侯真真 張誼 張明

摘要 [目的]定位并比較不同日齡建昌黑山羊睪丸及附睪中GnRHR的分布及表達(dá)情況。[方法]分別收集55、104、300、1 140日齡建昌黑山羊的睪丸、附睪頭和附睪尾組織，然后進(jìn)行脫水、包埋、切片后，采用免疫組化定位GnRHR在各個(gè)組織中的分布。[結(jié)果]GnRHR在建昌黑山羊睪丸、附睪頭和附睪尾組織細(xì)胞中均有分布，在上皮下層、基質(zhì)層中分布較多，其表達(dá)量在300日齡的附睪尾和1 140日齡的睪丸中達(dá)到較高水平。[結(jié)論]GnRHR在睪丸、附睪中均有表達(dá)，而且不同日齡階段表達(dá)存在組織細(xì)胞特異性。

關(guān)鍵詞 促性腺激素釋放激素受體；睪丸；附睪；建昌黑山羊

中圖分類號 S827 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）13-0103-04

Localization and Distribution of GnRHR in the Testis and Epididymis from Different Age of Jianchang Black Goat

HOU Zhen-zhen1，ZHANG Yi2，ZHANG Ming1*

（1.College of Animal Science and Technology，Sichuan Agricultural University，Wenjiang，Sichuan，611130；2.School of Animal Science and Technology，Xichang College，Xichang，Sichuan 615000）

Abstract [Objective]To localize and compare the distribution and expression level of GnRHR in the testis and epididymis from different age of Jianchang black goat.[Method]The testis and epididymis were collected at 55，104，104，1 140 d after animal birth，then dehydrated，embedded and cut.Distribution of GnRHR was orientated by immunohistochemical assay.[Result]GnRHR in the testis，epididymal heads and tails，especially in subepithelial layer and stroma layer，in which had a higher expression level than other tissue was expressed.GnRHR expression was the most in the epididymis at 300 d and in the testis at 1 140 d.[Conclusion] GnRHR is expressed in the testis and epididymis，and its expression level has tissue-specificity at different age.

Abstract Gonadotropin Releasing Hormone receptor； Testis； Epididymis；Jianchang black goat

繁殖是生物物種延續(xù)最基本的生命活動，而動物繁殖必須依賴體內(nèi)的繁殖調(diào)節(jié)物質(zhì)。促性腺激素釋放激素（Gonadotropin Releasing Hormone，GnRH） 是下丘腦分泌的十肽，是下丘腦-垂體-性腺軸的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[1]，對于哺乳動物生殖器官發(fā)育和生理機(jī)能的維持起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。GnRH作用的發(fā)揮依賴于促性腺激素釋放激素受體（Gonadotropin Releasing Hormone receptor，GnRHR） 的存在。GnRHR和GnRH 結(jié)合進(jìn)而激發(fā)信號通路，并主要促使促黃體生成素 （LH） 和促卵泡素（FSH） 的合成與釋放，參與動物機(jī)體的繁殖調(diào)控[2-3]。

建昌黑山羊是四川省地方優(yōu)良品種，廣泛分布于涼山彝族自治州。該山羊耐粗飼，易管理，抗病力強(qiáng)，繁殖力高，在當(dāng)?shù)氐胤浇?jīng)濟(jì)發(fā)展中占重要的地位[4]。目前有關(guān)雄性建昌黑山羊生殖生理的基礎(chǔ)研究很少。研究人員發(fā)現(xiàn)，抑制實(shí)驗(yàn)動物和人的GnRH基因和GnRHR基因表達(dá)，會顯著抑制其生殖活動[5-6]。Ikemoto等[7]認(rèn)為GnRH 與其受體的相互作用在生殖功能中起著關(guān)鍵性的作用。也有資料顯示山羊GnRHR基因的突變與其繁殖性能有關(guān)，可能是影響山羊繁殖率的一個(gè)因素[8]。相關(guān)定位研究顯示GnRHR除主要分布在垂體促性腺細(xì)胞外[9]，在卵巢、睪丸、前列腺、性腺等組織細(xì)胞上也存在著GnRH特異結(jié)合位點(diǎn)[10-11]。

