億/mL(n=66)，解凍活力為36.10±2.286%(n=52)，假陰道采精可利用率78.79%(52/66)。電刺激法采精和假陰道法采精可利用率差異極顯著(Uc=2.94>2.58,P<0.01),大額牛精液質量和方差分析結果見表1、表2、表3、表4、表5和表6。

2.1 不同個體大額牛精液質量

遷地引進的大額牛進行了采精，不同個體大額牛精液質量見表1。

2.2 不同年度大額牛精液品質

TL001連續(xù)五年采精，1998至2002年度精液質量見表2。

表1 不同大額牛個體精液品質比較

注：表1同一縱列數(shù)據(jù)中右上角標有不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，右上角標有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，右上角標有相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)；以下表2-6數(shù)據(jù)右上標字母與表1標示相同。

表2 TL001不同年度大額牛精液品質比較表

2.3 不同季節(jié)大額牛精液品質

不同季節(jié)大額牛精液質量見表3。

2.4 第一次采精和第二次采精大額牛精液質量

223號大額牛電刺激采精后，間隔40 min，再進行第二次電刺激采精，第一次和第二次電刺激采精精液質量見表4，第一次采精報廢率45.098%(23/51)極顯著高于第二次采精報廢率11.765%(6/51)(Uc=3.51>2.58，P<0.01)，詳見表4。

2.5 電刺激法采精和假陰道法采精大額牛精液質量

TL001先用電刺激法采精,經過誘導調教,能用假陰道法采精,詳見表5。

2.6 大額牛與云嶺牛、西門塔爾牛電刺激法采精精液質量

大額牛與其它品種牛電刺激法采精，精液質量見表6。

表3 不同季節(jié)大額牛精液品質比較表

表4 第一次采精和第二次采精大額牛精液質量比較表

表5 不同采精方法大額牛精液質量

表6 大額牛與云嶺牛、西門塔爾牛電刺激采精精液品質比較表 =

3 討論

3.1 大額牛遷地人工飼養(yǎng)條件下采精效果良好

大額牛用電刺激法進行采精，采精成功率高，利于收集精液，是一種行之有效的采精方法。大額牛精液的冷凍解凍效果較好，采精成功率較高，WL002公牛精液報廢率較高達100%，不能用于制作冷凍精液,主要原因是原精活力低，精子畸形率高，達不到生產冷凍精液的標準。

3.2 大額牛精液冷凍效果良好，制作流程合理

稀釋后的大額牛精液在室溫下分裝，精液分裝入塑料細管后增加了表面積，有利于精液均勻快速地降溫。大額牛精液鮮精活力達60%以上，鮮精密度達3.0億/mL以上，每個劑量塑料細管中精子總數(shù)為2 300萬左右，分裝后的大額牛精液置于+4℃的冰箱中降溫平衡3～4 h，平衡后的大額牛細管精液整齊排放在細管冷凍架上全部放入程控冷凍儀內由+4℃以5℃/min的速度降溫至-10℃，再由-10℃以40℃/min的速度降溫至-100℃，從-100℃以20℃/min的速度降溫至-140℃后取出凍精放入液氮中包裝，同時隨機抽樣解凍，檢查冷凍后精子活力等指標，解凍活力可達到35%以上，有效精子數(shù)達800萬個以上，符合國家牛冷凍精液標準的要求。大額牛冷凍精液人工授精受胎率與其它肉牛品種相近，后代長勢良好。大額牛冷凍精液解凍后立即輸精或解凍后1 h之內輸精，輸精效果并不會明顯下降，建議在使用冷凍精液輸精時，最好解凍后立即輸精，若不能及時輸精，解凍后精液的保存時間不要超過2 h為宜。

