方蘇++閆興富++周立彪

摘要：以蟲(chóng)草發(fā)酵菌粉為材料，比較多糖提取過(guò)程脫脂、脫蛋白操作對(duì)硫酸-苯酚法和硫酸-蒽酮法測(cè)定多糖值的影響。研究結(jié)果表明，同一樣品提取多糖時(shí)不脫脂和蛋白（A）、只脫脂（B）、只脫蛋白（C）、脫脂脫蛋白（D）對(duì)硫酸-蒽酮法與硫酸-苯酚法測(cè)定結(jié)果差異顯著，2種比色法測(cè)得多糖含量值均呈現(xiàn)A>B>C>D，其中脫蛋白的操作比脫脂操作對(duì)2種比色法測(cè)定結(jié)果影響更大。同時(shí)還顯示，硫酸-苯酚法測(cè)得的多糖含量較硫酸-蒽酮法測(cè)得值大。并通過(guò)精密度、回收率、穩(wěn)定性比較發(fā)現(xiàn)，硫酸-苯酚法優(yōu)于硫酸-蒽酮法。

關(guān)鍵詞：蟲(chóng)草多糖；脫脂；脫蛋白；含量測(cè)定；硫酸-苯酚法；硫酸-蒽酮法

中圖分類號(hào)： R284.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）09-0144-03

測(cè)定多糖含量的方法主要有比色法、高效液相色譜法和酶法等，其中高效液相色譜法與酶法由于樣品前處理工序比較繁瑣，測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)，檢測(cè)費(fèi)用較高等原因未能廣泛使用，而比色法中的苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法由于操作簡(jiǎn)單、實(shí)用性強(qiáng)，在多糖研究中被廣泛使用[1]。比色法多糖含量測(cè)定包括提取和含量測(cè)定2部分，農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)食用菌中粗多糖含量的測(cè)定（硫酸-苯酚法）[2]及中國(guó)藥典[3]靈芝多糖含量的測(cè)定（硫酸-蒽酮法）均為粗多糖的測(cè)定，前者是醇洗后水提，后者是水提后醇沉，均不脫脂不脫蛋白?，F(xiàn)行的多糖提取處理與多糖測(cè)定的基本流程可歸納為：菌粉→脫脂（兼脫色）→水提→醇沉→脫蛋白→得精多糖液→顯色反應(yīng)→比色，實(shí)際研究中的具體操作各有不同，主要區(qū)別在于多糖提取是否經(jīng)脫脂處理或是否經(jīng)脫蛋白處理，包括不脫脂和蛋白[4-7]、只脫脂[8-9]和只脫蛋白處理等[10-13]。目前，采用2種比色法進(jìn)行不同提取處理測(cè)定蟲(chóng)草多糖之間的差異還缺乏研究，因此，本研究以蟲(chóng)草菌粉為材料，在多糖提取過(guò)程中，通過(guò)脫脂和脫蛋白處理，用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法進(jìn)行多糖的測(cè)定，研究脫脂和脫蛋白處理對(duì)蟲(chóng)草多糖測(cè)定結(jié)果的影響，為完善蟲(chóng)草多糖測(cè)定方法和蟲(chóng)草相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)材料：冬蟲(chóng)夏草菌來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，經(jīng)5 L發(fā)酵罐發(fā)酵、過(guò)濾、烘干、粉碎研磨制得。

儀器：分光光度計(jì)UV1000，上海精科天美；離心機(jī)HC-3016，安徽中科中佳；索氏提取器GG-17 50/42，上海喬楓；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA，上海亞榮；移液槍。

試劑：濃硫酸、苯酚、蒽酮、乙醚、氯仿、乙醇（均為分析純）。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理，分別為A：不脫脂也不脫蛋白（對(duì)照）；B：脫脂；C：脫蛋白；D：既脫脂又脫蛋白。其中處理B依次包括：脫脂、水提、醇沉、定容和多糖測(cè)定；處理C依次包括：水提、醇沉、脫蛋白、定容和多糖測(cè)定；處理D依次包括：脫脂、水提、醇沉、脫蛋白、定容和多糖測(cè)定。

1.3樣品處理和多糖提取

1.3.1脫脂稱取1.00 g研磨后的菌粉，濾紙包裹于盛有 250 mL 乙醚的索氏提取器，42 ℃回流2 h，取出揮發(fā)干[7]。

1.3.2水提將菌粉置于三角瓶中，加水100 mL，95 ℃下浸提1 h，浸提2次合并，8 000 r/min離心10 min后，取上清液于55 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至約50 mL[9]。

