歐陽(yáng)秋飛,黃嬌麗,農(nóng)艷豐,李榮峰,馬 博,楊瑞虎,樊虹伶

(百色學(xué)院,廣西 百色 533000)

百色?？菸〔≡姆蛛x與鑒定

歐陽(yáng)秋飛,黃嬌麗,農(nóng)艷豐,李榮峰,馬 博,楊瑞虎,樊虹伶

(百色學(xué)院,廣西 百色 533000)

采用組織分離法從百色市隆林縣的桑枯萎病病莖部分離獲得2個(gè)菌株P(guān)B0102和PS0202；通過(guò)對(duì)分離菌進(jìn)行致病性測(cè)定、培養(yǎng)性狀觀察、生理生化測(cè)定、16S rDNA序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析,將PB0102和PS0202分別鑒定為Enterobactercloacae和Enterobacterasburiae。

百色市;?？菸?病原菌;分離;鑒定

近年來(lái),百色市以“東蠶西移”戰(zhàn)略為契機(jī),結(jié)合自身實(shí)際,大力發(fā)展桑蠶產(chǎn)業(yè),使桑蠶產(chǎn)業(yè)逐步成為繼芒果、甘蔗之后的特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè),是農(nóng)民增收致富的又一重要渠道[1]。百色市作為廣西重要的桑蠶基地,目前有隆林、靖西、凌云、田東、平果、德保、那坡和樂(lè)業(yè)等8個(gè)縣(市)進(jìn)行桑蠶生產(chǎn),現(xiàn)共有桑園21617 hm2。?？菸∪麨樯?shù)細(xì)菌性枯萎病(Mulberry bacterial wilt),自2010年以來(lái),該病相繼在廣西中東部賓陽(yáng)縣、上林縣、象州縣、忻城縣、宜州市、橫縣、融安縣、鹿寨縣和貴港市等縣(市)大面積發(fā)生,給當(dāng)?shù)厣ＰQ生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

在2015年百色市桑樹(shù)細(xì)菌性病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn),隆林縣平班鎮(zhèn)的桑園中也發(fā)現(xiàn)了類似桑枯萎病癥狀的植株，感病桑樹(shù)表現(xiàn)為葉片從葉緣開(kāi)始失水萎蔫,繼而褐變干枯并向葉面卷曲；隨著病情的加重,葉片自下而上逐漸掉落,致使感病植株呈光桿狀；剝開(kāi)發(fā)病植株根莖表皮,發(fā)現(xiàn)木質(zhì)部有褐色條紋產(chǎn)生。為了準(zhǔn)確診斷病害,明確病原,本研究對(duì)該病的病原進(jìn)行了分離和致病性測(cè)定,并通過(guò)培養(yǎng)性狀觀察、生理生化測(cè)定、16S rDNA序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)該病原菌進(jìn)行了鑒定,旨在為控制該病在百色市的傳播蔓延提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用菌株為2015年在百色隆林縣平班鎮(zhèn)桑園發(fā)現(xiàn)的病桑莖段經(jīng)組織分離、純化后獲得;致病性測(cè)定用桂桑優(yōu)12號(hào)(購(gòu)自廣西桑蠶技術(shù)推廣總站)進(jìn)行;試驗(yàn)所用培養(yǎng)基為NA和TTC(氯化三苯基四氮唑)[3]。

1.2 病原菌的分離與純化

病原菌的分離采用傳統(tǒng)組織分離法進(jìn)行[4],方法如下:剪取5 cm左右新鮮的病桑根、莖段,用自來(lái)水洗凈后放入75%的乙醇中1 min進(jìn)行表面消毒,再轉(zhuǎn)入0.1%升汞溶液中消毒2 min,繼而用滅菌水漂洗3～4次,用滅菌濾紙吸干水分;將已消毒的根、莖段放入有2 mL滅菌水的培養(yǎng)皿中,用滅菌鑷子剝?nèi)ケ砥?再用滅菌剪刀和手術(shù)刀刮取、剪碎木質(zhì)部褐變部位,充分混勻以釋放病原菌;最后直接用接種環(huán)沾取一環(huán)分離液于TTC平板上劃線,做好標(biāo)記,放于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。對(duì)長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行2次重新劃線純化后,再將分離菌劃線于NA斜面培養(yǎng)基中,在30 ℃下培養(yǎng)48 h,保存于4 ℃冰箱。