3.3 影響大額牛精液質量的主要因素

遺傳、飼養(yǎng)管理、季節(jié)、年齡、制作流程、個體、疾病、檢疫、免疫、冷凍稀釋液和生活環(huán)境等因素均能影響大額牛精液質量。科學的制作流程(特別是稀釋液)為影響大額牛精液冷凍效果的關鍵：大額牛精液平衡時間2～4 h，大口罐內冷凍6 min，程控儀冷凍7～8 min，即可獲得較好的冷凍解凍效果，精液冷凍時，由于精液溫度較高(+4℃)冷凍降溫時放熱，程控儀內液氮蒸氣溫吸熱，精液放出的熱量dis的閾值與精液的變態(tài)吸收熱量熵流des的絕對值相等符號相反[5～6]，程控儀內溫度下降曲線反彈升高達峰值，然后降溫曲線繼續(xù)下降，溫度降至-140℃以下時達到保存冷凍精液的安全溫度。精子在冷凍過程中由于過冷卻、冷休克、降溫過程的危險溫區(qū)，冷凍速度，冰晶的形成等因素對精子的危害在實際生產中難以完全克服，在冷凍精液解凍過程中也無法避免和克服溫度回升過程中危險溫度對精子的危害；不同大額牛個體的精液質量受遺傳、季節(jié)、年齡、飼養(yǎng)管理等因素的影響[7]，同時，還受生存環(huán)境、馴化程度、采精制度和方法等因素的影響，個體間精液質量差異明顯，WL002精子活力極差，畸形率高，TL001精子密度較高，但采精量卻較低；精液活力和采精量夏、秋季優(yōu)于冬春季；同一采精日，第二次電刺激采精效果好于第一次電刺激采精，原精活力和密度極顯著提高(P<0.01)；假陰道法采精精子密度極顯著高于電刺激法采精(P<0.01)，精子活力差異不明顯(P>0.05)大額牛電刺激法采精量和精子密度均極顯著低于西門塔爾牛和云嶺牛電刺激法采精量和精子密度，西門塔爾牛電刺激法采精量明顯增加，但精子密度較低，不同的采精操作人員熟練也會造成采精效果存在差別。本研究未考慮飼養(yǎng)管理、疾病、檢疫、免疫、生活環(huán)境等因素對大額牛的影響，今后有必要進行深入的探討。

總之，從目前的研究結果看，大額牛冷凍精液解凍活力較好，精子復蘇率比較高，受胎率比較理想，采精方法和采精技術已經成熟，冷凍精液制作工藝流程合理。大額牛為瀕危珍稀牛種，科學研究和保種工作刻不容緩，仍需不懈努力，繼續(xù)進行深入的實驗研究，提高大額牛保種的時效性和科學性。

[1] 趙家才，何華川，張翠蘭.大額牛冷凍精液技術的研究[J]. 黃牛雜志，2005,31(4):16-18.

[2] 趙家才，劉國璋.三種采精方法在種公牛上的應用效果分析[J]. 黃牛雜志，2001,27(1)：48-50.

[3] 劉海良.種公牛培育技術手冊,.41-49.-[4] 明道緒.生物統(tǒng)計附試驗設計 [M]. 北京：中國農業(yè)出版社，2004.78-80,84-87,92-108.

[5] 趙來珍，劉發(fā)理.牛冷凍精液精子復蘇規(guī)律及其機理[J] 黃牛雜志 1994,20(增刊)37.

[6] 鄧福金，吳慶榮，王化青.冷凍溫度對牛精子復蘇率及降溫速率變化規(guī)律的研究[J].中國牛業(yè)科學，2010,36(5)：27-29.

[7] 王力波,石惠芝.影響精子產量的因素[J].中國奶牛,1999,17(1):38-39.

The Study on the Main Factors of Semen Quality of Gayal

MAO Xiang-guang, ZHAO Jia-cai, YANG Cai-yun, GAO Yu-qiong, HE Yong-fu, LI Wen, ZHANG Jie
(YunnanProvincialLivestockBreedingCenterandExtensionCenter,Kunming,Yunnan, 650212,P,R,China.)

[Objective] This study was to protect the breed conservation of Gayal, which is a local endangered species of livestock and poultry genetic resources in China. The main influencing factors of Gayal semen quality were comparatively studied in this research, such as semen collection method, season, individual genetic etc. [Methods] The Gayal semen was collected by electric stimulation method and artificial vagina method. Then the ejaculate volume, sperm density, sperm motility and semen freezing thawing activity were determination according to the national standard GB4143-2008 of bovine frozen semen. And, the semen was frozen using programmed freezing instrument. [Results] The thawing effect of Gayal frozen semen was well, and the ejaculate volume was 5.009 + 2.239ml (n=226). Sperm motility was 54.184 + 15.760% (n=223), and the sperm density was 7.207 + 6.387 million /mL (n=225). Thawing activity was 36.007 + 2.092% (n=136). The frozen semen thawing recovery rate was above 50%. Moreover, the success rate of electric stimulation of Gayal semen was high. [Conclusion] The electric stimulation semen collection method can obtain good effect in Gayal under the condition of ex-situ conservation, and the effect of semen freezing thawing is good, which is beneficial for the preservation of genetic material.

Gayal; ex-situ conservation; frozen semen; endangered; thawing; genetic resources

2016-11-20 接收日期:2016-12-25

農業(yè)部畜禽種質資源保護項目(2010年度2130135農業(yè)資源保護)。

毛翔光(1974-)，男，云南瀘西人，高級獸醫(yī)師，主要從事家畜遺傳育種及疾病防治。

S823.2

A

1001-9111(2017)02-0013-04