1.3.3醇沉將濃縮液加入3倍體積的95%乙醇，靜置于 4 ℃ 冰箱中12 h。于8 000 r/min下離心10 min，取沉淀，再用無(wú)水乙醇洗滌后離心，取沉淀90 ℃熱水復(fù)溶至50 mL[9]。

1.3.4脫蛋白將上述復(fù)溶的溶液置于分液漏斗，加入Sevage試劑（氯仿 ∶正丁醇體積比4 ∶1）15 mL，振蕩后靜置 5 min，棄下層有機(jī)相，重復(fù)5次，得多糖液[10]。

1.3.5定容將上述制備好的多糖溶液加蒸餾水定容至100 mL待測(cè)。

1.4多糖的測(cè)定

1.4.1硫酸-苯酚法[2]

1.4.1.1苯酚溶液的配制稱取80 g苯酚溶于蒸餾水，定容至100 mL，于棕色瓶中4 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆?；?shí)際使用時(shí)現(xiàn)用現(xiàn)配5%的苯酚溶液。

1.4.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備稱取干燥葡萄糖0.010 g，溶于蒸餾水定容至100 mL；分別移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 葡萄糖液置于具塞試管中，加蒸餾水至2 mL，另取1支試管加入蒸餾水2 mL作為空白對(duì)照。將上述每一試管中分別加入苯酚溶液1 mL，加5 mL濃硫酸，靜置10 min，渦旋振蕩混勻，30 ℃反應(yīng)20 min，于490 nm下測(cè)定吸光度。

1.4.1.3樣液的測(cè)定取定容后的樣液0.20 mL，加蒸餾水至2 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自加入苯酚溶液起，測(cè)定吸光度。

1.4.1.4多糖含量的計(jì)算根據(jù)測(cè)得的吸光度值，按以下公式計(jì)算多糖百分含量w。

式中：m1為回歸方程換算出多糖濃度（mg/mL）；V1為樣品定容體積（mL）；m2為樣品濃度（mg/mL）；V2為比色測(cè)定時(shí)所移取樣品測(cè)定的體積（mL）；0.9為葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數(shù)。

1.4.2硫酸-蒽酮法[3]

1.4.2.1硫酸蒽酮溶液配制準(zhǔn)確稱取0.2 g蒽酮，緩慢加入100 mL濃硫酸，溶解置于棕色瓶避光保存。

1.4.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備稱取干燥葡萄糖0.010 g，溶于蒸餾水定容至100 mL，分別移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 葡萄糖液置于具塞試管中，加蒸餾水至2 mL，另取1支試管加入蒸餾水2 mL作為空白對(duì)照。分別加入蒽酮硫酸溶液6 mL搖勻，沸水浴15 min，冰水浴15 min，625 nm下測(cè)定吸光度。

1.4.2.3樣液的測(cè)定取定容后的樣液0.2 mL于具塞試管中，加蒸餾水溶解定容至2 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自加入硫酸蒽酮溶液起，測(cè)定吸光度。

1.4.2.4多糖含量的計(jì)算同硫酸-苯酚法。

1.5回收率試驗(yàn)[14]

取處理D樣液0.2 mL于具塞試管中，加入0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.4 mL，蒸餾水定容至2.0 mL，按照“1.4.1”節(jié)硫酸-苯酚法和“1.4.2”節(jié)硫酸-蒽酮法的測(cè)定方法測(cè)定多糖含量，重復(fù)5次，按下述公式計(jì)算回收率：回收率=（c-a）/b×100%。式中：a為供試品所含多糖的量；b為加入對(duì)照品的量；c為實(shí)測(cè)值。

1.6穩(wěn)定性試驗(yàn)[7]

按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)中處理D的操作步驟，在用硫酸-苯酚法和硫酸-蒽酮法進(jìn)行多糖測(cè)定時(shí)，分別延遲10、20、30、40、50、60、90、120 min后再進(jìn)行吸光度測(cè)定，比較2種多糖測(cè)定方法測(cè)得的吸光度差異。

1.7數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

采用IBM SPSS Statistics 20軟件用單因素方差分析的方法對(duì)不同處理間差異進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果與分析