近年來，許多科研人員將GnRHR基因作為影響山羊繁殖性能的候選基因來研究[8]。但迄今為止，GnRHR在建昌黑山羊雄性生殖器官上發(fā)育性表達(dá)和分布的研究很少。該研究利用免疫組化，定位分析不同日齡階段山羊睪丸、附睪頭、附睪尾中GnRHR的分布情況，以期為深入了解建昌黑山羊雄性生殖生理提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物。分別選擇55、104、300和1 140 d 這4個(gè)日齡的建昌黑山羊公羊各2只。自然條件下使其自由飲水與采食，并分開飼養(yǎng)。進(jìn)行麻醉后，外科手術(shù)收集睪丸、附睪頭和附睪尾組織，用于組織切片和免疫組化（IHC）定位[12-13]GnRHR。實(shí)驗(yàn)動物的處理符合動物福利相關(guān)法律。

1.1.2 儀器。切片機(jī)（Lecia RM-235德國萊卡公司）；恒溫平板（HB-2000）；電熱恒溫干燥箱；顯微鏡（Olympus BX-51，日本）；超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；超低溫冰箱-80 ℃（Thermo，美國Thermo公司）。

1.1.3 試劑。二甲苯，乙醇（100%、99%、95%、90%、80%、70%），磷酸二氫鉀，磷酸氫二鈉，氯化鉀，氯化鈣，氯化鈉，吐溫20，胰蛋白酶，山羊血清，3%H2O2，甲醇等為國產(chǎn)分析純。一抗（兔抗），二抗（山羊抗兔），來自Santa cruz公司；兔抗山羊SABC試劑盒，蘇木精，DAB顯色試劑來自博士德。

1.1.4 溶液配制

1.1.4.1 免疫組化稀釋比。用1倍PBS液稀釋一抗（1∶200），血清（1∶10），二抗（1∶100），SABC（1∶100）；DAB試劑用超純水稀釋（1∶20）；試劑A、B、C各50 μL，1 mL超純水。

1.1.4.2 配制PBS洗滌液。

配制5倍PBS液：氯化鉀1 g、磷酸氫二鈉14.5 g、磷酸二氫鉀1.35 g、氯化鈉40 g，1 000 mL蒸餾水；配制1倍PBS液：500 mL的5倍PBS液，2 000 mL蒸餾水。另外加吐溫的PBS液再加750 μL吐溫混勻即可。

1.1.4.3 配制0.05%胰蛋白酶工作液。

先配制0.5%的胰蛋白酶儲藏液：用50 mg胰蛋白酶干粉與10 mL純水混勻，-20 ℃冰箱保存；再配制1% CaCl2溶液：用0.1 g CaCl2與10 mL純水混勻，4 ℃冰箱保存；0.05%胰蛋白酶工作液即用1 mL 0.5%胰蛋白酶儲藏液加1 mL 1% CaCl2溶液再加8 mL純水，混勻即可。

1.1.4.4 配制3%過氧化氫液。30% H2O2 40 mL、甲醇360 mL，攪拌混勻即可。

1.2 方法

1.2.1 石蠟組織切片的制作。

收集睪丸、附睪頭和附睪尾組織，放入10% 中性福爾馬林浸泡2～3 d，修塊并置于包埋盒內(nèi)，再次浸泡在10% 中性福爾馬林中3～5 d固定；之后用自來水沖洗12 h，依次在70%、80%、90%、95%、99%、100%乙醇溶液，3個(gè)二甲苯溶液，3個(gè)蠟缸中進(jìn)行組織脫水透蠟，再進(jìn)行石蠟包埋；之后進(jìn)行石蠟切片，切片厚度為4 μm，每個(gè)日齡公羊睪丸、附睪頭和附睪尾3個(gè)組織，各切3張片子，切片后用紙條將切片放入45 ℃水中使其充分展開，再用載玻片接觸切片使其貼片，然后放于50 ℃熱臺烘干，45 ℃烘片48 h。