1.3 病原菌的致病性測(cè)定

致病性測(cè)定參照蒙姣榮等(2014)的菌液浸泡法[2]接種離體桑枝。具體步驟如下:將保存于4 ℃冰箱的分離菌于NA培養(yǎng)基上活化,在30 ℃下培養(yǎng)24 h后再轉(zhuǎn)接1次,再用滅菌的pH 7.0、0.005 mol/L的PBS緩沖液將平板上的菌苔洗下,制成108cfu/mL菌懸液后,分裝于三角瓶中,每瓶150 mL;再將事先剪下的新鮮桑枝插入三角瓶中,每支留頂葉4片左右。每個(gè)菌株5個(gè)重復(fù),以接種滅菌的0.005 mol/L PBS緩沖液為對(duì)照。接種后,用保鮮袋罩住桑枝,置于自然條件下,溫度為24～33 ℃。自接種第2天開(kāi)始觀察、記錄桑枝發(fā)病情況。試驗(yàn)結(jié)束后,采用柯赫氏法則重新分離病原菌,并與原接種菌進(jìn)行對(duì)比。

1.4 病原菌生理生化指標(biāo)測(cè)定

病原菌生理生化指標(biāo)測(cè)定采用購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司的細(xì)菌微量生化反應(yīng)管。測(cè)試項(xiàng)目有:V-P試驗(yàn)、M-R試驗(yàn)、葡萄糖、蔗糖、D-阿拉伯糖醇、賴氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、硝酸鹽還原、蜜二糖、L-果糖、D-山梨醇,每個(gè)指標(biāo)的測(cè)定設(shè)3個(gè)重復(fù)。參照Z(yǔ)hu Bo(2011)[5]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[6]對(duì)病原菌各項(xiàng)生理生化指標(biāo)鑒定結(jié)果進(jìn)行分析。

1.5 病原菌16S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

使用生工Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取病原菌基因組DNA。使用TAKARA MightyAmp?DNA Polymerase Ver.2(R071Q)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,16S rDNA細(xì)菌通用引物為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′)/1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′),PCR目的片段大小為1400 bp,反應(yīng)體系為25 μL,反應(yīng)條件為:98 ℃預(yù)變性2 min,98 ℃變性10 s,56 ℃退火15 s,68 ℃ 延伸2 min,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán);68 ℃延伸2 min。反應(yīng)結(jié)束后取2 μL PCR產(chǎn)物點(diǎn)入1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳,之后使用凝膠成像系統(tǒng)觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

測(cè)序后所得病原菌DNA序列經(jīng)Blastn同源性搜索后,選取與之同源性最高的序列利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(NJ),通過(guò)1000次重復(fù)的bootstrap[7]進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與培養(yǎng)特性

從百色隆林縣平班鎮(zhèn)桑園病桑枝條上分離得到的2株分離菌PB0102和PS0202,在NA培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)48 h后,菌落均表現(xiàn)為規(guī)則圓形,濕潤(rùn),光滑突起,乳白色至淺黃色;在TTC培養(yǎng)基上,也表現(xiàn)為菌落圓形,濕潤(rùn)光滑,突起,但顏色從菌落中心開(kāi)始由乳白色向粉紅至深紅色漸變,無(wú)流動(dòng)性。挑取分離菌進(jìn)行革蘭氏染色,于光學(xué)顯微鏡下觀察,兩者皆為革蘭氏陰性菌,且都為橢圓至短桿狀,無(wú)芽孢。

