王婭玲 李維峰 桂花

摘要[目的]優(yōu)化茶粕中茶皂苷的提取工藝。[方法]在纖維素酶作用下，利用超聲輔助，通過單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)，研究料液比、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶的用量等因素對茶皂苷提取得率的影響。[結(jié)果]試驗(yàn)表明，茶粕中茶皂苷的最佳提取條件為酶解溫度50 ℃，酶添加量0.3%，酶解時(shí)間70 min，料液比1∶20（g∶mL），在此條件下茶皂苷提取得率為9.769%。[結(jié)論]采用超聲輔助纖維素酶提取，可有效提高茶粕中茶皂苷的提取得率。

關(guān)鍵詞 纖維素酶；超聲波；茶粕；茶皂苷

中圖分類號 S789.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）02-0097-03

Abstract[Objective] To optimize the extraction process of tea saponin from seed cake of Camellia oleifera.[Method] The single factor test and orthogonal experiment were performed to study the effects of solidliquid ratio，enzymatic temperature，enzymatic time and cellulase amount on the yield of tea saponin by using ultrasonic and cellulase.[Result] The results showed that the optimized extraction condition was as following：enzymatic temperature 50 ℃，cellulose amount 0.3%，enzymatic time 70 min，solidliquid ratio of 1∶20（g∶mL）. Under such condition the extraction rate of tea saponin was up to 9.769%.[Conclusion] Cellulase and ultrasonic extraction method shows high effectiveness in extracting tea saponin from seed cake of C. oleifera.

Key words Cellulase；Ultrasonic；Seed cake of Camellia oleifera；Tea saponin

油茶（Camellia oleifera Abel）為山茶科茶屬常綠小喬木，其種子可榨油供食用，油茶籽榨取茶油后剩余的茶粕，又稱為油茶餅、茶枯、茶麩等。當(dāng)前我國油茶種植面積約368萬hm2，年油茶產(chǎn)量30萬t，茶粕產(chǎn)量約70萬t[1]。茶粕中除了含有一定量的油脂外，還含有茶皂苷、茶蛋白、茶多糖等多種生物活性成分，具有很高的應(yīng)用價(jià)值[2-3]。但目前我國處理茶粕的主要方式是經(jīng)過簡單發(fā)酵作為農(nóng)田肥料或動(dòng)物飼料，部分出口到國外[4]。茶粕中的生物活性成分沒有得到充分的開發(fā)利用。

茶粕中含有10%～16%的茶皂苷[5]。茶皂苷具有乳化、分散、發(fā)泡和去污等性能，并具有抑菌、抗癌、止咳平喘、消炎止痛等藥理作用[6-8]，應(yīng)用范圍十分廣泛。從茶粕中提取茶皂苷，原料來源豐富，價(jià)格低廉，并且能提高茶粕的利用價(jià)值，對提高油茶種植產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前對茶皂苷的提取國內(nèi)外都有較為深入的研究，提取方法主要包括水提法、堿提酸沉法、乙醇提取法等[9-13]，其中利用一定濃度的乙醇提取茶皂苷是較為常用的方法，但傳統(tǒng)的醇提工藝對茶皂苷的提取率較低，限制了茶粕中茶皂苷提取工藝的推廣。為提高茶皂苷的提取率，筆者先對茶粕進(jìn)行纖維素酶水解預(yù)處理，再利用超聲波輔助醇提法探討纖維素酶用量、酶解溫度、酶解時(shí)間、料液比等因素對茶皂苷提取率的影響，為進(jìn)一步優(yōu)化茶皂苷提取工藝提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 原料：茶粕取自云南淳普油脂有限公司，茶粕干燥后粉碎過40目篩，石油醚回流5 h去除殘余茶籽油，揮干石油醚，殘?jiān)?05 ℃繼續(xù)烘干，置于干燥器中備用。

主要試劑：茶皂苷標(biāo)準(zhǔn)品，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；纖維素酶（活力單位≥50 000 U/g），上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為國藥集團(tuán)分析純。

主要儀器：FW-200萬能粉碎機(jī)，上海科導(dǎo)SK18-E超聲清洗儀，上海精科UV759紫外-可見分光光度計(jì)，梅特勒AL204電子分析天平，上海一恒DZF-6053真空干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 樣品茶皂苷的提取。

準(zhǔn)確稱取2 g茶粕樣品，加0.1 mol/L pH 5.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液5.0 mL[14-15]，加入一定比例的纖維素酶，于不同溫度下保持一定時(shí)間，再沸水浴5 min進(jìn)行酶滅活，然后加入一定體積乙醇溶液，使浸提液乙醇濃度達(dá)到60%[15-16]，超聲30 min，超聲功率600 W，超聲溫度50 ℃[16]，得到茶皂苷提取液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。茶皂苷含量的測定采用香草醛-濃硫酸法[17]，配制2 mg/mL茶皂苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取茶皂苷標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于具塞比色管中，加80%乙醇分別將體積補(bǔ)充至1.0 mL，再分別加入8%香草醛溶液1.0 mL， 77%硫酸溶液8.0 mL，搖勻，置于60 ℃水浴中加熱20 min，然后在冰水浴中冷卻10 min，取出置于室溫。以試劑為空白，在最大吸收波長（550 nm）下測定吸光度，以吸光度對濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程A=9.688x-0.008 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1。