2.12種測(cè)定方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照上述硫酸-苯酚法標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。硫酸-苯酚法濃度-吸光度線性回歸方程[JP3]為y=11.029x+0.022，相關(guān)系數(shù)r=0.996 3，吸光度在 0.132～0684（0.01～0.06 mg/mL）范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

按照上述硫酸-蒽酮法標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。硫酸-蒽酮法濃度-吸光度線性回歸方程為y=8.051 4x-0.002 5，相關(guān)系數(shù)r=0.999 0，吸光度在 0.078～0.480（0.01～0.06 mg/mL）內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2不同處理對(duì)2種方法測(cè)定結(jié)果的影響

2.2.1硫酸-苯酚法從表1可以看出，A、B、C、D處理樣品測(cè)得的蟲(chóng)草多糖含量分別為5.19%、4.77%、3.35%、2.56%，其中，B、C處理測(cè)得的含量分別為A處理的 91.91%、64.54%，D處理樣品測(cè)得的精多糖含量為A處理測(cè)得的粗多糖含量的49.32%；3個(gè)處理組與對(duì)照間均差異明顯。

2.2.2硫酸-蒽酮法3個(gè)處理組樣品測(cè)得的多糖值分別為3.88%、2.99%、2.45%，3個(gè)處理均明顯小于對(duì)照，其中B、C處理測(cè)得的蟲(chóng)草多糖含量分別是A處理的87.78%、67.64%，C處理對(duì)蟲(chóng)草多糖含量的影響比B處理影響較大；D處理樣品測(cè)得的精多糖含量為A處理測(cè)得的粗多糖含量的55.43%（表1）。

2.32種測(cè)定方法的比較

2.3.1多糖值及其精密度

硫酸-苯酚法A、B、C 3種處理多糖含量測(cè)定值均大于硫酸-蒽酮法的測(cè)定值，前者分別比后者高出17.42%、22.94%、12.04%，但2種測(cè)定方法在D處理的測(cè)定結(jié)果接近。

硫酸-苯酚法A、B、C、D 4種處理測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.85%、1.19%、1.31%、1.55%；硫酸-蒽酮法對(duì)應(yīng)A、B、C、D 4種處理樣的RSD值分別為1.89%、2.10%、1.46%、1.89%，硫酸-苯酚法的RSD值低于硫酸-蒽酮法，硫酸-苯酚法較硫酸-蒽酮法具有更高的精密度。

2.3.2回收率

硫酸-苯酚法與硫酸-蒽酮法回收率分別為99.04%、102.00；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差分別為1.78%、2.55%（表2）。

2.3.3穩(wěn)定性

從圖3可以看出，在0～120 min時(shí)間范圍內(nèi)，硫酸-苯酚法測(cè)得的吸光度隨時(shí)間的變化幅度較小，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.83%，硫酸-蒽酮法測(cè)得的吸光度隨時(shí)間的變化較為明顯，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差為3.93%。在0～30 min內(nèi)，硫酸-苯酚法測(cè)得的吸光度基本穩(wěn)定，硫酸-蒽酮法在0～30 min 的吸光度略有下降。

3討論

多糖提取脫脂、脫蛋白處理都造成測(cè)定值的差異，影響因素包括有機(jī)項(xiàng)干擾、多糖流失及操作條件等。脫脂操作2種比色法測(cè)定的多糖含量較粗多糖含量均有減少，乙醚回流脫脂兼有脫色作用，本試驗(yàn)因由濾紙包裹回流，即使吸光度減少，屬排除有機(jī)項(xiàng)干擾，無(wú)多糖損失。脫蛋白操作本試驗(yàn)采用的是研究中較多用到的Sevage法[10-13]，2種比色法測(cè)得的多糖含量值均大幅減少，相比粗多糖含量減少達(dá)33%以上。原因在于脫蛋白Sevage試劑萃取分相時(shí)易造成多糖的流失，萃取次數(shù)多少可能是影響的主要因素，有研究結(jié)果認(rèn)為，萃取次數(shù)為4次時(shí)蛋白質(zhì)脫除率高，但多糖損失率也高[15]。因此，在排除蛋白干擾的同時(shí)，可能會(huì)造成多糖流失，導(dǎo)致脫蛋白處理的測(cè)定值表現(xiàn)為較大幅度減少的現(xiàn)象。