2.2 病原菌的致病性測(cè)定

對(duì)分離菌PB0102和PS0202進(jìn)行離體桑枝接種,接種后第4天開(kāi)始葉片出現(xiàn)變黃、萎蔫癥狀；第5天葉片由葉緣開(kāi)始出現(xiàn)失水褐化；第6天葉片焦枯向內(nèi)卷曲(圖1)；發(fā)病桑枝隨著病情加重,葉片逐漸枯萎掉落,致使枝條呈光桿狀。對(duì)發(fā)病桑枝重新進(jìn)行病原菌分離,得到的分離菌培養(yǎng)性狀與所接菌株一致,且接種桑枝所表現(xiàn)的病癥與田間病癥相同,表明分離菌PB0102和PS0202為?？菸〉闹虏【?/p>

A:CK;B:PB0102;C:PS0202。圖1 百色?？菸【鶳B0102和 PS0202接種離體桑枝第6天的癥狀

2.3 病原菌的生理生化特性

參照Z(yǔ)hu Bo和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》選擇了12項(xiàng)生理生化鑒定指標(biāo)對(duì)PB0102和PS0202進(jìn)行測(cè)定,并與已知菌株Enterobacterasburiae(ATCC35953T)、Enterobactercloacaesubsp. cloacae(ATCC130477T)和Enterobactercloacaesubsp.dissolvens(LMG2683T)的生理生化反應(yīng)結(jié)果作比較,結(jié)果表明PB0102的生理生化特性與Enterobactercloacae完全一致,PS0202與Enterobacterasburiae完全一致。

2.4 病原菌16S rDNA序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

對(duì)2株病原菌進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增后,得到1條1400 bp大小的特異性條帶(圖2)；將PCR產(chǎn)物直接測(cè)序后得到1200 bp的有效序列；再將所得序列提交至NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì),結(jié)果表明: PB0102與多株Enterobactercloacae的序列的相似性達(dá)到99%； PS0202與多株Enterobacterasburiae的序列的相似性達(dá)到99%?；?6S rDNA序列分析結(jié)果，選擇已報(bào)道的腸桿菌屬8個(gè)種的8個(gè)菌株與本研究的2株病原菌進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，圖3結(jié)果表明： PB0102與Enterobactercloacae(KP165015.1)聚成一簇； PS0202與Enterobacterasburiae(JF772078.1)聚成一簇；兩者都與腸桿菌屬內(nèi)的其他種存在顯著的遺傳距離。結(jié)合2株病原菌的形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀及生理生化鑒定結(jié)果,將PB0102鑒定為Enterobactercloacae,將PS0202鑒定為Enterobacterasburiae。

表1 百色?？菸【纳砩瘻y(cè)試結(jié)果

注:“+”表示為陽(yáng)性;“-”表示為陰性;“±”表示邊界值,不能準(zhǔn)確判斷;“ND”表示無(wú)可用數(shù)據(jù)。

M:1 kb Maker;泳道1:PB0102;泳道2:PS0202。圖2 百色?？菸【?6S rDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

3 結(jié)論與討論

由于腸桿菌種屬間常出現(xiàn)交叉聚類現(xiàn)象,使菌株間的遺傳距離較近,僅利用16S rDNA進(jìn)行分子鑒定,往往不能鑒定到種[8]。因此病原菌鑒定必須以傳統(tǒng)生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ),再以分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。在本研究中，PB0102和PS0202的12項(xiàng)生理生化指標(biāo)鑒定結(jié)果分別與Enterobactercloacae和Enterobacterasburiae的完全一致。再根據(jù)分離菌的致病性測(cè)定、培養(yǎng)性狀觀察、16S rDNA分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析,確定PB0102和PS0202分別為Enterobactercloacae和Enterobacterasburiae。