1.2.3 單因素試驗(yàn)。以60%乙醇為提取溶劑，在其他條件相同的情況下，分別考察不同比例的纖維素酶（0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）、不同酶解溫度（20、30、40、50、60、70 ℃）、不同酶解時(shí)間（20、30、40、50、60、70、80、90、100 min）和不同料液比[1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶ml）]對茶皂苷提取得率的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

為對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，在上述單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇纖維素酶加入量、酶解溫度、酶解時(shí)間和料液比4個(gè)因素按照L9（34）設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)（表1）。

1.2.5 樣品茶皂苷提取得率分析。

取1.0 mL茶皂苷提取液于25 mL比色管中，分別加入8%香草醛溶液1.0 mL，77%硫酸溶液8.0 mL，搖勻，置于60 ℃水浴中加熱20 min，然后在冰水浴中冷卻10 min，取出置于室溫。以試劑為空白，在最大吸收波長（550 nm）下測定吸光度，利用回歸方程計(jì)算提取液中茶皂苷含量，并按照以下公式計(jì)算茶皂苷提取得率。

茶皂苷得率（%）=（提取液中茶皂苷質(zhì)量/原料質(zhì)量）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶添加量對茶皂苷提取的影響。

從圖1可以看出，隨著纖維素酶用量的增加，茶皂苷的得率逐漸上升，在添加量達(dá)到0.3%時(shí)達(dá)到最大值，茶皂苷得率為8.98%。繼續(xù)增加酶用量，茶皂苷得率不再增加。因此，纖維素酶的最佳用量為0.3%。

2.1.2 酶解溫度對茶皂苷提取的影響。

在纖維素酶添加量為0.3%，pH 5的條件下對茶粕預(yù)處理，酶解溫度分別設(shè)定為20、30、40、50、60、70 ℃，酶滅活后進(jìn)行超聲輔助提取30 min，提取結(jié)果見圖2。從圖2可見，酶解溫度對酶預(yù)處理茶粕提取茶皂苷影響較大，當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，茶皂苷的得率達(dá)到最大。隨著溫度的進(jìn)一步提高，茶皂苷得率逐漸下降，究其原因，主要是由于溫度過高影響了酶的活性，使酶的有效性降低。因此，酶解溫度控制在40 ℃為最佳。

2.1.3 酶解時(shí)間對茶皂苷提取的影響。

從圖3可見，在酶作用初期，隨著酶解時(shí)間延長，茶皂苷得率逐漸升高，在酶解時(shí)間為70 min時(shí)，茶皂苷得率最高，之后隨著時(shí)間的延長，茶皂苷的得率逐漸下降。其原因是隨著細(xì)胞壁的分解，茶葉中糖類、蛋白質(zhì)等可溶性物質(zhì)隨著時(shí)間的延長浸入溶液，在測定茶皂苷時(shí)干擾了測定，這也會(huì)增加后期茶皂苷凈化的難度。因此，可認(rèn)為70 min為最佳酶解時(shí)間。

2.1.4 料液比對茶皂苷提取的影響。

由圖4可以看出，料液比直接影響茶皂苷的得率，料液比中溶劑用量小不利于茶皂苷的提取，因?yàn)槿軇w積過少，茶皂苷從樣品中擴(kuò)散到溶劑中的速率低，而且極易達(dá)到飽和狀態(tài)；當(dāng)料液比達(dá)到1∶15時(shí)，茶皂苷得率達(dá)到最大值，繼續(xù)增大料液比中溶液的用量，茶皂苷得率在8.8%左右波動(dòng)，而且料液比中溶劑用量過大，會(huì)在加熱過程中造成能量的浪費(fèi)。綜合考慮，選用1∶15為最佳料液比。

2.2 茶粕中茶皂苷提取工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果

以茶皂苷得率為評價(jià)指標(biāo)，使用正交設(shè)計(jì)助手 Ⅱ 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

從表2中可以看出，茶皂苷的提取得率受到酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間和料液比4個(gè)因素的交叉影響，通過極差R值的比較可以看出，影響茶皂苷提取率因素的主次順序依次為料液比、酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間，茶皂苷的超聲輔助生物酶法提取最佳條件是A3B2C2D3，即酶解溫度為50 ℃，酶添加量為0.3%，酶解時(shí)間為70 min，料液比為1∶20（g∶mL）。

2.3 最佳條件組合試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)優(yōu)化條件，按照酶解溫度50 ℃，酶添加量0.3%，酶解時(shí)間70 min，料液比1∶20（g∶mL），超聲輔助提取茶皂苷，進(jìn)行5次平行提取試驗(yàn)，結(jié)果提取率依次為10.092%、9.554%、9.461%、9.784%、9.952%。

試驗(yàn)表明，在上述最佳提取工藝下，采用超聲輔助纖維素酶法提取茶粕中茶皂苷，平均得率為9.769%，試驗(yàn)結(jié)果平均標(biāo)準(zhǔn)誤（RSD）為0.118%。

3 結(jié)論

該研究采用超聲輔助纖維素酶法提取茶粕中茶皂苷，通過單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化試驗(yàn)研究了茶皂苷的提取最佳工藝，并通過試驗(yàn)驗(yàn)證最佳工藝下茶皂苷的得率，發(fā)現(xiàn)在酶解溫度為50 ℃，酶添加量為0.3%，酶解時(shí)間為70 min，料液比為1∶20（g∶mL）的條件下，采用60%乙醇浸提，超聲功率600 W，超聲溫度50 ℃，超聲輔助提取30 min，茶皂苷平均得率可以達(dá)到9.769%。該工藝耗時(shí)短，提取分離簡單，得率較高，具有很高的實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。

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