與硫酸-蒽酮法相比，硫酸-苯酚法測(cè)得的4種處理的多糖值均較高，可能與顯色反應(yīng)對(duì)干擾項(xiàng)的敏感程度有關(guān)。2種呈色強(qiáng)度分別與溶液中糖的濃度成正比，2種顯色反應(yīng)對(duì)干擾項(xiàng)的敏感度可能不同。有研究結(jié)果認(rèn)為，這2種比色法在測(cè)定多個(gè)不同樣品時(shí)多糖含量差別很大[16]。本試驗(yàn)對(duì)去除脂類和蛋白質(zhì)干擾的D處理既脫脂又脫蛋白來(lái)說(shuō)，2種比色法測(cè)得的多糖含量趨于接近，干擾項(xiàng)的存在可能是造成差異的主要因素。

從穩(wěn)定性看，在120 min內(nèi)硫酸-苯酚法顯色更為穩(wěn)定，而硫酸-蒽酮法測(cè)得的吸光度值隨著比色時(shí)間的延長(zhǎng)而減小，因?yàn)槎嗵窃诹蛩?蒽酮試劑作用下形成的衍生物可能受反應(yīng)時(shí)間及環(huán)境溫度變化的影響，從而造成顯色反應(yīng)不穩(wěn)定[1]?？傮w上看，硫酸-苯酚法與硫酸-蒽酮法作為操作易實(shí)現(xiàn)、應(yīng)用性強(qiáng)的2種比色法，均可用于蟲(chóng)草多糖的測(cè)定，硫酸-苯酚法的精密度更高、回收率和穩(wěn)定性更好，及試劑配制、顯色反應(yīng)步驟也更為簡(jiǎn)易，更適于蟲(chóng)草多糖的測(cè)定。

參考文獻(xiàn)：

[1]張媛媛，張彬. 苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法測(cè)定綠茶茶多糖的比較研究[J]. 食品科學(xué)，2016，37（4）：158-163.

[2]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部. 食用菌中粗多糖含量的測(cè)定：NY/T 1676—2008[S]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2008.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典：一部[M]. 2015版. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：188-189.

[4]薛俊杰，唐慶九，劉艷芳，等. 蛹蟲(chóng)草水溶性多糖含量測(cè)定方法的比較與優(yōu)化[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2012，31（3）：443-449.

[5]蘇穎，周選圍. 改進(jìn)苯酚-硫酸法快速測(cè)定蟲(chóng)草多糖含量[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā)，2008，29（3）：118-121.

[6]來(lái)永斌，王琦，孫月. 蛹蟲(chóng)草多糖含量的測(cè)定與分析[J]. 中成藥，2001，23（7）：517-518.

[7]郭曉蕾，朱思潮，翟旭峰. 硫酸蒽酮法與硫酸苯酚法測(cè)定靈芝多糖含量比較[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28（9）：2000-2003.

[8]白云娥，王毅，漆小梅，等. 冬蟲(chóng)夏草、亞香棒蟲(chóng)草中多糖的含量測(cè)定[J]. 中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2001，21（1）：19-20.

[9]劉春泉，李大婧，劉榮. 蒽酮-硫酸法測(cè)定北冬蟲(chóng)夏草多糖含量[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（2）：122-124.

[10]王安亭，王祖. 冬蟲(chóng)夏草蟲(chóng)草多糖的分離純化及含量的測(cè)定[J]. 食用菌，2012（1）：60-62.

[11]車振明，王燕，周黎黎. 人工蛹蟲(chóng)草子實(shí)體多糖分離最佳工藝研究[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā)，2004，25（5）：78-79.

[12]魯曉巖. 硫酸苯酚法測(cè)定北冬蟲(chóng)夏草多糖含量[J]. 食品工業(yè)科技，2002，23（4）：69-70.

[13]郭思維，劉勝姿，李威. 人工冬蟲(chóng)夏草多糖脫色脫蛋白工藝研究[J]. 食品科技，2013，38（5）：207-211.

[14]國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典：四部[M]. 2015版. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：375.

[15]池玥蘭，王雪，王仁雷，等. 蛹蟲(chóng)草基質(zhì)多糖的脫蛋白方法研究[J]. 食品科技，2014，39（12）：202-205.

[16]夏文，杜洪志，董立莎，等. 蒽酮-硫酸法與苯酚-硫酸法測(cè)定切面紅色與切面白色土茯苓藥材中多糖含量的比較[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2015，26（11）：2572-2574.