目前我國(guó)已報(bào)道能引起?？菸〉牟≡心c桿菌屬(Enterobacter)、克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)和泛菌屬(Pantoea)的多個(gè)種[9-12],而廣西已分離到Enterobactercloacae、Enterobacterasburise、Enterobactermori、Klebsiellaoxytoca，以及未確定種Klebsiellasp.和Enterobactersp.共6種病原菌[2,13]。本研究從百色桑園分離到的病原菌確定為Enterobactercloacae和Enterobacterasburiae。這是?？菸≡诎偕@的首次報(bào)道,表明?？菸∫延蓮V西中東部向西北部蔓延。這可能是由于近年來(lái)百色大力發(fā)展蠶業(yè),大量引進(jìn)新品種,調(diào)運(yùn)苗木而導(dǎo)致廣西其他縣(市)的病原隨之傳入。為了防止該病繼續(xù)擴(kuò)展蔓延,今后在發(fā)展桑蠶生產(chǎn)時(shí),應(yīng)加強(qiáng)該病的檢驗(yàn)檢疫力度,嚴(yán)格進(jìn)行產(chǎn)地檢疫,并遵守“自留、自繁、自育、自用”的原則,避免從病區(qū)調(diào)運(yùn)桑樹(shù)苗木[14];同時(shí),應(yīng)建立全面的快速檢測(cè)體系,從源頭上遏制該病原菌的進(jìn)一步傳播。目前朱勃(2010)、Lou M M(2011)和姜星(2012)等已報(bào)道了Enterobactermori和Enterobacterspp.的快速分子檢測(cè)體系,且都表現(xiàn)出良好的靈敏性[15-17]；但由于桑枯萎病菌具有病原多樣化特征,因此檢測(cè)體系還應(yīng)包括已報(bào)道的其他病原種類。

化學(xué)藥劑是防治植物病害最直接最有效的方法。蒙姣榮(2015)等對(duì)廣西分離到的6種?？菸【M(jìn)行平板抑菌試驗(yàn),結(jié)果表明,中生菌素、氫氧化銅、春雷·王銅、農(nóng)用鏈霉素和嗅菌腈等對(duì)這6種病原菌均有一定的抑菌效果,且對(duì)家蠶的毒性均表現(xiàn)為低毒,但同一藥劑對(duì)不同病原菌的抑菌效果存在明顯差異[18]。今后,應(yīng)繼續(xù)篩選或研制對(duì)?？菸【幸种谱饔玫幕瘜W(xué)藥劑,并進(jìn)行田間小區(qū)試驗(yàn)以明確其在田間的實(shí)際防治效果。

圖3 百色桑枯萎病菌16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

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(責(zé)任編輯:黃榮華)

Isolation and Identification of Pathogens Causing Mulberry Wilt Disease in Baise of Guangxi

OUYANG Qiu-fei, HUANG Jiao-li, NONG Yan-feng, LI Rong-feng,MA Bo, YANG Rui-hu, FAN Hong-ling

(Baise University, Baise 533000, China)

Through the method of tissue isolation, two pathogenic bacterial strains PB0102 and PS0202 were isolated from the stem of wilted mulberry plants in Longlin county, Baise city. By pathogenicity test, cultivation trait observation, common physiological and biochemical test, 16S rDNA sequence determination and phylogenetic analysis of the isolated pathogens, PB0102 and PS0202 were identified asEnterobactercloacaeandEnterobacterasburiae, respectively.

Baise city; Mulberry wilt disease; Pathogen; Isolation; Identification

2017-02-20

百色學(xué)院一般科研項(xiàng)目(2014KB04);廣西中青年教師能力提升項(xiàng)目(KY2016YB416);廣西高等學(xué)校優(yōu)勢(shì)特色專業(yè)群建 設(shè)項(xiàng)目[桂教高教(2015)41號(hào)66];百色學(xué)院特色研究團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目[百院字(2015)148號(hào)]。

歐陽(yáng)秋飛(1988─),女,廣西百色人,講師,碩士研究生,主要從事作物栽培及植物病害防治研究。

S888.711

A

1001-8581(2017)07-0071-04