1.2.2 脫蠟。

把切片放在載玻片架內(nèi)，放入二甲苯中連續(xù)透明處理2次，各脫蠟1 min；脫蠟后，把切片依次放入不同濃度的乙醇（100%、99%、95%、90%、80%、70%）溶液中，各30 s，脫蠟。脫蠟完成后放到燒杯中，在緩慢又小的自來水流下沖洗10 min。

1.2.3 抗原修復(fù)。

酶消化法：用0.05%胰蛋白酶工作液修復(fù)。在玻片上滴加胰蛋白酶液，覆蓋住組織，將玻片放于37～38 ℃的熱臺上，消化15 min，然后輕輕甩干玻片上殘余的胰蛋白酶，將玻片放于玻片架上，流水浸泡5～10 min。

1.2.4 滅活內(nèi)源性過氧化物酶。將玻片浸泡于3% H2O2液10 min進(jìn)行內(nèi)源性過氧化物酶滅活。

1.2.5 滴加血清和一抗孵育。

切片用3% H2O2浸泡過后取出，把切片放到裝有PBS洗滌液浸泡3次，每次5 min。取出浸泡的切片，將切片快速地輕放在暗盒里，然后迅速滴加正常山羊血清稀釋液，蓋住切片上的組織，蓋上蓋子，室溫孵育30 min。

孵育過后，快速地將之前滴加在切片上的血清甩干凈（注意此過程禁止用其他任何溶液沖洗，自然甩干即可），然后迅速地滴加一抗（兔抗、陰性對照滴加PBS液）蓋住之前血清蓋住的切片組織處，放回暗盒里并蓋上蓋子，放入冰箱（4 ℃）過夜（間隔12～16 h，14 h左右效果最佳）。

1.2.6 二抗孵育。將盒子從冰箱（4 ℃）中拿出，把切片放到載玻片架內(nèi)，放入燒杯中用PBS洗滌液連續(xù)浸泡3次，每次5 min（此處陰性對照要與GnRHR組織樣分開漂洗）。漂洗結(jié)束后，把切片放入暗盒里，快速滴加二抗（山羊抗兔），淹蓋住組織，室溫孵育1 h。

1.2.7 滴加SABC。孵育結(jié)束后，把所有的切片都放在同一載玻片架內(nèi)，并放入燒杯中用PBS洗滌液連續(xù)浸泡3次，每次5 min。浸泡完成后，將切片放回暗盒內(nèi)，快速滴加SABC，淹蓋住組織，室溫孵育1 h。

1.2.8 顯色。

從暗盒里取出切片，裝在載玻片架內(nèi)，并依次放入4個(gè)燒杯（第1個(gè)燒杯1倍PBS溶液加有吐溫，第2個(gè)無吐溫，第3個(gè)有吐溫，第4個(gè)無吐溫）中浸泡，每個(gè)燒杯中浸泡5 min。浸泡結(jié)束后，將切片放回盒內(nèi)，按照確定好的GnRHR的顯色時(shí)間，快速滴加DAB進(jìn)行顯色，每次顯色2張載玻片。每次顯色時(shí)間到后，迅速將片子放入裝有清水的燒杯中，洗去載玻片上的DAB液，將片子放在載玻片架里并放入燒杯中。所有片子DAB顯色完后，放在自來水下緩慢沖洗3 min；接著進(jìn)行蘇木精染色，染色時(shí)間為30 s，每次3張載玻片最佳，每次顯色時(shí)間到后，迅速將片子放入裝有清水的燒杯中，洗去多余的蘇木精，把片子放在載玻片架里并放入燒杯中。所有片子染色完后，放在自來水下緩慢沖洗5 min。DAB顯色時(shí)間約為90 s，蘇木精染色時(shí)間約為30 s。

1.2.9 脫水。

緩慢沖洗結(jié)束后，將切片快速地依次放入不同濃度的乙醇（70%、80%、90%、95%、99%、100%）中脫水，且快速地放入裝有二甲苯玻璃瓶中連續(xù)透明處理2次，每次1 min，最后放到二甲苯的中待封片。